Büyüme Eğrileri: Koloni Oluşturan Birimler ve Optik Yoğunluk Ölçümleri Kullanılarak Büyüme Eğrileri Oluşturma

Bakteriler, hücre bölünmesi adı verilen bir süreçle çoğalırlar ve bu da iki özdeş yavru hücre ile sonuçlanır. Büyüme koşulları uygunsa, bakteri popülasyonları katlanarak büyüyecektir.

Bakteri büyüme eğrileri, bir kültürdeki bakteri miktarını zamanın bir fonksiyonu olarak çizer. Tipik bir büyüme eğrisi dört aşamadan geçer: gecikme fazı, üstel faz, durağan faz ve ölüm fazı. Gecikme aşaması, bakterilerin hızla büyüyüp bölünebilecekleri bir duruma ulaşmaları için geçen süredir. Bundan sonra, bakteriler hızlı hücre büyümesi ve bölünmesi ile karakterize edilen üstel faza geçer. Bu aşamada bakteri kültürünün üstel büyüme hızı, bakterilerin belirli koşullar altında üreyebileceği en hızlı oran olan iki katına çıkma süresi olarak ifade edilebilir. Daha sonra, bakteriyel hücre büyümesinin platolarının ve çevresel besin tükenmesi nedeniyle büyüme ve ölüm oranlarının eşitlendiği durağan aşama gelir. Son olarak, bakteriler ölüm aşamasına girer. Bakteri büyümesinin keskin bir şekilde azaldığı ve şiddetli besin tükenmesinin hücrelerin parçalanmasına yol açtığı yer burasıdır.

Bir kültürde bulunan bakteri miktarını ölçmek ve bir büyüme eğrisi çizmek için iki teknik kullanılabilir. Bunlardan ilki, koloni oluşturan birimler veya CFU'lar aracılığıyladır. CFU'ları elde etmek için, düzenli zaman noktalarında bir ila on dizi dokuz seyreltme gerçekleştirilir. Bu seyreltmelerden ilki, bu örnekte negatif olanı, 9 mL PBS ve 1 mL bakteri kültürü içerir. 1:10 seyreltme faktörü ile sonuçlanır. Daha sonra, bu çözeltinin 1 mL'si bir sonraki tüpe, negatif ikisine aktarılır ve 1:100'lük bir seyreltme faktörü elde edilir. Bu işlem, son tüp olan negatif dokuz boyunca devam eder ve 1:1 milyarlık bir nihai seyreltme faktörü ile sonuçlanır. Bundan sonra, her seyreltmenin 100 mikrolitresi kaplanır. Plakalar daha sonra inkübe edilir ve klonal koloniler sayılır. 30 ila 300 koloni arasında büyüyen belirli bir zaman noktası için seyreltme plakası, o zaman noktası için mililitre başına CFU'ları hesaplamak için kullanılır.

Bakteri konsantrasyonunu ölçmenin ikinci yaygın yöntemi optik yoğunluktur. Bir kültürün optik yoğunluğu, bir spektrofotometre ile boş bir ortam ile ilişkili olarak anında ölçülebilir. Tipik olarak, hücre yoğunluğu arttıkça artan bu ölçümler için OD600 olarak da adlandırılan 600 nanometrelik bir dalga boyu kullanılır. Optik yoğunluk CFU'lardan daha az hassas olsa da, anında elde edilebildiği ve nispeten az reaktif gerektirdiği için uygundur. Her iki teknik de bir kültürün bakteri hücre sayısına daha doğru bir şekilde yaklaşan standart bir eğri oluşturmak için birlikte kullanılabilir. Bu videoda, E. coli'nin zamanlanmış seri dilüsyonlarından CFU ve OD600 ölçümlerinin nasıl elde edileceğini öğreneceksiniz. Daha sonra, sırasıyla CFU ve OD600 ölçümlerini kullanan iki büyüme eğrisi, standart bir eğri ile ilişkilendirilmeden önce çizilecektir.

Bakterilerle çalışırken, laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanların kullanılması ve uygun aseptik tekniğin gözlemlenmesi önemlidir.

Bundan sonra, iş istasyonunu %70 etanol ile sterilize edin. İlk olarak, LB suyunu ve LB katı agar ortamını ayrı otoklavlanabilir şişelerde hazırlayın. Şişelerin kapaklarını kısmen kapattıktan sonra, ortamı 35 dakika boyunca 121 santigrat dereceye ayarlanmış bir otoklavda sterilize edin. Ardından, agar ortamının 30 dakika boyunca 50 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda soğumasına izin verin. Soğuduktan sonra, her bir Petri kabına 20 ila 25 mL dökün. Bundan sonra, plakaların oda sıcaklığında 24 saat sertleşmesine izin verin.

Daha sonra sıvı bir bakteri kültürü üretmek için kullanılacak olan tek koloni izolatlarını hazırlamak için, LB agar üzerinde izolasyon için E. coli'yi çizgi haline getirmek için önceden dondurulmuş stok ve uygun çizgi kaplama tekniğini kullanın. Çanağı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, çizgili plakadan tek bir koloni seçmeden önce agar üzerinde alevle sterilize edilmiş bir aşılama halkasını soğutun. 15 mL'lik bir test tüpüne 4 mL sıvı ortam aşılayın. Ardından, E. coli'yi 210 rpm'de çalkalayarak gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün.

Büyüme eğrisinde kullanılacak 1:1000 hacimdeki bakteri kültürünü kurmak için önce otoklavlanmış 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesi edinin. Ardından, 100 mL steril ortamı şişeye aktarmak için 50 mL'lik bir serolojik pipet kullanın. Daha sonra, dokuz adet 15 ml'lik test tüpünü art arda bir ila dokuz olarak etiketleyin. Bu sayılar, koloni oluşturan birimi veya CFU'yu hesaplamak için kullanılacak seyreltme faktörüne karşılık gelir. Ardından, her tüpe 9 mL 1X PBS ekleyin. Bundan sonra, hazırlanan agar plakalarını, yetiştirilecek olan ilgili zaman noktaları ve seyreltme faktörleri ile etiketleyin. E. coli ile bu örnekte, başlangıç zaman noktasından sonra, zaman noktaları saatte bir alınır. Önceden hazırlanmış gece boyunca sıvı E. coli kültürünü kullanarak, ortamı otoklav 500 mL Erlenmeyer şişesinde 1:1000 hacim kültür ile aşılayın. Bakterileri eşit şekilde dağıtmak için ortamı döndürün.

Bir spektrofotometreyi boşalttıktan sonra, küveti tüy bırakmayan bir bezle temizleyin. Daha sonra, kültürün 1 mL'sini küvete dağıtın ve kültürün sıfır zaman noktasındaki optik yoğunluğunu elde etmek için spektrofotometreye yerleştirin. Ardından, E. coli'yi 210 rpm'de çalkalayarak 37 santigrat derecede büyütün. Sıfır zaman noktasından sonraki her zaman noktasında, şişeden 1 mL daha bakteri kültürü çekin ve optik yoğunluk ölçümünü tekrarlayın. Optik yoğunluk okuması 1.0'dan büyükse, 100 mikrolitre bakteri kültürünü 900 mikrolitre taze ortamla seyreltin ve ardından optik yoğunluğu bir kez daha ölçün. OD 600 ölçümü için bu değer 10 ile çarpılabilir.

Her bir zaman noktası için koloni oluşturan birim ölçümünü elde etmek için, her zaman noktasında şişeden 1 mL daha bakteri kültürü çekin. Bakteri kültürünü negatif olan test tüpüne dağıtın ve karıştırmak için girdap yapın. Ardından, önce negatif bir tüpten 1 mL'yi negatif iki tüpe aktararak ve karıştırmak için girdap yaparak seyreltme serisini gerçekleştirin. Negatif iki tüpten 1 mL'yi negatif üç tüpe aktarın ve karıştırmak için girdaplayın. Bu seri transfere tüm seyreltme tüplerinden negatif dokuz tüpe devam edin. Her seyreltme için uygun şekilde etiketlenmiş plakaya 100 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın. Her seyreltme için, bir hücre yayıcıyı etanol içinde sterilize edin, bir Bunsen brülör alevinden geçirin ve agarın yüzeyine aşılamadan uzağa dokunarak soğutun. Ardından, agar plakasının yüzeyi kuruyana kadar hücre süspansiyonunu yaymak için hücre yayıcıyı kullanın. Plakaları 37 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin. Görünür koloniler ortaya çıktığında, her plakadaki bakteri kolonilerinin sayısını sayın. Her bir zaman noktasında her bir plaka için bu değerleri ve bunlarla ilişkili seyreltme faktörlerini kaydedin.

Bir OD 600 büyüme eğrisi oluşturmak için, tüm veri noktalarının bir tabloya doğru girildiğinden emin olduktan sonra, tüm zaman noktalarını ve bunlara karşılık gelen verileri seçin. Bir koloni oluşturan birim büyüme eğrisi grafiği oluşturmak için, koloni sayımlarının her zaman noktası için 30 ila 300 bakteri aralığına düştüğü seyreltme plakasını seçin. Koloni sayım sayısını seyreltme faktörü ile ve ardından on ile çarpın. Bunun nedeni, 100 mikrolitrelik yayılmanın, mililitre başına koloni oluşturan birimler hesaplanırken ek bir 1:10 seyreltme olarak kabul edilmesidir. Bundan sonra, koloni oluşturan birimleri zamana karşı yarı log ölçeğinde çizin.

Sırasıyla OD 600 ve CFU ölçümleri ile üretilen bu grafikler, E. coli büyüme kinetiği hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Optik yoğunluk ve koloni oluşturan birimler ilişkilendirilebilir, böylece mililitre başına CFU'lar OD 600 ölçümlerinden tahmin edilebilir, bu da gelecekteki deneylerde zamandan ve malzemeden tasarruf sağlar.

Bunu yapmak için, koloni oluşturan birimleri, 1'e eşit veya daha küçük OD 600 okumaları için doğrusal bir ölçekte optik yoğunluğa karşı çizin. 0. Bundan sonra, Y = MX + B biçiminde, M'nin eğim ve B'nin y-kesişim noktası olduğu doğrusal bir regresyon eğilim çizgisi oluşturun. Veri noktalarına sağ tıklayın ve trend çizgisi ve doğrusal ekle'yi seçin. Ardından, denklemi grafikte görüntülemek için kutuyu işaretleyin ve grafikte R kare değerini görüntüleyin. R kare değeri, verilerin takılan regresyon çizgisiyle ne kadar yakından eşleştiğinin istatistiksel ölçümüdür. Bu örnekte, ilk 6 zaman noktası, x ekseninde OD 600 ve y ekseninde mililitre başına CFU'lar ile çizilir. Aynı büyüme koşullarına sahip gelecekteki deneylerde, bu eğim ve y-kesişim değerleri, OD 600 okumalarından CFU'ları tahmin etmek için bu denkleme eklenebilir. Ardından, koloni oluşturan birim büyüme eğrisi grafiğine bakın. Üstel aşama sırasında, aralarında en dik eğim olan iki zaman noktasını belirleyin. İkiye katlama süresini hesaplamak için önce seçilen zaman noktaları arasındaki zaman değişimini hesaplayın. Ardından, burada gösterilen denklemi kullanarak nesillerdeki değişimi hesaplayın. Burada, küçük harf b, üçüncü zaman noktasındaki bakteri sayısıdır ve büyük harf B, ikinci zaman noktasındaki bakteri sayısıdır. Son olarak, zamandaki değişimi nesillerdeki değişime bölün. Bu örnekte, ikiye katlama süresi 0'dır. 26 saat veya 15 dakika 19 saniye. Farklı deneysel tedavilerde iki katına çıkma sürelerini karşılaştırmak, belirli bir bakteri türü için en iyi büyüme koşullarını belirlememizi sağlar. Bu nedenle, en düşük ikiye katlama süresine sahip tedavi, test edilen koşullar arasında en optimal olacaktır.