What is the minimum inhibitory concentration (MIC) and how is it determined?

The minimum inhibitory concentration (MIC) is the lowest antibiotic concentration at which bacteria can no longer survive or multiply. It is determined by observing where bacterial growth stops in response to increasing antibiotic concentrations. In an E-test, the MIC value is read at the point where the growth inhibition zone intersects the antibiotic strip. In broth dilution methods, MIC is identified as the lowest antibiotic concentration showing no visible bacterial growth or turbidity.

How does the Epsilometer test (E-test) measure antibiotic susceptibility?

The E-test uses a plastic strip impregnated with a predefined gradient of antibiotic applied to a Mueller-Hinton agar plate inoculated with bacteria. The antibiotic diffuses into the agar, and susceptible bacteria cannot multiply, forming a clear growth inhibition zone around the strip. The MIC value is determined by reading the numerical scale on the strip at the point where bacterial growth intersects the strip edge.

What is antibiotic synergy and how is it evaluated?

Antibiotic synergy occurs when the combined effect of two antibiotics is greater than the sum of their individual activities. Synergy is evaluated by calculating the fractional inhibitory concentration (FIC) index, which sums the ratio of each antibiotic's MIC in combination to its individual MIC. An FIC index less than 0.5 indicates significant synergy between the two antibiotics.

What is the difference between cross and non-cross E-test methods for synergy testing?

In the non-cross test, E-strips are applied sequentially to the same plate location after the first strip is removed, requiring two plates and more time. In the cross test, both E-strips are placed simultaneously at a 90-degree angle on a single plate, making it faster and requiring fewer materials. Both methods determine MIC values in combination and calculate the FIC index to assess synergy.

How does the broth micro dilution method determine MIC values?

The broth micro dilution method creates two-fold serial antibiotic dilutions in a 96-well microtiter plate containing bacteria in growth medium. After incubation, the MIC is identified as the well with the lowest antibiotic concentration showing no visible bacterial growth or turbidity. This quantitative method offers flexibility in choosing specific antibiotic concentrations and can be applied to multiple bacterial species.

Why is preparing a standardized bacterial suspension important for antibiotic susceptibility testing?

A standardized bacterial suspension ensures consistent and comparable results across tests. The suspension is prepared by matching its turbidity to a McFarland 0.5 standard, which establishes a uniform bacterial concentration. This standardization is critical because varying bacterial concentrations would produce inconsistent growth inhibition zones and unreliable MIC values.

What does an FIC index greater than 0.5 indicate about antibiotic combinations?

An FIC index greater than 0.5 indicates that the two antibiotics do not act synergistically against the tested bacterial strain. Instead, their combined effect is either additive, meaning the joint effect equals the sum of individual activities, or potentially antagonistic. This result suggests that combination therapy may not provide enhanced efficacy compared to single antibiotic treatment.

Antibiyotik Duyarlılık Testi: İki antibiyotiğin MİK değerlerini belirlemek ve antibiyotik sinerjisini değerlendirmek için epsilometre testleri

0 görüntüleme13:39 dk

1. Epsilometre testleri (E-testleri)

Kurulum
1. Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin
2. Çalışma alanını p etanol kullanarak sterilize ederek hazırlayın
3. Mueller-Hinton agar plakalarını (MHA plakaları) toplayın
McFarland bulanıklık standardı No. 0.5'in hazırlanması
1. % 1'lik bir baryum klorür (BaCl₂) çözeltisi hazırlayın:
  100 mL damıtılmış suya 1 gram susuz baryum klorür (BaCl₂) ekleyin. İyi girdap.
2. % 1'lik bir sülfürik asit çözeltisi hazırlayın (H₂_S04):
  99 mL damıtılmış suya 1 mL konsantre H₂_S04 ekleyin. İyi girdap.
3. Bir McFarland bulanıklık standardı No. 0.5:
  hazırlayın 5 mL% 1 H_{2 S04}çözeltisi içinde 50 μL BaCl 2_çözeltisi. Bulanık bir süspansiyon elde etmek için çözeltiyi iyice girdaplayın.
4. McFarland bulanıklık standardı No. 0.5'i folyo kaplı bir tüpte tutun. 25°C'de en fazla 6 ay saklayın. Kullanmadan önce homojen bir çözeltiye iyice girdaplayın.
MHA plakalarının hazırlanması
1. Steril bir halka kullanarak Streptococcus grup G bakterilerini kan agar plakasından kazıyın. 1 mL tuzlu suya karıştırın ve bakteri süspansiyonuna girdap yapın.
2. Deneyler sırasında aynı aşı boyutuna sahip olmak için aynı bulanıklığı elde etmek için süspansiyonu bir McFarland standardı No. 0.5 ile karşılaştırın. Ek tuzlu su veya bakteri kullanarak konsantrasyonu ayarlayın.
3. Steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak MHA plakalarını aşılayın. Yüzeyi kaplamak için plakayı nazikçe sürün. Aşağıda açıklanan üç yöntemden biriyle devam edin (1.4-1.6).
Tek antibiyotik direnç testi. Streptokok grup G, penisilin G veya gentamisine direnç
1. MHA plakasının ortasına bir E-test şeridi (penisilin G veya gentamisin) yerleştirin (Şekil 1 A,B).
2. 18-20 saat, 37°C'de inkübe edin.
3. Sonuçları okuyun. MIC, dereceli antibiyotik test şeridini (Şekil 1 C,D) kesiştiren inhibisyon bölgesi olarak ölçülür.

Şekil 1: Tek E-test. A) penisilin G ve B) gentamisin içeren bir E-test şeridinin, 37 ° C'de gece boyunca inkübasyondan önce (A ve B) ve sonra (C ve D) (C ve D) bir grup G streptokoklarının bakteri kolonileri ile kaplı bir Mueller Hinton agar plakasına yerleştirilmesi% 5 CO₂. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sinerji testi, çapraz yaklaşım. Streptokok grubu G, penisilin G ve gentamisine direnç.
1. Farklı antibiyotikler içeren iki E-test şeridi yerleştirin (ör. penisilin G ve gentamisin) aşılanmış MHA plakasına çapraz bir şekilde yerleştirin.
  1. En doğru sonuçlar için, daha önce tek bir antibiyotik direnç testinde belirlenen MIC değerlerinde ölçekler arasındaki kesişme noktasında yaklaşık 90°'lik bir açıyla haçı yerleştirmeyi hedefleyin (Şekil 2 A).
  2. Şeritler agar plakasına yerleştirildikten sonra, bazı antibiyotikler plaka tarafından zaten emilmiş olabileceğinden, hareket ettirilmemeleri gerektiğini unutmayın. Bu nedenle, şeritleri biraz yanlış bir açıda (örn. 85°) ve gerçek MIC değerinden 1-2 mm'ye kadar tutmak daha uygundur. Bu sorunu azaltmak için denemeyi üç nüsha halinde çalıştırmanız önerilir.
2. 18-20 saat, 37°C'de inkübe edin.
3. Sonuçları okuyun. MIC, her bir ilgili E-test şeridinde dereceli antibiyotik test şeridini kesen inhibisyon bölgesi olarak ölçülür (Şekil 2 B).
4. Sinerjiyi belirlemek için fraksiyonel inhibitör konsantrasyon (FIC) (Denklem 1) formülünü kullanın.

Şekil 2: Sinerjizm tespiti - çapraz test. Penisilin G ve gentamisinin MIC'inin Streptococcus grup G'de (A) ve (B) inkübasyonundan önce ve sonra gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO_2'de antimikrobiyal sinerji testinin sonuçları. İki ayrı MIC değeri arasında 90°'lik bir açı oluşur (penisilin G: 0.094 μg/mL, gentamisin: 8 μg/mL). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sinerji testi, çapraz olmayan yaklaşım. Streptokok grubu G, penisilin G ve gentamisine direnç.
1. E-test şeridini MHA plakasının ortasına yerleştirin (Şekil 3 A,D).
2. Her şeritte önceden belirlenen MIC değerinin nerede olduğunu işaretleyin.
3. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
4. Her MHA plakası için E-test şeridini atın (Şekil 3 B,E).
5. İkinci E-test şeridini (farklı bir antibiyotik içeren) sırasıyla daha önce çıkarılan şeridin alanına, MIC değerleri işarete karşılık gelecek ve hizalanacak şekilde yerleştirin.
6. 18-20 saat, 37°C'de inkübe edin.
7. Sonuçları okuyun. MIC, her bir E-test şeridinde dereceli antibiyotik test şeridini kesen inhibisyon bölgesi olarak ölçülür (Şekil 3 C,F).
8. Sinerjiyi belirlemek için, fraksiyonel inhibitör konsantrasyon (FIC) formülü kullanılır (Denklem 1).

Şekil 3: Sinerjizm tespiti - çapraz olmayan test. Streptococcus grubu G'de penisilin G ve gentamisinin MİK antimikrobiyal sinerji testinin sonuçları. A) Streptococcus grubu G bakterilerinin üzerinde gentamisin şeridi (8 μg/mL merkezli), B) Gentamisin şeridinin çıkarılması, C) Streptococcus grubu G bakterilerinin üzerine kombine gentamisin / penisilin G şeridi (0.094 μg/mL merkezli), D) Penisilin G şeridi (0.094 μg/mL merkezli), E) Penisilin G şeridinin çıkarılması, F) Streptococcus grubu G bakterilerinin üzerine kombine penisilin G / gentamisin şeridi (8 μg/mL merkezli). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Et suyu testi

Kurulum
1. Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin
2. Çalışma alanını p etanol kullanarak sterilize ederek hazırlayın
3. % 50 parçalanmış at kanı ve 20 mg / mL β-NAD (MH-F) içeren 15 mL MH suyu toplayın
(İsteğe bağlı) Katı ortamda MIC'yi belirlemek için bir E-test [Protokol 1] gerçekleştirin
1. İsteğe bağlı olsa da, bu tür bir bilgi daha iyi deneysel tasarıma izin verecektir (örneğin, eklenen antibiyotik konsantrasyonları, plakadan belirlenen MIC değerini çevreleyecek şekilde tasarlanabilir), bu da başarılı bir deney şansını artırır.
Bakteriyel bir aşı hazırlamak. Yukarıda belirtildiği gibi, bakteri konsantrasyonu OD nm ölçümleri veya McFarland bulanıklık standartları ile tahmin edilebilir
1. OD600 nm Yöntemi
  1. Belirlenmiş bir bakteri konsantrasyonuna sahip bir bakteri süspansiyonu elde edin
  2. 0.003'lük bir OD600 elde etmek için kültürü MH-F suyunda seyreltin
2. McFarland bulanıklık yöntemi
  1. 15 mL MH-F suyunu steril bir tüpe koyun.
  2. MH-F suyunu bakterilerle (bir tabaktan) McFarland seviyesine kadar aşılayın. Çözeltiyi kuvvetlice girdaplayın. Çözeltiyi steril bir Petri kabına dökün.
Antibiyotik hazırlamak
1. İstenen antibiyotik konsantrasyonunu belirleyin
  1. E-testinden MIC değerini tanımlayın (ör. penisilin G için 0.125 μg/mL ve gentamisin için 8 μg/mL)
  2. Agar plakası MIC değerini, dört-yedi 2x seri seyreltmeye karşılık gelen 2^4-2 ⁷ ile çarpın. Bu, antibiyotiklerin başlangıç konsantrasyonu olacaktır. (ör. penisilin G için, yedi adet 2x seri dilüsyon: 0.125 μg/mL x 2⁷ = 16 μg/mL; gentamisin için, dört adet 2x seri dilüsyon 8 μg/mL x 2⁴ = 128 μg/mL
  3. Antibiyotiklerin stok konsantrasyonunu belirlemek için istenen başlangıç değerini 100x ile çarpın (örn. 1.6 mg / mL penisilin G ve 12.8 mg / mL gentamisin stokları)
2. Buna göre 100x antibiyotik stok konsantrasyonu hazırlayın
  1. Antibiyotikleri 10 mL otoklavlanmış suda çözün ve bir stok çözeltisi oluşturmak için girdap yapın (ör. yukarıdaki stokları oluşturmak için 16 mg penisilin G ve 128 mg gentamisin)
Mikroplaka kuyucuklarına bakteri ekleyin
1. Aliquot 200 μl MH-F suyu, üç parçalı bir deney için 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının ilk 3 sırasındaki kuyucuklara bakteri aşısı.
Mikroplaka kuyucuklarına antibiyotik ekleyin
1. Toplam hacmi 400 μL'ye getirmek için kuyucukların ilk sütununa (A1, B1, C1) 200 μL ekstra MH-F suyu ekleyin.
2. İlk kuyucuk sütununa 4 μL antibiyotik stok konsantrasyonu ekleyin. Numune 400 μL içerdiğinden, antibiyotiklerin 100 kat seyreltilmesine neden olacaktır.
3. 200 μL bakteri/antibiyotiği A1'den A2'ye, A11'e kadar aktararak 2x seri seyreltme oluşturun. Seyreltmeler arasında kuvvetlice pipetleyin. Ek satırlar için adımı yineleyin.
4. Sütun 11'den 200 μL çıkarın, böylece tüm kuyucuklardaki nihai hacim 200 μL olur.
5. Son sütunu (A12, B12, C12) kontrol olarak antibiyotiksiz bırakın.
MIC değerlerini belirleyin
1. 96 oyuklu mikrotitre plakasını çalkalamadan 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
2. MIC değeri, seyreltme serisinde görünür bakteri büyümesi göstermeyen son kuyucuk olarak tanımlanır (Şekil 4). Bununla birlikte, bu değere yalnızca orijinal aşı boyutunun doğru olması durumunda güvenilebilir.

Şekil 4: Et suyu seyreltmesi ile MIC tayini. MIC burada, bulanıklığı değiştirmeden önce berraklık (bakteri üremesi olmayan) sergileyen son kuyu olarak tanımlanır. Satır, penisilin G'nin MIC değerinin kopyalarıdır ve satır, gentamisinin MIC değerinin kopyalarıdır, her ikisi de Streptococcus grubu G'nin bir izolatına karşıdır. A) gerçek deneysel sonuç, B) A'dan alınan değerlerin şematik yorumu (gri = büyüme yok; beyaz = büyüme). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Orijinal bakteri konsantrasyonunu saymak için seyreltme serisinin şematik prosedürü. Seyreltmeler tarif edildiği gibi gerçekleştirildi (10x seyreltme serisi için 180 μL'de seyreltilmiş 20 μL) ve daha sonra AH sıralarından 10 μL, belirtildiği gibi iki ayrı kan agar plakası üzerine kaplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Orijinal aşı boyutunu belirleyin
not: Mikrobroth tahlilleri, kullanılan orijinal aşı boyutu için oldukça hassastır. Aşırı bir aşı boyutu yanlış pozitif sonuç verecektir, çünkü eklenen antibiyotikler bu oranda büyümeyi daha fazla engelleyemeyecektir. Bu nedenle, mikro kuyulara ne kadar bakteri eklendiğini doğrulamak çok önemlidir. Veriler deney noktasında mevcut olmayacak olsa da (24 saatlik inkübasyon ihtiyacı nedeniyle) bir kontrol görevi görecektir. Eklenen bakteri sayısı belirtilen konsantrasyon aralığındaysa, MIC değerlerine güvenilebilir. Aşı çok yüksek veya çok düşükse, deneyin tekrarlanması gerekir.
1. Bakterileri seri olarak seyreltin
  1. İnokulum boyutunu belirlemek için orijinal bakteri konsantrasyonunu seyreltmek için 96 oyuklu bir mikrotitre plakası hazırlayın. Optimum, 10^5-6 bakteri ile 200 μL'lik bir hacimdir. Seyreltmeleri gerçekleştirmek için, önce BH'deki her bir oyuğa 180 μL steril PBS alikot edin (üç kopya 1-3 halinde).
  2. Daha sonra, A'ya 100 μl bakteri çözeltisi ekleyin (üçlü 1-3 halinde).
  3. 20 μl bakteriyi A'dan B'ye kuvvetlice pipetleyerek 10x seri seyreltme (üç kopya halinde) oluşturun. CH için adımları tekrarlayın.
2. İnokulum boyutunun belirlenmesi için bakteri dilüsyonlarını plakalayın
  1. Kanlı agar plakalarını Şekil 5'e göre işaretleyin.
  2. Seri seyreltmeden 10 μL'yi Şekil 5'e göre plakaya aktarın.
  3. Plakayı 37°C'de 20-24 saat inkübe edin.
3. Bakteriyel aşı boyutunu belirleyin
  1. 5-50 koloni içindeki noktalardaki bakteri sayılarını sayın (Şekil 6).
  2. Üçlü numunelerin ortalamasını hesaplayarak ilk aşılama boyutunu hesaplayın, seyreltme faktörü ile çarpın (örn. B numuneleri için 10x, C numuneleri için 100x, D numuneleri için 1000x, vb.) ve ardından 10 μL'lik lekelenme hacmini telafi etmek için 100 ile çarpın, bu da cfu/mL cinsinden inokülum boyutu ile sonuçlanır. Aşı 10^5-6 cfu / mL içindeyse, MIC verilerine güvenilebilir.

Şekil 6: İnokulum boyutunun belirlenmesi. Şekil 5'e göre aşılanan bakteriler 37 ° C'de 20-24 saat inkübe edildi ve daha sonra sayıldı. D satırında sayılacak çok sayıda koloni vardır (örneğin 5-50). A'daki numuneler seyreltilmemiştir, B 10 kat seyreltilir, C 100 kat seyreltilir ve D 1000 kez seyreltilir ve her noktada sadece 10 μL kaplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.