Plak Testi: Plak Oluşturan Birimler (PFU) Olarak Viral Titreyi Belirlemek İçin Bir Yöntem

1. Kurulum

1. Mikrop içeren herhangi bir çalışmaya başlamadan önce, çalışma alanının sterilize edildiğinden emin olun (örn. p etanol ile silinmiş). Daima bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin, uzun saçları arkada bağlayın ve yaraların özellikle iyi korunduğundan emin olun.
2. Bittiğinde, tüm yüzeyleri sterilize edin ve ellerinizi ve bilekleri iyice yıkayın/sterilize edin.

2. Protokol

1. LB Medya hazırlama
   not: Konak bakteri suşuna ve bakteriyofaja bağlı olarak, konakçı bakteri suşunun ilk kültürü için farklı bir sıvı ortam daha uygun olabilir veya sonraki büyüme için farklı bir katı ortam daha uygun olabilir. Bu protokolde et suyu ve agar için lizojeni et suyu (LB) kullanılır.
   1. 4 g LB'yi 200 mL damıtılmış suda, LB suyu, katı alt agar ve yumuşak üst agar için üç nütel halinde karıştırın. Tüm çözeltiler, otoklavlama sırasında taşmayı önlemek için son hacmin iki katını tutabilen kaplarda hazırlanmalıdır.
      not: Tahlili üç nüsha halinde yapıyorsanız, LB alt agar miktarının iki katını hazırlayın.
   2. Uygun şekilde NaOH veya HCl kullanarak üç çözeltinin de pH'ını 7.4'e ayarlayın.
   3. Katı agar için% 1.5'lik bir agar çözeltisi yapmak için alt agar şişesine 3 g agar gücü ekleyin
   4. Yumuşak agar için% 0.6'lık bir agar çözeltisi yapmak için üst agar şişesine 1.2 g agar gücü ekleyin.
   5. Solüsyonları sterilize etmek için şişeleri yarı sıkılmış kapaklarla 20 dakika boyunca 121°C'ye ayarlanmış bir otoklava yerleştirin. Kontaminasyonu önlemek için çalışma biter bitmez kapakları kapatın.
   6. LB ortamı yaklaşık 45-50 ° C'lik bir sıcaklığa ulaştığında, 2.25 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 200 mL LB çözeltilerinin üçüne de 450 μL steril 1 M CaCl₂ ekleyin.
   7. Katı agar ortamının 15 mL alikotlarını steril Petri kaplarına dökün (köpürmeyi önlemek için sallamaktan kaçının) ve agarın oda sıcaklığında birkaç saat veya gece boyunca katılaşmasına izin verin (Şekil 4A). Plakalar birkaç gün boyunca 4°C'de baş aşağı saklanabilir.
2. Konak hücrelerin kültürlenmesi
   1. Tahlilden bir gün önce, 10 mL LB et suyuna 10 μL E. coli kültürü ekleyin.
   2. Bakterileri 37 ° C'de, gece boyunca 160 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.
   3. Tahlil sabahı, 10 mL taze LB.
      'ye 0.5 mL gece kültürü ekleyin not: Tahlili üç nüsha halinde yapıyorsanız, bu kültürün iki katını hazırlayın.
   4. Bakteri kültürü log faz büyümesine gelene kadar çalkalanan bir inkübatörde 37 ° C'de 160 rpm'de inkübe edin. Bu, spektrofotometrik olarak 0.5-0.7'lik bir OD600 ile belirlenebilir.
   5. Bakteriler üst LB agar'a eklenene kadar kültürü oda sıcaklığında tutun.
3. Bakteriyofajın 10 kat seri seyreltilmesi
   1. 180μL LB suyu ekleyin a'nın ilk sırasındaki yedi oyuktan 96 oyuklu bir plakaya
      not: İstatistiksel güvenilirliğini artırmak için seyreltmenin üç kopya halinde yapılması önerilmektedir. Bunu yapmak için, plakanın ikinci ve üçüncü sıralarında bakteriyofajın ek seyreltmelerini hazırlayın.
   2. Homojenliği sağlamak için orijinal bakteriyofaj örneğini dikkatlice girdaplayın ve 20 μL'yi ilk oyuğa aktarın.
   3. Numuneyi pipetleyerek iyice karıştırın ve aşağı doğru karıştırın.
   4. Elde edilen süspansiyonun 20 μL'sini ikinci kuyucuğa aktarın.
   5. İkinci kuyucuktaki çözeltinin 20 μL'sini üçüncü kuyucuğa aktararak seri seyreltmeye devam edin ve altıncı kuyucuğa kadar devam edin, yedinci kuyuyu faj süspansiyonunun eklenmeyeceği negatif bir kontrol olarak bırakın. Bu, ^{10-1-10-6'lık} bir seyreltme aralığı oluşturacaktır.
4. Kaplama
   1. Petri kaplarının tabanını (daha önce adım 2.1.7'de hazırlanmıştı) isim, tarih ve kısa bir numune açıklaması (faj numunesi seyreltme faktörü dahil) ile etiketleyin. Petri kaplarını testten bir saat önce 37 ° C inkübatörde önceden ısıtın.
   2. Katılaşmış yumuşak agar-ortamı eritin (tipik olarak bir mikrodalga kullanılarak yapılır; katılaşmış agar 85 ° C'de erir) ve yaklaşık 45 ° C'ye gelmesine izin verin. Isıtılmış ortam, uygun bir sıcaklığa ulaşmak için ~ 1 saat boyunca 45 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirilebilir. Sıvı halde kalacak kadar sıcak, ancak eklenen bakterileri öldürmeyecek kadar soğuk olmalıdır.
   3. 4 mL bakteri kültürünü (adım 2.2'den itibaren) 35 mL LB yumuşak agar (45 ° C'de) ile karıştırın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için döndürün, ancak köpürmeyi önlemek için sallamaktan kaçının (Şekil 4A).
   4. Toplam 7 etiketli test tüpü için seri seyreltme adımlarının her biri için bir steril test tüpü ve kontrol numunesi için bir steril test tüpü etiketleyin. Adım 2.4.3'teki bakteri kültürü / yumuşak agar karışımının 5 mL alikotunu 7 tüpe yerleştirin. Adım 2.4.6'ya kadar hızlı bir şekilde çalışın, çünkü bu kadar küçük hacimlerde agar bazlı ortamlar oda sıcaklığında hızla katılaşacaktır.
   5. 100 μL kontrol numunesini (adım 2.3'ten itibaren) kontrol test tüpüne ekleyin ve dikkatlice döndürün. Kullanılmış pipet ucunu atın ve seri olarak seyreltilmiş bakteriyofaj örneklerinin her birinden (adım 2.3) aynı hacmi karıştırmak için döndürerek ilgili test tüplerine aktarın.
   6. 5 mL karışımları hemen etiketli, önceden ısıtılmış, katı agar plakalarına aktarın (Şekil 4A). Karışımları eşit şekilde yaymak için plakaları hafifçe döndürün.
      not: Testi üç nüsha halinde gerçekleştiriyorsanız, 2.4.3-6 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
   7. Her plakayı laboratuvar filmi ile kapatın ve her iki katmanın da oda sıcaklığında (yaklaşık 15 dakika) düzgün bir şekilde katılaşmasına izin verin, 37 ° C'lik bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin, hem bakterilerin hem de fajın büyümesini uyarın, 24 saat boyunca veya plaklar gelişene kadar, Plakların ortaya çıkması tipik olarak yaklaşık 1-5 gün sürer (Şekil 4B), ancak zamanlama kuluçka koşullarına, ortama ve bakteri türüne bağlı olarak önemli ölçüde değişir.

3. Veri Analizi ve Sonuçlar

1. Plakaları sayma
   1. Viral kontaminasyonu göstereceğinden, "kontrol" olarak işaretlenmiş plakalarda hiçbir plak görünmediğinden emin olun.
   2. En seyreltilmiş bakteriyofaj örneğini içeren ^10-6 etiketli plakalarla başlayın. Kapağı çıkarmadan plakları sayın, hangi plakların daha önce sayıldığını belirtmek için giderken bir kalemle işaretleyin.
   3. Kalan plakaları sayın. Bazı plaklarda sayılamayacak kadar az veya çok fazla plak olabilir. Daha fazla analiz için 10-150 plakalı plakaları kullanın.
2. PFU'nun hesaplanması
   1. 100 μL faj >. en seyreltilmiş numune için ^10-6). not: Testi üç kopya halinde yapıyorsanız, üç plakadan ortalama plak sayısını kullanın.
   2. Orijinal numunenin konsantrasyonunu (PFU/mL cinsinden) belirlemek için, yalnızca 100 μL numune kaplandığı için 10'luk ek bir seyreltme faktörü ile çarpın. (yani )
   3. Daha güvenilir bir sonuç elde etmek için 10 ila 150 plak içeren tüm seyreltmeler için PFU/mL'nin ortalama değerini hesaplayın.