What are bacteriophages and how do they infect bacterial cells?

Bacteriophages, or phages, are viruses that specifically infect bacteria. They attach to the bacterial cell wall and inject their genetic material into the host. The phage then hijacks the cell's biosynthetic machinery to replicate its DNA and produce numerous progeny phage particles, which are released by lysing and killing the host cell.

Why is the plaque assay considered a reliable method for determining viral titer?

The plaque assay remains one of the most reliable methods for determining viral titer because it directly visualizes the lytic activity of phages. Each plaque represents a single infective phage particle that has infected and lysed multiple neighboring bacterial cells, creating a clear, countable zone. This amplification of lytic activity enables accurate enumeration of phage particles in a sample.

What is the purpose of using bacteria in log-phase growth for the plaque assay?

Bacteria in log-phase growth are actively dividing and have the highest viability, ensuring that a large percentage of cells are capable of forming a dense, confluent lawn on the agar plate. This dense bacterial lawn is essential for the plaque assay because it provides abundant host cells for phage infection and allows clear visualization of plaques as transparent zones against the turbid bacterial background.

How does the double agar layer technique work in a plaque assay?

The double agar layer technique uses a solid, concentrated bottom agar layer and a soft, low-concentration top agar layer containing bacteria and phage. The soft overlay allows phage particles to move locally and infect neighboring cells while restricting their movement to distant areas. This creates localized zones of cell lysis, producing visible plaques that can be counted to determine phage concentration.

Why are serial dilutions necessary before performing a plaque assay?

Phage titers vary exponentially across different samples and types, so serial dilutions generate a wide range of phage concentrations to ensure countable plaque numbers. Performing dilutions in triplicate provides statistically significant and accurate data. An ideal plaque count ranges from 10 to 150 plaques per plate, making dilutions essential for obtaining reliable results.

What does PFU stand for and how is it calculated from plaque counts?

PFU stands for Plaque-Forming Units, representing the number of infective phage particles in a sample. To calculate PFU per milliliter, divide the mean plaque count by the dilution factor, then multiply by 10 to account for the additional dilution from using only 100 microliters of phage mixture during overlay preparation. The final average PFU per milliliter corresponds to the number of infective phage particles in the original sample.

How can the plaque assay be used beyond viral enumeration?

Beyond quantifying phage titer, the plaque assay can characterize plaque morphology to aid in identification of different phage types and isolate phage mutants. Additionally, the resistance or sensitivity of bacterial strains to specific phages can be used for phage typing, dividing bacterial species into subgroups based on their susceptibility to different bacteriophages.

Plak Testi: Plak Oluşturan Birimler (PFU) Olarak Viral Titreyi Belirlemek İçin Bir Yöntem

0 views13:00 min

1. Kurulum

Mikrop içeren herhangi bir çalışmaya başlamadan önce, çalışma alanının sterilize edildiğinden emin olun (örn. p etanol ile silinmiş). Daima bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin, uzun saçları arkada bağlayın ve yaraların özellikle iyi korunduğundan emin olun.
Bittiğinde, tüm yüzeyleri sterilize edin ve ellerinizi ve bilekleri iyice yıkayın/sterilize edin.

2. Protokol

LB Medya hazırlama
not: Konak bakteri suşuna ve bakteriyofaja bağlı olarak, konakçı bakteri suşunun ilk kültürü için farklı bir sıvı ortam daha uygun olabilir veya sonraki büyüme için farklı bir katı ortam daha uygun olabilir. Bu protokolde et suyu ve agar için lizojeni et suyu (LB) kullanılır.
1. 4 g LB'yi 200 mL damıtılmış suda, LB suyu, katı alt agar ve yumuşak üst agar için üç nütel halinde karıştırın. Tüm çözeltiler, otoklavlama sırasında taşmayı önlemek için son hacmin iki katını tutabilen kaplarda hazırlanmalıdır.
  not: Tahlili üç nüsha halinde yapıyorsanız, LB alt agar miktarının iki katını hazırlayın.
2. Uygun şekilde NaOH veya HCl kullanarak üç çözeltinin de pH'ını 7.4'e ayarlayın.
3. Katı agar için% 1.5'lik bir agar çözeltisi yapmak için alt agar şişesine 3 g agar gücü ekleyin
4. Yumuşak agar için% 0.6'lık bir agar çözeltisi yapmak için üst agar şişesine 1.2 g agar gücü ekleyin.
5. Solüsyonları sterilize etmek için şişeleri yarı sıkılmış kapaklarla 20 dakika boyunca 121°C'ye ayarlanmış bir otoklava yerleştirin. Kontaminasyonu önlemek için çalışma biter bitmez kapakları kapatın.
6. LB ortamı yaklaşık 45-50 ° C'lik bir sıcaklığa ulaştığında, 2.25 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 200 mL LB çözeltilerinin üçüne de 450 μL steril 1 M CaCl₂ ekleyin.
7. Katı agar ortamının 15 mL alikotlarını steril Petri kaplarına dökün (köpürmeyi önlemek için sallamaktan kaçının) ve agarın oda sıcaklığında birkaç saat veya gece boyunca katılaşmasına izin verin (Şekil 4A). Plakalar birkaç gün boyunca 4°C'de baş aşağı saklanabilir.
Konak hücrelerin kültürlenmesi
1. Tahlilden bir gün önce, 10 mL LB et suyuna 10 μL E. coli kültürü ekleyin.
2. Bakterileri 37 ° C'de, gece boyunca 160 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.
3. Tahlil sabahı, 10 mL taze LB.
  'ye 0.5 mL gece kültürü ekleyin not: Tahlili üç nüsha halinde yapıyorsanız, bu kültürün iki katını hazırlayın.
4. Bakteri kültürü log faz büyümesine gelene kadar çalkalanan bir inkübatörde 37 ° C'de 160 rpm'de inkübe edin. Bu, spektrofotometrik olarak 0.5-0.7'lik bir OD600 ile belirlenebilir.
5. Bakteriler üst LB agar'a eklenene kadar kültürü oda sıcaklığında tutun.
Bakteriyofajın 10 kat seri seyreltilmesi
1. 180μL LB suyu ekleyin a'nın ilk sırasındaki yedi oyuktan 96 oyuklu bir plakaya
  not: İstatistiksel güvenilirliğini artırmak için seyreltmenin üç kopya halinde yapılması önerilmektedir. Bunu yapmak için, plakanın ikinci ve üçüncü sıralarında bakteriyofajın ek seyreltmelerini hazırlayın.
2. Homojenliği sağlamak için orijinal bakteriyofaj örneğini dikkatlice girdaplayın ve 20 μL'yi ilk oyuğa aktarın.
3. Numuneyi pipetleyerek iyice karıştırın ve aşağı doğru karıştırın.
4. Elde edilen süspansiyonun 20 μL'sini ikinci kuyucuğa aktarın.
5. İkinci kuyucuktaki çözeltinin 20 μL'sini üçüncü kuyucuğa aktararak seri seyreltmeye devam edin ve altıncı kuyucuğa kadar devam edin, yedinci kuyuyu faj süspansiyonunun eklenmeyeceği negatif bir kontrol olarak bırakın. Bu, ^{10-1-10-6'lık} bir seyreltme aralığı oluşturacaktır.
Kaplama
1. Petri kaplarının tabanını (daha önce adım 2.1.7'de hazırlanmıştı) isim, tarih ve kısa bir numune açıklaması (faj numunesi seyreltme faktörü dahil) ile etiketleyin. Petri kaplarını testten bir saat önce 37 ° C inkübatörde önceden ısıtın.
2. Katılaşmış yumuşak agar-ortamı eritin (tipik olarak bir mikrodalga kullanılarak yapılır; katılaşmış agar 85 ° C'de erir) ve yaklaşık 45 ° C'ye gelmesine izin verin. Isıtılmış ortam, uygun bir sıcaklığa ulaşmak için ~ 1 saat boyunca 45 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirilebilir. Sıvı halde kalacak kadar sıcak, ancak eklenen bakterileri öldürmeyecek kadar soğuk olmalıdır.
3. 4 mL bakteri kültürünü (adım 2.2'den itibaren) 35 mL LB yumuşak agar (45 ° C'de) ile karıştırın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için döndürün, ancak köpürmeyi önlemek için sallamaktan kaçının (Şekil 4A).
4. Toplam 7 etiketli test tüpü için seri seyreltme adımlarının her biri için bir steril test tüpü ve kontrol numunesi için bir steril test tüpü etiketleyin. Adım 2.4.3'teki bakteri kültürü / yumuşak agar karışımının 5 mL alikotunu 7 tüpe yerleştirin. Adım 2.4.6'ya kadar hızlı bir şekilde çalışın, çünkü bu kadar küçük hacimlerde agar bazlı ortamlar oda sıcaklığında hızla katılaşacaktır.
5. 100 μL kontrol numunesini (adım 2.3'ten itibaren) kontrol test tüpüne ekleyin ve dikkatlice döndürün. Kullanılmış pipet ucunu atın ve seri olarak seyreltilmiş bakteriyofaj örneklerinin her birinden (adım 2.3) aynı hacmi karıştırmak için döndürerek ilgili test tüplerine aktarın.
6. 5 mL karışımları hemen etiketli, önceden ısıtılmış, katı agar plakalarına aktarın (Şekil 4A). Karışımları eşit şekilde yaymak için plakaları hafifçe döndürün.
  not: Testi üç nüsha halinde gerçekleştiriyorsanız, 2.4.3-6 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
7. Her plakayı laboratuvar filmi ile kapatın ve her iki katmanın da oda sıcaklığında (yaklaşık 15 dakika) düzgün bir şekilde katılaşmasına izin verin, 37 ° C'lik bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin, hem bakterilerin hem de fajın büyümesini uyarın, 24 saat boyunca veya plaklar gelişene kadar, Plakların ortaya çıkması tipik olarak yaklaşık 1-5 gün sürer (Şekil 4B), ancak zamanlama kuluçka koşullarına, ortama ve bakteri türüne bağlı olarak önemli ölçüde değişir.

3. Veri Analizi ve Sonuçlar

Plakaları sayma
1. Viral kontaminasyonu göstereceğinden, "kontrol" olarak işaretlenmiş plakalarda hiçbir plak görünmediğinden emin olun.
2. En seyreltilmiş bakteriyofaj örneğini içeren ^10-6 etiketli plakalarla başlayın. Kapağı çıkarmadan plakları sayın, hangi plakların daha önce sayıldığını belirtmek için giderken bir kalemle işaretleyin.
3. Kalan plakaları sayın. Bazı plaklarda sayılamayacak kadar az veya çok fazla plak olabilir. Daha fazla analiz için 10-150 plakalı plakaları kullanın.
PFU'nun hesaplanması
1. 100 μL faj >. en seyreltilmiş numune için ^10-6). not: Testi üç kopya halinde yapıyorsanız, üç plakadan ortalama plak sayısını kullanın.
2. Orijinal numunenin konsantrasyonunu (PFU/mL cinsinden) belirlemek için, yalnızca 100 μL numune kaplandığı için 10'luk ek bir seyreltme faktörü ile çarpın. (yani )
3. Daha güvenilir bir sonuç elde etmek için 10 ila 150 plak içeren tüm seyreltmeler için PFU/mL'nin ortalama değerini hesaplayın.