Uyarlanmış Bir Kalsiyum Klorür Prosedürü Kullanılarak E. coli Hücrelerinin Dönüşümü

Bu protokol, kalsiyum klorür prosedürünün bir adaptasyonu kullanılarak yetkin E. coli DH5α'nın hazırlanmasını ve dönüştürülmesini açıklar (12).

1. Kurulum

1. ekipman
   • Spektrofotometre
   • Sorval Santrifüj (veya eşdeğeri)
   • Tezgah üstü santrifüj
   • Isı bloğu veya su banyosu
   • Yörünge Çalkalayıcı
   • Sabit İnkübatör
   • Jel döküm tepsisi
   • Kuyu tarakları
   • Gerilim kaynağı
   • Jel kutusu
   • UV ışık kaynağı
   • mikrodalga
2. Çözeltiler ve reaktifler
   • Luria-Bertani (LB) suyu (10 g kazein enzimik hidrolizat, 5 g maya özütü ve 1000 mL H₂O içinde 5 g sodyum klorür)
   • Katabolit baskılanmış (SOC) Süper Optimal et suyu: (% 2 (a / h) tripton,% 0.5 (a / h) maya özütü, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgS04 ve 20 mM glikoz)
   • CaCl_{2-MgCl 2} (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) çözeltisi.
   • M CaCl₂ çözeltisi (hücreler hemen dönüştürülecekse) veya (h / h) gliserol içeren 0.1M CaCl₂ çözeltisi (hücreler ileride kullanılmak üzere dondurulacaksa).
   • LB agar plakaları
   • LB agar seçici plakalar (bu deney için, kullanılan plazmit ampisilin direnci sağladığından, 100 μg/mL ampisilin içeren LB agar plakaları kullanıldı)
   • E. coli DH5α suşu
   • Plazmid pUC19 DNA'sı (100 pg/ μl)
   • QIAprep Spin Miniprep Kiti (Qiagen)
   • HindIII kısıtlama enzimi
   • 1 kb artı DNA merdiveni
   • Düşük Erime Noktalı Agaroz
   • 1X TAE tamponu (40 mM Tris Baz, 20 mM Asetik Asit ve 1mM EDTA)
   • Etidiyum Bromür (10mg/mL)
3. Genel güvenlik notları
   E. coli DH5α, Biyogüvenlik Seviyesi 1 (BSL1) olarak sınıflandırılır. Bu kategorideki mikroplar, sağlıklı yetişkinlerde enfeksiyon tehdidi çok azdır veya hiç yoktur. Bununla birlikte, mikroorganizmanın dikkatli bir şekilde manipüle edilmesi gerekir.

ÖNEMLİ Bu protokoldeki tüm adımların, aksi belirtilmedikçe aseptik teknikler kullanılarak ve buz veya 4°C sıcaklıklarda gerçekleştirilmesi gerekir.

2. Protokol

1. Donmuş bir E. coli DH5α stoğundan (LB'de yetiştirilen bir gece kültüründen% 20 gliserol içinde dondurulmuş), bir LB agar plakasında izolasyon için bakterileri çizgilendirin. Gece boyunca 37°C'de (16-20 saat) inkübe edin.
2. Tek bir koloniyi bir tüpte 3 mL LB suyuna aşılayın. Gece boyunca (16-20 saat) 37 ° C'de 210 rpm'de sallayarak büyüyün.
3. Gece kültürünün OD600'ünü ölçün. 1 litrelik bir şişede 100 mL LB suyunu bir OD600=0.01'e aşılamak için gece kültürünü kullanın. Kültür OD600=0.35'e (yaklaşık 3 saat) ulaşana kadar her 15-20 dakikada bir spektrofotometrede OD600'ü izleyerek 37 ° C'de kuvvetli bir şekilde çalkalayarak (210 rpm) inkübe edin.
   NOT: Dönüşümün verimli olması için bakteri hücrelerinin orta üstel büyüme aşamasında olması gerekir. Maksimum hücre sayısının 10⁸ hücre / mL olması gerekir, bu da çoğu E. coli suşu için OD600=0.4'e karşılık gelir. Spektrofotometrenin kullanılması, hücrelerin uygun büyüme aşamasında olduğunu belirlemeye izin veren OD600'ün ölçülmesine izin verir. Bu protokol diğer bakteri türleri için kullanılacaksa, bu korelasyonu belirlemek için belirli OD600 değerlerinde birim oluşturan kolonilerin sayısını belirlemek için kalibrasyon gerekli olacaktır.
4. Kültürün 50 mL'sini 2 buz gibi soğuk polipropilen santrifüj şişesinin her birine aktarın. Şişeleri soğuması için 20 dakika buzun üzerine koyun.
5. Hücreleri 2700 g'da (bir Sorval GSA rotorunda 4100 rpm) 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleme ile geri kazanın.
6. Süpernatanı çıkarın. Şişeyi bir ped veya kağıt havlu üzerine baş aşağı yerleştirerek son ortam izlerini boşaltın.
7. Her bakteri peletini 30 mL CaCl_{2-MgCl 2} (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) buz gibi soğuk çözeltiye yeniden süspanse edin. Önce 5 mL çözelti ekleyin, pelet tamamen eriyene kadar dikkatlice döndürün ve ardından kalan 25 mL çözeltiyi ekleyin.
8. Adım 2.4'ü tekrarlayın.
9. Adım 2.5'i tekrarlayın.
10. Yetkili hücreler doğrudan dönüştürülecekse, tüpleri dikkatlice döndürerek her bir bakteri peletini 2 mL_{CaCl 2} (0.1 M) buz gibi soğuk bir çözeltiye yeniden süspanse edin. Pelet bu yöntemle yeniden süspanse edilmezse, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek (kabarcık oluşumunu önleyerek) yeniden süspanse edin.
    Alternatif olarak, yetkili hücreler dondurulabilir ve daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Yetkili hücrelerin donmuş stoklarını hazırlamak için, peleti (h/h) gliserol içeren 0.1M_{CaCl 2} çözeltisinin 2 ml'sinde yeniden süspanse edin. Bu çözümün buz gibi soğuk olması gerekiyor. Buz gibi soğuk 1.5 mL polipropilen tüplere (tüp başına 160 μl) aliquot hücre süspansiyonu. Yetkili hücreleri hemen kuru bir buz/etanol banyosunda dondurun. Tüpleri -70°C'lik bir dondurucuya aktarın.
11. CaCl₂ ile muamele edilmiş hücreleri dönüştürmek için, 2 adet 1.5 ml'lik polipropilen tüpün her birine 50 μl yetkin hücre aktarın. 1 μl (100 pg) pUC19 plazmit DNA'sını tüplerden birine ekleyin ve ikinci tüpü DNA'sız bırakın (negatif kontrol). Yavaşça karıştırın (kabarcık oluşumunu önleyin). Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Dönüşümde 10 μL veya daha az bir hacimde 50 ng'den fazla DNA kullanılmamalıdır.
12. Tüpleri ısı bloğuna aktarın ve tam olarak 45 saniye boyunca 42°C'de inkübe edin.
    NOT: Isı şoku kritik bir adımdır. Sıcaklığı veya inkübasyon süresini aşmayın.
13. Tüpleri kolayca buza aktarın. 2 dakika inkübe edin.
14. 950 μL SOC ortamı ekleyin ve bakterilerin iyileşmesine ve plazmidde kodlanan antibiyotiğe dirençli belirteçin eksprese edilmesine izin vermek için tüpleri 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
15. SOC'de 1000 μL'de hücre süspansiyonunun 10 μL'sini (1/100 seyreltme) ve hücre süspansiyonunun 100 μL'sini SOC'de (1/10 seyreltme) 1000 μL'de seyreltin. 100 μl seyreltme ve kontrol kısmını seçici plakalara plakalayın ve bir spatula kullanarak yayın. Genellikle, 1/100 ve 1/10 seyreltmenin 100 μL'sinin kaplanması, plaka başına yeterli sayıda koloni oluşturan birim (cfu) verecektir. İdeal olarak, bu sayı 30-300 cfu arasında değişmelidir, böylece yeterli koloni vardır, ancak birbirinden ayrılır. Bununla birlikte, cfu sayısı dönüşüm verimliliğine bağlı olacaktır (Veri Analizi ve Sonuçlar Bölümüne bakınız).
16. Plakaları 37 ° C'de inkübe edin. Dönüştürülmüş koloniler 12-16 saat içinde ortaya çıkmalıdır (bu aralık hücre suşuna ve seçim yöntemine bağlı olacaktır). Negatif kontrolde hiçbir koloni büyümemelidir.
17. Dönüşüm için elde edilen kob/plakayı sayın (Tablo 1).
18. Transformatörlerin pUC19 plazmidini barındırdığını doğrulamak için, bir plazmit hazırlığı ve ardından sindirim gerçekleştirilecektir. Bu amaçla, tek bir koloniyi bir tüpte 3 ml LB suyuna aşılayın. Gece boyunca (16-20 saat) 37 ° C'de 210 rpm'de sallayarak büyüyün.
19. Üreticinin talimatlarına göre QIAprep Spin Miniprep Kitini kullanarak bir plazmid preparatı hazırlayın.
20. 1 μg saflaştırılmış pUC19'u kısıtlama enzimi HindIII ile 37 ° C'de 1 saat boyunca sindirin.
    NOT: pUC19 çoklu klonlama bölgesini kesen herhangi bir enzim bu adım için kullanılabilir.

parça	miktar
10X Kısıtlama özet arabelleği	2,5 μl
Plazmid pUC19	1 μg
HindIII	1 μl
H2O	20,5 μl (25 μl'ye kadar)

1. 1 μg/mL etidyum bromür içeren %1'lik bir agaroz jel içinde 95 V.
   'de 1 saat boyunca bir moleküler ağırlık merdiveni, sindirilmiş pUC19 DNA'sı ve aynı miktarda sindirilmemiş pUC19 DNA'sı çalıştırın NOT: zaman ve voltaj, kullanılan ekipmana bağlı olarak değişecektir.
2. Jeli UV ışığı altında görselleştirin. Sindirilmiş ve sindirilmemiş pUC19 DNA'sının boyutunu karşılaştırın (Şekil 2) (Veri Analizi ve Sonuçlar Bölümüne bakınız).
   Her bir dönüştürme deneyinin hedefine göre dönüştürmeyi doğrulamak için gereken gerekli adımlarla devam edin.

Şekil 2: Transforme DH5α hücrelerinden geri kazanılan plazmit DNA'nın sindirimi. Plazmid DNA, transforme edilmiş DH5α hücrelerinden geri kazanıldı, HindIII ile sindirildi,% 1'lik bir agaroz jel içinde çalıştırıldı ve bir UV kaynağı ile görüntülendi (aşama 2.19 ila 2.22).

3. Veri Analizi ve Sonuçlar

Hücrelerin hücre dışı DNA'yı ne kadar iyi aldığının bir göstergesi olan dönüşüm verimliliğini hesaplamak için, dönüşümde elde edilen kolonilerin sayılması gerekir:

Seyreltme	Eczacılık
1/100	34
1/10	246

Tablo 1: Dönüşüm deneyinden sayılan koloni oluşturan birimler (cfu).

Dönüşüm verimliliği (TE), 1 μg plazmitin belirli bir yetkin hücre hacmine dönüştürülmesinden kaynaklanan cfu sayısının bir ölçüsüdür. Birçok parametre dönüşüm verimliliğini etkiler: plazmit boyutu, hücre genotipi, yeterlilik hazırlığı sırasında büyüme aşaması, dönüşüm yöntemleri, vb.). TE'yi hesaplarken, kaplamadan önce hangi seyreltmenin (varsa) yapıldığını dikkate almak ve bunu toplam cfu sayısının hesaplanmasına dahil etmek önemlidir. Dönüşüm verimliliği (TE) aşağıdaki denklemle hesaplanır:

Önce cfu'yu DNA'nın μg'sine bölün, bu örnekte 0.0001μg. Ardından sonucu seyreltme faktörüne bölün. Bu örnekte, 1/10'luk bir seyreltme kullanılmış ve 100μL'lik 1 ml'lik bir çözelti kaplanmıştır (seyreltme: 1/10 × 100 μL /1000 μL=0.01).