Konjugasyon: Ampisilin Direncini Donörden Alıcıya Aktarmak İçin Bir Yöntem E. coli

1. Kurulum

1. Yaklaşık 1L Luria-Bertani ortamı (LB) otoklavlayın. Bu steril LB, 0.3 mM diaminopimelik asit (DAP) içeren yaklaşık 5 mL LB yapmak için kullanılacaktır.
2. Aşağıdaki plakaları toplayın: 1X Tet ve 0.3 mM DAP'lı LB agar plakaları, yalnızca 1X Tet'li LB agar plakaları ve yalnızca 1X Amp/Tet'li LB agar plakaları.
3. Bir miktar gliserol ve bir kutu önceden sterilize edilmiş plastik pipet ucunun elinizin altında olduğundan emin olun.
4. Mikropları içeren herhangi bir çalışmaya başlamadan önce, çalışma alanını %70 etanol ile sterilize edin. Her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven de dahil olmak üzere gerekli kişisel koruyucu ekipmanı giyin.
5. Bitirdikten sonra tüm yüzeyleri ve eldivenleri %70 etanol ile sterilize edin ve ellerinizi yıkayın.

2. Donör ve Alıcı Suş Hazırlığı

1. Donör ve alıcı suşların 5 mL bakteri kültürlerini hazırlayın ve bunları gece boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütün. Donör suşu, 0.3 mM DAP ile LB'de büyütülmelidir.
2. Her iki kültürden 1 mL döndürün (5 dakika boyunca ~ 3000 rpm) ve hücreleri PBS ile yıkayın.
3. Hücreleri 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.

3. Konjugasyon

1. 50 μL alıcı hücreyi 50 μL donör hücre ile bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin ve pipetleme ile karıştırın.
2. Hücre karışımını 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Bu, bir sonraki kaplama adımından önce ve sırasında konjugasyonun verimliliğini artıracaktır.
3. 100 μL hücre karışımını 1X Tet ve 0.3 mM DAP ile bir agar plakasına pipetleyin. Tabağa yaymayın.
4. 100 μL alıcı hücre kültürünü 1X Tet ve 0.3 mM DAP ile bir agar plakasına pipetleyin. Tabağa yaymayın.
5. Her iki plakayı da gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
6. Konjugasyon hücresi karışımını ve alıcı hücre kültürünü steril bir hücre sıyırıcı ile kazıyın. Hücreleri steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
7. Hücreleri girdaplayın ve yavaşça döndürün (5 dakika boyunca ~ 3000 rpm).
8. Hücreleri 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
9. Konjugasyon reaksiyon hücresi karışımını yalnızca 1X Amp/Tet içeren bir LB agar plakası üzerine yerleştirin. Bu plakada, sadece konjugasyon yoluyla Amp direnç genini başarıyla kazanan alıcı bakterilerin büyümesi beklenir.
10. Alıcı hücreleri yalnızca 1X Tet ile bir LB agar plakasına yerleştirin. Bu plakada, sadece Amp direnç genine sahip olmayan konjuge olmayan alıcı bakterilerin büyümesi beklenir.
11. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
12. Her iki plakadan da tek koloniler seçin ve bunları 5 mL ortamda (220 rpm'de havalandırma ile 37 ° C) gece boyunca kültürleri büyütmek için kullanın.

4. DNA İzolasyonu

1. DNA miniprep ile toplam kültür hacminin 4.5 mL'sini kullanarak önceden hazırlanmış kültürlerden DNA'yı izole edin.
2. Bunu yapmak için, 35 μL nükleaz içermeyen su kullanarak DNA'yı elüte edin.
3. Saf DNA, yaklaşık 1.8'lik bir absorbans oranı (A_260/280) üretecektir.
4. 1: 1 bakteri kültürü ve% 100 gliserol karışımı yaparak gliserol stoklarını hazırlamak için her kültürün kalan 0,5 mL'sini kullanın.
5. Dondurucu stoklarını -80 °C'de saklayın.

5. Plazmid transfer konjugasyonunun PCR ile doğrulanması

1. Her biri farklı bir ileri ve geri primer setine sahip, biri ampisilin direnç geni içindeki 500 baz çifti segmentini ve diğeri bir temizlik geni içindeki bir segmenti hedefleyen iki PCR ana karışımı hazırlayın.
   1. Temizlik gen primerleri, DNA giraz B'yi kodlayan bakteri geni içindeki bir DNA segmentini amplifiye etmek için tasarlanmıştır (14).
   2. Her bir ana karışımdan 90 μL hazırlamak için aşağıdaki reaktif hacimleri kullanıldı:
      7,5 μL 10 μM ileri astar
      7,5 μL 10 μM ters astar
      75 μL 2X PCR Master Karışımı
2. 15 μL ana karışım, 10 ng şablon DNA ve 25 μL'lik son hacme kadar nükleaz içermeyen su kullanarak aşağıdaki altı PCR reaksiyonunu hazırlayın.
   Konjugasyon reaksiyonu DNA ve ampisilin primerleri
   Konjugasyon reaksiyonu DNA ve temizlik primerleri
   Negatif kontrol DNA'sı ve ampisilin primerleri
   Negatif kontrol DNA'sı ve temizlik primerleri
   DNA ve ampisilin primerleri yok
   DNA ve temizlik astarları yok
3. Bu reaksiyonları, blok önceden 98 ° C'ye ısıtılmış bir PCR makinesine aktarın ve aşağıdaki koşullar altında termosiklasyona başlayın:
   30 saniye boyunca 98 °C
   kb
   başına 5-10 saniye boyunca 98 °C, 10 ila 30 saniye boyunca 45-72 °C ve 15-30 saniye boyunca 72 °C'de 25-35 döngü 72 °C'de 5-10 dakika
   4 °C
'de tutun
4. Altı PCR reaksiyonunun tümünü %1'lik bir agaroz jele yükleyin ve yaklaşık 20 dakika boyunca ~150V'de çalıştırın.
5. PC ürününü bir UV aydınlatıcı kullanarak görselleştirin.