6.11: Konjugasyon: Ampisilin Direncini Donörden Alıcıya Aktarmak İçin Bir Yöntem E. coli

1. Kurulum

1. Yaklaşık 1L Luria-Bertani ortamı (LB) otoklavlayın. Bu steril LB, 0.3 mM diaminopimelik asit (DAP) içeren yaklaşık 5 mL LB yapmak için kullanılacaktır.
2. Aşağıdaki plakaları toplayın: 1X Tet ve 0.3 mM DAP'lı LB agar plakaları, yalnızca 1X Tet'li LB agar plakaları ve yalnızca 1X Amp/Tet'li LB agar plakaları.
3. Bir miktar gliserol ve bir kutu önceden sterilize edilmiş plastik pipet ucunun elinizin altında olduğundan emin olun.
4. Mikropları içeren herhangi bir çalışmaya başlamadan önce, çalışma alanını %70 etanol ile sterilize edin. Her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven de dahil olmak üzere gerekli kişisel koruyucu ekipmanı giyin.
5. Bitirdikten sonra tüm yüzeyleri ve eldivenleri %70 etanol ile sterilize edin ve ellerinizi yıkayın.

2. Donör ve Alıcı Suş Hazırlığı

1. Donör ve alıcı suşların 5 mL bakteri kültürlerini hazırlayın ve bunları gece boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütün. Donör suşu, 0.3 mM DAP ile LB'de büyütülmelidir.
2. Her iki kültürden 1 mL döndürün (5 dakika boyunca ~ 3000 rpm) ve hücreleri PBS ile yıkayın.
3. Hücreleri 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.

3. Konjugasyon

1. 50 μL alıcı hücreyi 50 μL donör hücre ile bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin ve pipetleme ile karıştırın.
2. Hücre karışımını 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Bu, bir sonraki kaplama adımından önce ve sırasında konjugasyonun verimliliğini artıracaktır.
3. 100 μL hücre karışımını 1X Tet ve 0.3 mM DAP ile bir agar plakasına pipetleyin. Tabağa yaymayın.
4. 100 μL alıcı hücre kültürünü 1X Tet ve 0.3 mM DAP ile bir agar plakasına pipetleyin. Tabağa yaymayın.
5. Her iki plakayı da gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
6. Konjugasyon hücresi karışımını ve alıcı hücre kültürünü steril bir hücre sıyırıcı ile kazıyın. Hücreleri steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
7. Hücreleri girdaplayın ve yavaşça döndürün (5 dakika boyunca ~ 3000 rpm).
8. Hücreleri 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
9. Konjugasyon reaksiyon hücresi karışımını yalnızca 1X Amp/Tet içeren bir LB agar plakası üzerine yerleştirin. Bu plakada, sadece konjugasyon yoluyla Amp direnç genini başarıyla kazanan alıcı bakterilerin büyümesi beklenir.
10. Alıcı hücreleri yalnızca 1X Tet ile bir LB agar plakasına yerleştirin. Bu plakada, sadece Amp direnç genine sahip olmayan konjuge olmayan alıcı bakterilerin büyümesi beklenir.
11. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
12. Her iki plakadan da tek koloniler seçin ve bunları 5 mL ortamda (220 rpm'de havalandırma ile 37 ° C) gece boyunca kültürleri büyütmek için kullanın.

4. DNA İzolasyonu

1. DNA miniprep ile toplam kültür hacminin 4.5 mL'sini kullanarak önceden hazırlanmış kültürlerden DNA'yı izole edin.
2. Bunu yapmak için, 35 μL nükleaz içermeyen su kullanarak DNA'yı elüte edin.
3. Saf DNA, yaklaşık 1.8'lik bir absorbans oranı (A_260/280) üretecektir.
4. 1: 1 bakteri kültürü ve% 100 gliserol karışımı yaparak gliserol stoklarını hazırlamak için her kültürün kalan 0,5 mL'sini kullanın.
5. Dondurucu stoklarını -80 °C'de saklayın.

5. Plazmid transfer konjugasyonunun PCR ile doğrulanması

1. Her biri farklı bir ileri ve geri primer setine sahip, biri ampisilin direnç geni içindeki 500 baz çifti segmentini ve diğeri bir temizlik geni içindeki bir segmenti hedefleyen iki PCR ana karışımı hazırlayın.
   1. Temizlik gen primerleri, DNA giraz B'yi kodlayan bakteri geni içindeki bir DNA segmentini amplifiye etmek için tasarlanmıştır (14).
   2. Her bir ana karışımdan 90 μL hazırlamak için aşağıdaki reaktif hacimleri kullanıldı:
      7,5 μL 10 μM ileri astar
      7,5 μL 10 μM ters astar
      75 μL 2X PCR Master Karışımı
2. 15 μL ana karışım, 10 ng şablon DNA ve 25 μL'lik son hacme kadar nükleaz içermeyen su kullanarak aşağıdaki altı PCR reaksiyonunu hazırlayın.
   Konjugasyon reaksiyonu DNA ve ampisilin primerleri
   Konjugasyon reaksiyonu DNA ve temizlik primerleri
   Negatif kontrol DNA'sı ve ampisilin primerleri
   Negatif kontrol DNA'sı ve temizlik primerleri
   DNA ve ampisilin primerleri yok
   DNA ve temizlik astarları yok
3. Bu reaksiyonları, blok önceden 98 ° C'ye ısıtılmış bir PCR makinesine aktarın ve aşağıdaki koşullar altında termosiklasyona başlayın:
   30 saniye boyunca 98 °C
   kb
   başına 5-10 saniye boyunca 98 °C, 10 ila 30 saniye boyunca 45-72 °C ve 15-30 saniye boyunca 72 °C'de 25-35 döngü 72 °C'de 5-10 dakika
   4 °C
'de tutun
4. Altı PCR reaksiyonunun tümünü %1'lik bir agaroz jele yükleyin ve yaklaşık 20 dakika boyunca ~150V'de çalıştırın.
5. PC ürününü bir UV aydınlatıcı kullanarak görselleştirin.

E. coli gibi bakteri hücreleri, genetik bilgiyi hücreden hücreye aktarabilir. Konjugasyon, hücreler arasında fiziksel temas gerektirmesi nedeniyle, transdüksiyon veya transformasyon gibi diğer DNA transfer mekanizmalarından farklıdır.

Devam etmek için, konjugasyon, doğurganlığı veya F faktörünü ifade eden bir donör hücre ve onsuz bir alıcı hücre, bir F eksi hücre gerektirir. İşlem iki adım gerektirir. Birincisi, hücreden hücreye doğrudan temasın kurulmasıdır. Bunu yapmak için, donör hücre, seks pilusu adı verilen hücre dışı filamentli bir yapı oluşturur. Konjugasyon, eşeysiz üreyen bakteriler için bir çiftleşme şekli olduğu için bu şekilde adlandırılmıştır, ancak gamet alışverişi yapılmadığı ve yavru oluşmadığı için gerçek eşeyli üreme olmadığı unutulmamalıdır.

İkinci adım, DNA'nın alıcı hücreye iletilmesidir. Seks pilusu iki hücre arasında temas kurduktan sonra, Tip IV salgı sistemi adı verilen ve DNA'nın transferine izin veren bir kanal inşa edilir. Donör hücre daha sonra, OriT veya transferin kökeni olarak bilinen bir genetik elementin varlığına dayalı olarak seçilerek transfer edilecek ekstrakromozomal DNA'yı kopyalamaya başlar. Yeni kopyalanan DNA'nın bir ucu, DNA protein bağlanması yoluyla kanala geçirilir. DNA daha fazla kopyalandıkça, OriT'ye yakın bulunan genler tarafından kodlanan bir protein kompleksi tarafından kolaylaştırılan kanaldan pompalanır. DNA tamamen transfer edildikten sonra, ya ekstra bir kromozomal plazmit oluşturacaktır ya da alıcı hücrenin kromozomuna entegre olabilir. Aktarılan DNA'nın son noktası ne olursa olsun, kodladığı genler daha sonra ifade edilecektir. Bu gen ekspresyonu, başarılı konjugasyonu doğrulamak için kullanılabilir.

Örneğin, donör suşunun ampisilin direncini eksprese ettiği ve bunu konjuge DNA'da alıcı bakteriye ilettiği, ancak alıcı suşun ayrıca donörde bulunmayan bir tetrasiklin direnç genine sahip olduğu bir senaryo düşünün. Bu olayda, hücreler hem tetrasiklin hem de ampisilin içeren LB ortamı üzerine kaplandığında, koloniler yalnızca başarılı bir şekilde konjuge edilmiş bakterilerden büyümelidir, bu da her iki direnç fenotipini de ifade edecektir. Başarılı konjugasyonu daha da doğrulamak için, bu kolonilerden plazmit DNA'sı hasat edilebilir ve daha sonra transfer edilen plazmide özgü bir DNA bölümü, polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR kullanılarak amplifiye edilebilir. PCR ürünü, standart boyutlarda bir merdivenin yanında bir elektroforez jeli üzerinde çalıştırıldığında, jel üzerinde bilinen boyutta bir PCR fragmanı görünür olmalı ve bu da başarılı konjugasyonu daha da doğrular. Bu deneyde, ampisilin direnç genini konjugasyon yoluyla bir donör suşundan tetrasikline dirençli bir alıcı suşuna aktarmak için bir plazmit kullanılacaktır. Bundan sonra, konjugasyonu doğrulamak için, konjugasyon karışımı, sadece dönüştürülmüş bakterileri bırakarak her iki antibiyotiği içeren bir plaka üzerinde inkübe edilecektir. Son olarak, başarılı konjugasyon PCR ile daha da doğrulanacaktır.

Prosedüre başlamadan önce, laboratuvar önlüğü ve eldiven dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanı giyin. Ardından, yüzeyi silmek için çalışma alanını %70 etanol kullanarak sterilize edin.

Bu prosedürde, ampisilin direnç geni, E. coli'nin WM3064 suşundan konjugasyon yoluyla E. coli'nin J53 suşuna aktarılacaktır. Donör suşu WM3064, tetrasiklin ve ampisilin'e dirençlidir ve büyümesi için diaminopimelik asit veya DAP gerektirir. Alıcı suşu J53 sadece tetrasikline dirençlidir ve DAP'ın büyümesine ihtiyaç duymaz. Bu, başarılı bir şekilde konjuge hücrelerin tetrasiklin ve ampisilin'e dirençli olması gerektiği ve DAP olmadan büyüyebileceği anlamına gelir.

0.3 milimol DAP içeren beş mililitre LB'yi donmuş donör suşu gliserol stoğunun bir parçası ile aşılayarak donör suş kültürünü hazırlayın. Daha sonra, DAP içermeyen beş mililitre LB suyunu donmuş alıcı suşu gliserol stoğunun bir parçası ile aşılayarak alıcı suşunu hazırlayın. Bu kültürleri gece boyunca 37 santigrat derecede havalandırarak ve çalkalayarak 220 RPM'de çalkalayarak büyütün. Kültürler iki OD 600'e ulaştığında, her birinden bir mililitre kültür çıkarın ve bunu iki yeni ayrı 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Ardından, bakteri hücrelerini peletlemek için bu alikotları 3000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve her peleti 250 mikrolitre 1X PBS ile yıkayın. Numuneleri tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı attıktan sonra, her peleti 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Konjugasyon prosedürüne başlamak için önce 50 mikrolitre alıcı hücreyi 50 mikrolitre donör hücre ile 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra, alıcı hücre kültürünün 100 mikrolitresini DAP içeren başka bir 1X tetrasiklin plakasına pipetleyin. Daha sonra, alıcı hücre kültürünün 100 mikrolitresini yalnızca DAP içeren seçici olmayan bir agar plakasına pipetleyerek negatif kontrolünüzü hazırlayın. Ardından, konjugasyonu ve negatif kontrol plakalarını gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, steril bir hücre sıyırıcı alın ve kolonileri toplayarak konjugasyon plakasından hücreleri hasat edin. Daha sonra kolonileri bir mililitre 1X PBS içeren steril 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Alıcı hücreleri diğer plakadan toplamak için bu işlemi tekrarlayın.

Bundan sonra, karıştırmak için numuneleri girdaplayın. Karıştırdıktan sonra, hücreleri nazikçe peletlemek için tüpleri bir santrifüje aktarın. Süpernatanı atın, ardından hücre peletlerini bir mililitre PBS'de yıkayın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için tüpleri girdaplayın. Hücreleri santrifüjleyerek tekrar peletleyin. Süpernatanı tekrar atın ve her iki hücre peletini bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Şimdi, steril bir pipet ucu kullanarak, 100 mikrolitre konjugasyon reaksiyon hücresi karışımını, 1X tetrasiklin ve 1X ampisilin içeren DAP içermeyen bir LB agar plakası üzerine plakalayın. PBS'de aynı hücre karışımının on kat seyreltilmesinden 100 mikrolitre kullanarak, 1X tetrasiklin ve 1X ampisilin içeren DAP içermeyen başka bir LB agar plakası üzerine kaplama yöntemini tekrarlayın.

Son olarak, negatif kontrol hücresi karışımından 100 mikrolitreyi sadece 1X tetrasiklin içeren tek bir LB agar plakasına pipetleyin. 37 santigrat derecede gece boyunca inkübasyondan sonra koloniler görünür olmalıdır. Steril bir pipet ucu kullanarak, konjugasyon reaksiyon plakasından tek bir koloni seçin ve her iki antibiyotiği içeren beş mililitre seçici LB ortamı içeren bir tüpe ekleyin. Ardından, alıcı hücre plakasından tek bir koloni seçerek koloni izolasyonunu tekrarlayın. Bu kültürleri gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün ve 220 RPM'de havalandırın.

Ertesi gün, tezgah üstünü %70 etanol ile silin ve plakaları inkübatörden çıkarın. DNA'yı 4'ten izole etmek için bir DNA mini hazırlık kiti kullanın. Üreticinin talimatlarına göre her kültürden 5 mililitre. DNA mini hazırlığını tamamladıktan sonra, 35 mikrolitre nükleaz içermeyen su kullanarak DNA'yı elüte edin. Son olarak, kalan 0'ı kullanın. Bire bir seyreltme için 0.5 mililitre %100 gliserol ekleyerek bir mililitre gliserol stokları hazırlamak için her kültürden 5 mililitre. Bu alikotları ihtiyaç duyulana kadar saklamak için eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin.

PCR ile başarılı konjugasyonu doğrulamak için, önce bir mikrosantrifüj tüpüne 75 mikrolitre 2X PCR ana karışımı ekleyerek bir PCR ana karışımı hazırlayın. Daha sonra, plazmidden ampisilin direnç genini amplifiye etmek için tasarlanmış 10 mikromolar ileri primer ve 10 mikromolar ters primerin her birine 7.5 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, bir mikrosantrifüj tüpüne 75 mikrolitre 2X PCR ana karışımı ekleyerek ve ardından bir temizlik genini amplifiye etmek için tasarlanmış 10 mikromolar ileri primer ve 10 mikromolar ters primerin her birine 7,5 mikrolitre ekleyerek ikinci bir PCR ana karışımı hazırlayın, bu durumda DNA giraz B.

Şimdi, bir PCR tüpüne 15 mikrolitre ilk ana karışım ekleyin ve ardından 10 nanogram ekleyin, aynı tüpe şablon deneysel DNA'nın yaklaşık iki mikrolitresi. Reaksiyonu nükleaz içermeyen su ile 25 mikrolitrelik son hacme getirin. Kalan beş reaksiyonu üretmek için bu adımları tekrarlayın, böylece tüpler burada gösterilen bileşenleri içerir. Şimdi, bu reaksiyonları blok önceden 98 santigrat dereceye ısıtılmış bir termodöngüleyiciye aktarın ve ardından programı başlatın. PCR'nin tamamlanmasından sonra tüpleri makineden çıkarın. Daha sonra, iki mikrolitre yükleme boyası ve dört mikrolitre moleküler ağırlık markörü ile karıştırılmış her reaksiyonun iki mikrolitresini,% 1'lik bir agaroz jelinin ardışık kuyucuklarına yükleyin. Jeli 20 dakika boyunca 150 voltta çalışacak şekilde ayarlayın. Son olarak, jeli bir UV aydınlatıcı kullanarak görselleştirin.

Bu deneyde, ampisilin direnç geninin konjugasyon yoluyla başarılı bir şekilde aktarılması PCR ile doğrulandı. Burada, konjuge DNA ve ampisilin primerlerini içeren kuyucukta kabaca 500 baz çifti büyüklüğünde bir bant gözlenmelidir, bu örnekte iki tane. Bir temizlik geni olan DNA giraz B, sırasıyla konjuge DNA ve alıcı hücre DNA'sı ile üçüncü ve beşinci kuyulara yüklendi. Bu kuyucuklarda gözlemlenen bantlar, DNA şablonunun mevcut olduğundan ve PCR'nin başarılı olduğundan emin olmak için pozitif bir kontrol görevi görür. Alıcı hücre DNA'sı ve ampisilin primer çifti için reaksiyonu içeren kuyucukta bantlar gözlenmemelidir, çünkü alıcı hücreler ampisilin dirençli değildir. Ek olarak, şablon DNA'sı olmayan reaksiyonlarda hiçbir bant gözlenmemelidir, burada altı ve yedinci kuyular. Bu koşullar yerine getirilirse, bu, E. coli'nin WM3064 suşundan E. coli'nin J53 suşuna ampisilin direnci sağlayan ampisilin direnç geninin başarılı bir şekilde transferini doğrulayacaktır.