Faj Transdüksiyonu: Ampisilin Direncini Donörden Alıcıya Aktarmak İçin Bir Yöntem E. coli
1. Kurulum
- Mikropları içeren herhangi bir çalışmaya başlamadan önce, çalışma alanını %70 etanol kullanarak sterilize edin. Daima gerekli KKD'yi (laboratuvar önlüğü ve eldiven) kullanın.
- 1x ampisilin, piyasada bulunan P1 faj lizat solüsyonu, kloroform, 1 M sodyum sitrat, gliserol ve bir kutu önceden sterilize edilmiş plastik pipet uçları ve hücre yayıcılar içeren LB agar plakalarının elinizin altında olduğundan emin olun.
- Otoklavlama ile steril LB hazırlayın ve üç adet 1 mL LB tuzu çözeltisi yapmak için kullanın.
- mM MgCl2 (952.11-2.3803 μg), 5 mM CaCl2 (11.098 mg), %0.1-0.2 glikoz (100-200 μg)
- mM MgSO4 (12.0366 mg), 5 mM CaCl2 (11.098 mg)
- mM sodyum sitrat (25.806 mg)
- Bitirdikten sonra, tüm yüzeyleri ve eldivenleri %70 etanol ile sterilize edin ve ellerinizi yıkayın.
2. Protokol
- Donör Faj Lizat Hazırlığı
- 1 mL'lik bir donör W3110 suşu kültürü hazırlayın E. coli LB'de, gece boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütülen 1x ampisilin ile.
- Bu gece boyunca 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 ve% 0.1-0.2 glikoz ile desteklenmiş 1 mL taze LB'de 1:100 oranında seyreltin.
- Bu bakteri seyreltmesini 37 °C'de 2 saat boyunca 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütün.
- Bu hücreler erken logaritmik büyüme fazına ulaştığında (gözle görülür büyüme ve hafif bulanıklık), piyasada bulunan 40 μL P1 faj ekleyin ve 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile 37 °C'de bırakın.
- Faj ilavesinden önce, bu hücrelerin 600 nm'de ölçülen optik yoğunluğu yaklaşık 0.4 olmalıdır (6).
- Kültür parçalanana kadar hücreleri 1-3 saat izleyin.
- Lizis, hücresel döküntülerin artmasına ve bulanıklıkta kayda değer bir azalmaya neden olacaktır (yani, kültürün içini görebildiğinde hücreler parçalanmış olarak kabul edilecektir).
- Lisata birkaç damla (50-100 μL) kloroform ekleyin ve girdap ile karıştırın.
- Kloroform, kalan donör hücreleri öldürerek, sadece faj bırakarak ve bu lizatın titresini artırarak faj lizatını sterilize eder.
- Kalıntıları temizlemek ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarmak için lizatı 14.000 rpm'de 2 dakika santrifüjleyin.
- Birkaç damla kloroform ekleyin ve bir günden fazla olmamak üzere 4 ° C'de saklayın.
- Transdüksiyon
- 1 mL'lik bir alıcı J53 suşu E. coli kültürü hazırlayın ve gece boyunca LB'de 37 ° C'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütülür.
- 100 μL donör faj lizatını (2.1) 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca kapak açık olarak inkübe edin.
- Bu inkübasyon, P1 lizat çözeltisinde kalan herhangi bir kloroformun, alıcı hücrelere eklenmeden önce buharlaşmasına izin verir.
- Alıcı, suş hücrelerini 6.000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyerek nazikçe pelet haline getirin.
- Bu hücreleri 100 mM MgSO4 ve 5 mM CaCl2 içeren 300 μL taze LB içinde yeniden süspanse edin. (P1 fajının bulaşıcı olması için kalsiyuma ihtiyacı vardır).
- Alıcı bakteri hücrelerini ve hazırlanmış donör faj lizatını kullanarak iki reaksiyon oluşturun: 1) 100 μL alıcı J53 suşu E. coli ve 100 μL donör faj lizatını birleştiren transdüksiyon reaksiyonu ve 2) 100 μL alıcı J53 suşu E. coli ve 100 μL LB'yi birleştiren negatif kontrol 100 mM MgSO4 ve 5 mM CaCl2.
- 37 °C'de 30 dakika inkübe edin ve 220 rpm'de çalkalayın.
- 1 mL LB ve 200 μL 1M sodyum sitrat (pH = 5.5) ekleyin ve 220 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Sitrat, kalsiyum ile şelatlayarak P1'in enfektivitesini azaltmak ve alıcı bakterilerin parçalanmasını önlemek için kullanılır.
- Bu çözeltinin inkübasyonu, ampisilin direnç markörünün ekspresyonuna izin verir.
- 5 dakika boyunca 6.000 rpm'de santrifüjleme ile pelet hücreleri.
- Hücre peletlerini 100 μL LB içinde 100 mM sodyum sitrat (pH 5.5) ile yeniden süspanse edin. İki LB agar plakası üzerinde her iki reaksiyon için vorteks ve plaka tam çözeltisi.
- LB plakası, aktarılan numune için 1x Amp'ye sahip olmalı ve negatif kontrol için Amp'ye sahip olmamalıdır.
- Bu plakadaki P1 faj kontaminasyonu, dondurucu stokları hazırlanmadan önce yeniden çizgilenmeyi gerektirir.
- Faj uzaklaştırılmazsa, bu kolonilerden yetiştirilen kültürler, bir kalsiyum şelatörü bulunmadıkça büyümez.
- Her iki plakadan yaklaşık 3-4 koloni toplayın ve 100 μL 1 M sodyum sitrat (pH = 5.5) ile yayılmış iki LB agar plakası üzerinde tekrar çizin.
- LB plakası, aktarılan numune için 1x Amp'ye sahip olmalı ve negatif kontrol için Amp'ye sahip olmamalıdır.
- Faj içermeyen kolonilerin büyümesine izin vermek için plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Her iki plakadan koloniler toplayın ve bunları 37 ° C'de 5 mL LB'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile gece boyunca kültürleri büyütmek için kullanın.
- Toplam kültür hacminin 4.5 mL'sini kullanarak DNA miniprep ile bu kültürlerden DNA'yı izole edin.
- 35 μL nükleaz içermeyen su kullanarak DNA'yı güçlendirin.
- Elde edilen konsantrasyonu Nanodrop ile ölçün. Saf DNA, yaklaşık 1.8'lik bir absorbans oranı (A260/280) üretecektir.
- %100 gliserol ve bakteri kültürünün 1:1 karışımını yaparak 1 mL gliserol stokları hazırlamak için her kültürün kalan 0,5 mL'sini kullanın.
- Bakteriyel gliserol stoklarını -80 °C'de saklayın.
3. Veri Analizi ve Sonuçları
- qPCR ile transdüksiyonun doğrulanması
- Altı qPCR reaksiyonu için iki qPCR ana karışımı hazırlayın, üçü ampisilin direnç geni için qPCR primerleri kullanarak ve diğer üçü bir temizlik geni için qPCR primerleri kullanarak (reaksiyon başına 14.5 μL): 12.5 μL qPCR tampon karışımı + 1 μL ileri astar + 1 μL ters astar.
- Bu deneyde SYBR Green master mix kullandık.
- Temizlik gen primerleri, DNA giraz B'yi kodlayan bakteri geni içindeki bir DNA segmentini amplifiye etmek için tasarlanmıştır (7).
- Her qPCR reaksiyonu için, her reaksiyondan (10.5 μL) 100 μg DNA'yı 14.5 μL qPCR ana karışımı ile birleştirin.
- Bir qPCR makinesi ve Tablo 1'de listelenen termosiklasyon protokolü kullanılarak, altı reaksiyonun tümü için ampisilin direnci ve temizlik genleri için amplifikasyon ölçüldü.
- qPCR tarafından üretilen Cq değerleri, ampisilin direnç geninin normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliğini hesaplamak için kullanıldı (Şekil 3), bu da ampisilin direnç geninin başarılı transdüksiyonunu doğruladı.
- Bir numunenin Cq değeri veya döngü niceleme değeri, arka plan eşiğini aşan bir sinyalin tespit edildiği en eski PCR döngü numarasıdır. Düşük Cq değerleri daha fazla hedef diziye karşılık gelir, bunun tersi de geçerlidir.
- Bir örnek içindeki bir genin normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliği, bu Cq değerleri kullanılarak, temizlik geninin değerinin hedef geninkinden çıkarılması ve normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliğini 2(-ΔCq) ile hesaplamak için kullanılabilecek bir ΔCq değeri üretilmesiyle hesaplanabilir.
- Altı qPCR reaksiyonu için iki qPCR ana karışımı hazırlayın, üçü ampisilin direnç geni için qPCR primerleri kullanarak ve diğer üçü bir temizlik geni için qPCR primerleri kullanarak (reaksiyon başına 14.5 μL): 12.5 μL qPCR tampon karışımı + 1 μL ileri astar + 1 μL ters astar.
| Sıcaklık | Zaman | |
| Denatürasyon | 94 °C | 2 dk |
| 40 döngü: | ||
| Denatürasyon | 94 °C | 15 sn |
| Tavlama, uzatma ve floresan okuma | 60 °C veya en düşük astar Tm | 1 dk |
Tablo 1: qPCR Termosiklasyon Protokolü
Kaynak: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Boston Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ulusal Yeni Ortaya Çıkan Enfeksiyon H…
1. Kurulum
- Mikropları içeren herhangi bir çalışmaya başlamadan önce, çalışma alanını %70 etanol kullanarak sterilize edin. Daima gerekli KKD'yi (laboratuvar önlüğü ve eldiven) kullanın.
- 1x ampisilin, piyasada bulunan P1 faj lizat solüsyonu, kloroform, 1 M sodyum sitrat, gliserol ve bir kutu önceden sterilize edilmiş plastik pipet uçları ve hücre yayıcılar içeren LB agar plakalarının elinizin altında olduğundan emin olun.
- Otoklavlama ile steril LB hazırlayın ve üç adet 1 mL LB tuzu çözeltisi yapmak için kullanın.
- mM MgCl2 (952.11-2.3803 μg), 5 mM CaCl2 (11.098 mg), %0.1-0.2 glikoz (100-200 μg)
- mM MgSO4 (12.0366 mg), 5 mM CaCl2 (11.098 mg)
- mM sodyum sitrat (25.806 mg)
- Bitirdikten sonra, tüm yüzeyleri ve eldivenleri %70 etanol ile sterilize edin ve ellerinizi yıkayın.
2. Protokol
- Donör Faj Lizat Hazırlığı
- 1 mL'lik bir donör W3110 suşu kültürü hazırlayın E. coli LB'de, gece boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütülen 1x ampisilin ile.
- Bu gece boyunca 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 ve% 0.1-0.2 glikoz ile desteklenmiş 1 mL taze LB'de 1:100 oranında seyreltin.
- Bu bakteri seyreltmesini 37 °C'de 2 saat boyunca 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütün.
- Bu hücreler erken logaritmik büyüme fazına ulaştığında (gözle görülür büyüme ve hafif bulanıklık), piyasada bulunan 40 μL P1 faj ekleyin ve 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile 37 °C'de bırakın.
- Faj ilavesinden önce, bu hücrelerin 600 nm'de ölçülen optik yoğunluğu yaklaşık 0.4 olmalıdır (6).
- Kültür parçalanana kadar hücreleri 1-3 saat izleyin.
- Lizis, hücresel döküntülerin artmasına ve bulanıklıkta kayda değer bir azalmaya neden olacaktır (yani, kültürün içini görebildiğinde hücreler parçalanmış olarak kabul edilecektir).
- Lisata birkaç damla (50-100 μL) kloroform ekleyin ve girdap ile karıştırın.
- Kloroform, kalan donör hücreleri öldürerek, sadece faj bırakarak ve bu lizatın titresini artırarak faj lizatını sterilize eder.
- Kalıntıları temizlemek ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarmak için lizatı 14.000 rpm'de 2 dakika santrifüjleyin.
- Birkaç damla kloroform ekleyin ve bir günden fazla olmamak üzere 4 ° C'de saklayın.
- Transdüksiyon
- 1 mL'lik bir alıcı J53 suşu E. coli kültürü hazırlayın ve gece boyunca LB'de 37 ° C'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütülür.
- 100 μL donör faj lizatını (2.1) 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca kapak açık olarak inkübe edin.
- Bu inkübasyon, P1 lizat çözeltisinde kalan herhangi bir kloroformun, alıcı hücrelere eklenmeden önce buharlaşmasına izin verir.
- Alıcı, suş hücrelerini 6.000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyerek nazikçe pelet haline getirin.
- Bu hücreleri 100 mM MgSO4 ve 5 mM CaCl2 içeren 300 μL taze LB içinde yeniden süspanse edin. (P1 fajının bulaşıcı olması için kalsiyuma ihtiyacı vardır).
- Alıcı bakteri hücrelerini ve hazırlanmış donör faj lizatını kullanarak iki reaksiyon oluşturun: 1) 100 μL alıcı J53 suşu E. coli ve 100 μL donör faj lizatını birleştiren transdüksiyon reaksiyonu ve 2) 100 μL alıcı J53 suşu E. coli ve 100 μL LB'yi birleştiren negatif kontrol 100 mM MgSO4 ve 5 mM CaCl2.
- 37 °C'de 30 dakika inkübe edin ve 220 rpm'de çalkalayın.
- 1 mL LB ve 200 μL 1M sodyum sitrat (pH = 5.5) ekleyin ve 220 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Sitrat, kalsiyum ile şelatlayarak P1'in enfektivitesini azaltmak ve alıcı bakterilerin parçalanmasını önlemek için kullanılır.
- Bu çözeltinin inkübasyonu, ampisilin direnç markörünün ekspresyonuna izin verir.
- 5 dakika boyunca 6.000 rpm'de santrifüjleme ile pelet hücreleri.
- Hücre peletlerini 100 μL LB içinde 100 mM sodyum sitrat (pH 5.5) ile yeniden süspanse edin. İki LB agar plakası üzerinde her iki reaksiyon için vorteks ve plaka tam çözeltisi.
- LB plakası, aktarılan numune için 1x Amp'ye sahip olmalı ve negatif kontrol için Amp'ye sahip olmamalıdır.
- Bu plakadaki P1 faj kontaminasyonu, dondurucu stokları hazırlanmadan önce yeniden çizgilenmeyi gerektirir.
- Faj uzaklaştırılmazsa, bu kolonilerden yetiştirilen kültürler, bir kalsiyum şelatörü bulunmadıkça büyümez.
- Her iki plakadan yaklaşık 3-4 koloni toplayın ve 100 μL 1 M sodyum sitrat (pH = 5.5) ile yayılmış iki LB agar plakası üzerinde tekrar çizin.
- LB plakası, aktarılan numune için 1x Amp'ye sahip olmalı ve negatif kontrol için Amp'ye sahip olmamalıdır.
- Faj içermeyen kolonilerin büyümesine izin vermek için plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Her iki plakadan koloniler toplayın ve bunları 37 ° C'de 5 mL LB'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile gece boyunca kültürleri büyütmek için kullanın.
- Toplam kültür hacminin 4.5 mL'sini kullanarak DNA miniprep ile bu kültürlerden DNA'yı izole edin.
- 35 μL nükleaz içermeyen su kullanarak DNA'yı güçlendirin.
- Elde edilen konsantrasyonu Nanodrop ile ölçün. Saf DNA, yaklaşık 1.8'lik bir absorbans oranı (A260/280) üretecektir.
- %100 gliserol ve bakteri kültürünün 1:1 karışımını yaparak 1 mL gliserol stokları hazırlamak için her kültürün kalan 0,5 mL'sini kullanın.
- Bakteriyel gliserol stoklarını -80 °C'de saklayın.
3. Veri Analizi ve Sonuçları
- qPCR ile transdüksiyonun doğrulanması
- Altı qPCR reaksiyonu için iki qPCR ana karışımı hazırlayın, üçü ampisilin direnç geni için qPCR primerleri kullanarak ve diğer üçü bir temizlik geni için qPCR primerleri kullanarak (reaksiyon başına 14.5 μL): 12.5 μL qPCR tampon karışımı + 1 μL ileri astar + 1 μL ters astar.
- Bu deneyde SYBR Green master mix kullandık.
- Temizlik gen primerleri, DNA giraz B'yi kodlayan bakteri geni içindeki bir DNA segmentini amplifiye etmek için tasarlanmıştır (7).
- Her qPCR reaksiyonu için, her reaksiyondan (10.5 μL) 100 μg DNA'yı 14.5 μL qPCR ana karışımı ile birleştirin.
- Bir qPCR makinesi ve Tablo 1'de listelenen termosiklasyon protokolü kullanılarak, altı reaksiyonun tümü için ampisilin direnci ve temizlik genleri için amplifikasyon ölçüldü.
- qPCR tarafından üretilen Cq değerleri, ampisilin direnç geninin normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliğini hesaplamak için kullanıldı (Şekil 3), bu da ampisilin direnç geninin başarılı transdüksiyonunu doğruladı.
- Bir numunenin Cq değeri veya döngü niceleme değeri, arka plan eşiğini aşan bir sinyalin tespit edildiği en eski PCR döngü numarasıdır. Düşük Cq değerleri daha fazla hedef diziye karşılık gelir, bunun tersi de geçerlidir.
- Bir örnek içindeki bir genin normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliği, bu Cq değerleri kullanılarak, temizlik geninin değerinin hedef geninkinden çıkarılması ve normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliğini 2(-ΔCq) ile hesaplamak için kullanılabilecek bir ΔCq değeri üretilmesiyle hesaplanabilir.
- Altı qPCR reaksiyonu için iki qPCR ana karışımı hazırlayın, üçü ampisilin direnç geni için qPCR primerleri kullanarak ve diğer üçü bir temizlik geni için qPCR primerleri kullanarak (reaksiyon başına 14.5 μL): 12.5 μL qPCR tampon karışımı + 1 μL ileri astar + 1 μL ters astar.
| Sıcaklık | Zaman | |
| Denatürasyon | 94 °C | 2 dk |
| 40 döngü: | ||
| Denatürasyon | 94 °C | 15 sn |
| Tavlama, uzatma ve floresan okuma | 60 °C veya en düşük astar Tm | 1 dk |
Tablo 1: qPCR Termosiklasyon Protokolü
Bakteriler, genetik materyal alışverişinde bulunarak hızla değişen bir ortama hızlı bir şekilde adapte olabilirler ve bunu yapabilmelerinin bir yolu, bakteriyel virüslerin aracılık ettiği genetik materyal alışverişi olan transdüksiyondur. Genellikle faj olarak kısaltılan bir bakteriyofaj, önce konakçının yüzeyine yapışarak ve daha sonra DNA'sını bakteri hücresine enjekte ederek bakterileri enfekte eden bir virüs türüdür. Daha sonra konakçı hücrenin kendi DNA'sını bozar ve viral genomunu kopyalarken, proteinlerinin birçok kopyasını sentezlemek için hücrenin mekanizmasını ele geçirir. Bu faj proteinleri daha sonra çoklu döller oluşturmak için faj genomlarını kendi kendine bir araya getirir ve paketler. Bununla birlikte, DNA paketleme mekanizmasının düşük doğruluğu nedeniyle, bazen faj, bakteri DNA'sının parçalarını faj kapsidine paketler. Konağın parçalanmasını indükledikten sonra, faj dölleri serbest bırakılır ve böyle bir faj başka bir konakçı hücreyi enfekte ettiğinde, önceki konakçısının DNA fragmanını aktarır. Bu daha sonra yeniden birleşebilir ve yeni konakçının kromozomuna kalıcı olarak dahil edilebilir, böylece iki bakteri arasındaki gen transferine aracılık eder.
Laboratuvarda faj transdüksiyonunu gerçekleştirmek için, ilgilenilen bir geni içeren bir donör suşu, ondan yoksun bir alıcı suşu, her iki suşu da enfekte edebilen bir faj ve transdüksiyonu seçmek için bir yöntem gerekir. Çoğu durumda, bu, transdüksiyona uğrayan bakterilerin büyümesini destekleyen, ancak transdüksiyona uğramamış olanların büyümesini engelleyen seçici bir katı büyüme ortamı olacaktır. Başlamak için, ilgilenilen geni içeren donör suşu, sıvı bir büyüme ortamında kültürlenir. Tüm bakteriler büyümelerinin log aşamasında aktif olarak bölünürken, kültür hedef faj ile aşılanır. Üç ila dört saatlik inkübasyondan sonra, neredeyse tüm bakteriler faj parçacıklarını parçalayıp serbest bıraktığında, donör faj lizatı, alıcı bakteri suşunun taze yetiştirilmiş bir kültürüne aşılanır. Bir saatlik kısa bir inkübasyondan sonra, kültür şimdi dönüştürülmüş ve dönüştürülmemiş bakteri hücrelerinin bir karışımını içermelidir ve bu, süspansiyonun bir kısmını uygun bir seçici katı büyüme ortamına yayarak dönüştürülmüş hücreler için taranır. Daha fazla inkübasyondan sonra, dönüştürülen hücreler görünür koloniler elde etmek için büyümeli ve çoğalmalıdır. Bu koloniler daha sonra koloni PCR, DNA dizilimi veya kantitatif PCR gibi başarılı transdüksiyonu daha fazla doğrulamak için çeşitli yöntemler kullanılarak daha fazla analiz için seçilebilir.
Prosedüre başlamadan önce, laboratuvar önlüğü ve eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanı giyin. Ardından, çalışma alanını% 70 etanol ile sterilize edin ve yüzeyi silin.
Bundan sonra, üç adet bir mililitrelik LB tuz çözeltisi hazırlayın. Şimdi, 500 mikrogram ampisilin ile beş mililitre LB büyüme ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir şişeye 100 mikrolitre E. coli ekleyerek bir donör suş kültürü hazırlayın. Ardından, kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütün. Ertesi gün, kültürü çalkalama inkübatöründen çıkarmadan önce tezgah üstünü %70 etanol ile silin. Daha sonra, tuz çözeltisi ile takviye edilmiş 990 mikrolitre taze LB'ye 10 mikrolitre donör suşu ekleyerek gece boyunca kültürü bir ila 100 oranında seyreltin.
Bakteri seyreltmesinin 37 santigrat derecede iki saat boyunca 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyümesine izin verin. Hücreler erken log fazına ulaştığında, kültürü inkübatörden çıkarın, kültüre 40 mikrolitre P1 faj ekleyin ve tekrar inkübe edin. Kültür parçalanana kadar hücreleri bir ila üç saat izlemeye devam edin. Daha sonra, lizata 50 ila 100 mikrolitre kloroform ekleyin ve girdaplama ile karıştırın. Ardından, kalıntıları gidermek için lizatı santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Süpernatana birkaç damla kloroform ekleyin ve bir günden fazla olmamak üzere dört santigrat derecede saklayın.
Transdüksiyon prosedürüne başlamak için, bir mililitrelik bir alıcı suşu kültürü elde edin. Daha sonra, 100 mikrolitre donör faj lizatını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve kalan kloroformun buharlaşmasına izin vermek için kapak 30 dakika açıkken 37 santigrat derecede inkübe edin. Donör faj lizatı kuluçkaya yatırılırken, alıcı suş hücrelerini nazik santrifüjleme yoluyla peletleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 100 milimolar magnezyum sülfat ve beş milimolar kalsiyum klorür içeren 300 mikrolitre taze LB içinde yeniden süspanse edin.
Daha sonra, 100 mikrolitre alıcı suşu ve 100 mikrolitre donör faj lizatını bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek transdüksiyon reaksiyonunu ayarlayın. Ardından, 100 mikrolitre alıcı suşunu ve 100 mikrolitre LB'yi magnezyum sülfat ve kalsiyum klorür ile birleştirerek negatif kontrolü ayarlayın. İnkübasyondan sonra, her iki tüpe 200 mikrolitre bir molar sodyum sitrat ve bir mililitre LB ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra, tüpler bir saat inkübe edildikten sonra, hücreleri santrifüjleme yoluyla nazikçe peletleyin.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve peletlenmiş hücreleri 100 milimolar sodyum sitrat ile 100 mikrolitre LB içinde yeniden süspanse edin. Çözeltileri vorteksleyin ve dönüştürülen tüm numuneyi 1X ampisilin içeren bir LB agar plakasına pipetleyin. Son olarak, negatif kontrol hücresi karışımının tüm hacmini ampisilin içermeyen bir LB agar plakasına pipetleyin. Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, transdüksiyon plakasından üç ila dört koloni almak için steril bir pipet ucu kullanın ve bunları 1X ampisilin ve 100 mikrolitre bir molar sodyum sitrat içeren yeni bir LB agar plakasına sürün. Sadece 100 mikrolitre bir molar sodyum sitrat içeren başka bir LB agar plakasında negatif kontrol için bu kaplama yöntemini tekrarlayın. Ardından, faj içermeyen kolonilerin büyümesine izin vermek için plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, tabaklarınızı kuluçka makinesinden çıkarmadan önce tezgah üstünü %70 etanol ile silin. Steril bir pipet ucu kullanarak, transdüksiyon plakasından üç koloni seçin ve her birini beş mililitre LB ortamı içeren ayrı bir tüpe ekleyin. Ardından, negatif kontrol plakasından üç koloni seçin ve bunları beş mililitre LB ortamı içeren başka bir tüpe ekleyin. Kültürleri gece boyunca 37 santigrat derecede 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütün. Tezgah üstünü daha önce gösterildiği gibi sterilize ettikten sonra, üreticinin talimatlarına göre her kültürün 4,5 mililitresinden DNA'yı izole etmek için bir DNA mini hazırlık kiti kullanın. Ardından, DNA'yı 35 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile elüte edin ve elde edilen konsantrasyonu laboratuvar spektrofotometresi ile ölçün. Son olarak, her iki bakteri çözeltisinden kalan 0,5 mililitreyi 0,5 mililitre %100 gliserole ekleyerek gliserol stoklarını hazırlayın.
Transdüksiyonu doğrulamak için önce 24 qPCR reaksiyonu için iki qPCR ana karışımı hazırlayın. İlk ana karışım için, bir mikrosantrifüj tüpüne 150 mikrolitre qPCR tampon karışımı ve ampisilin direnç genini amplifiye etmek için tasarlanmış bir ileri ve geri primerin her birine 12 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, bir mikrosantrifüj tüpüne 150 mikrolitre qPCR ana karışımı ekleyerek ve ardından bir temizlik genini çoğaltmak için tasarlanmış bir ileri astar ve ters astarın her birine 12 mikrolitre ekleyerek ikinci bir qPCR ana karışımı hazırlayın.
Her qPCR reaksiyonu için, her reaksiyondan 100 mikrogram deneysel DNA'yı 14.5 mikrolitre qPCR ana karışımı ile birleştirin. Şimdi, kalan reaksiyonları daha önce gösterildiği gibi hazırlayın. Reaksiyonları önceden 94 santigrat dereceye ısıtılmış bir termodöngüleyiciye aktarın ve ardından programı başlatın. Son olarak, ampisilin direnç geninin normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliğini hesaplamak için qPCR tarafından üretilen döngü nicelemesi veya Cq değerlerini kullanın.
İlgilenilen genler için döngü kantitasyonu veya Cq değerleri, negatif kontrollerin ve transdüksiyonlu örneklerin her biri için tablo haline getirildi. Bu örnekteki transdüksiyonlu numuneler gibi, tipik olarak 29 döngünün altındaki düşük Cq değerleri, hedef dizinin yüksek miktarlarını gösterir.
Burada da tablo halinde verilen bir temizlik geni, her reaksiyondaki DNA miktarını normalleştirmek için bir yükleme kontrolü olarak ve qPCR'nin çalıştığından emin olmak için pozitif bir kontrol olarak kullanılır. Temizlik geninin aynı miktarlarının yüklenmesi şartıyla, her örnekte nispeten aynı oranda bulunur.
Daha sonra, her numune için delta Cq değerini hesaplamak için, her numune için temizlik geninin Cq değerini, karşılık gelen hedef genin Cq değerinden çıkarın. Örneğin, ilk negatif kontrolün delta Cq'si 13.54'tür. Ardından, burada gösterilen formülü kullanarak her bir numunenin normalleştirilmiş iletim verimliliğini hesaplamak için bu değeri kullanın. Son olarak, her bir numune grubu için ortalama normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliği hesaplanabilir.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does a bacteriophage transfer DNA between bacterial cells?
A bacteriophage attaches to a bacterial cell surface and injects its DNA, then replicates its genome while hijacking the host's machinery. Due to low-fidelity DNA packaging, the phage occasionally packages bacterial DNA fragments into its capsid. When this phage infects another cell, it transfers the bacterial DNA, which can recombine and integrate into the new host's chromosome, mediating gene transfer between bacteria.
Q2: What are the key requirements for performing phage transduction in the laboratory?
Phage transduction requires a donor strain containing the gene of interest, a recipient strain lacking it, a phage capable of infecting both strains, and a selective growth media that supports transduced bacteria while inhibiting non-transduced ones. The selective media is essential for screening and identifying which bacterial cells successfully received the transferred genetic material.
Q3: Why is chloroform added to the phage lysate during preparation?
Chloroform is added to the phage lysate to inhibit bacterial growth and preserve the phage particles. After centrifugation removes debris, the supernatant containing phage is treated with chloroform and stored at four degrees Celsius for no more than one day, ensuring the phage remains viable for the transduction procedure.
Q4: What role do magnesium sulfate and calcium chloride play in transduction?
Magnesium sulfate and calcium chloride are added to the recipient strain suspension to enhance phage attachment and DNA transfer efficiency. These divalent cations stabilize the phage-bacterial cell interaction, increasing the likelihood of successful transduction by promoting optimal conditions for DNA uptake by recipient cells.
Q5: How does qPCR confirm successful transduction of the ampicillin resistance gene?
qPCR measures cycle quantification (Cq) values for the ampicillin resistance gene and a housekeeping gene. Low Cq values below 29 cycles indicate high target sequence amounts in transduced samples. Delta Cq values normalize results against the housekeeping gene, and normalized transduction efficiency is calculated to confirm the gene transfer occurred in recipient cells.
Q6: What is the purpose of the negative control in phage transduction experiments?
The negative control combines recipient strain with LB medium containing magnesium sulfate and calcium chloride, but without phage lysate. This control undergoes identical steps as the transduction reaction, allowing researchers to verify that any ampicillin resistance detected in transduced samples resulted from phage-mediated gene transfer, not contamination or spontaneous resistance.
Q7: Why is sodium citrate used during the transduction procedure?
Sodium citrate is added after the one-hour incubation period to chelate divalent cations and halt phage-mediated DNA transfer. This stops the transduction reaction at a defined time point, preventing continued gene transfer and allowing researchers to accurately assess the efficiency of the transduction event that occurred during the incubation window.
Bu videodaki bölümler
0:02
Concepts
3:01
Preparation of Donor Phage Lysate
4:50
Transduction
8:39
Data Analysis by Quantitative Polymerase Chain Reaction
10:01
Results