Faj Transdüksiyonu: Ampisilin Direncini Donörden Alıcıya Aktarmak İçin Bir Yöntem E. coli

1. Kurulum

1. Mikropları içeren herhangi bir çalışmaya başlamadan önce, çalışma alanını %70 etanol kullanarak sterilize edin. Daima gerekli KKD'yi (laboratuvar önlüğü ve eldiven) kullanın.
2. 1x ampisilin, piyasada bulunan P1 faj lizat solüsyonu, kloroform, 1 M sodyum sitrat, gliserol ve bir kutu önceden sterilize edilmiş plastik pipet uçları ve hücre yayıcılar içeren LB agar plakalarının elinizin altında olduğundan emin olun.
3. Otoklavlama ile steril LB hazırlayın ve üç adet 1 mL LB tuzu çözeltisi yapmak için kullanın.
   1. mM MgCl₂ (952.11-2.3803 μg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg), %0.1-0.2 glikoz (100-200 μg)
   2. mM MgSO₄ (12.0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg)
   3. mM sodyum sitrat (25.806 mg)
4. Bitirdikten sonra, tüm yüzeyleri ve eldivenleri %70 etanol ile sterilize edin ve ellerinizi yıkayın.

2. Protokol

1. Donör Faj Lizat Hazırlığı
   1. 1 mL'lik bir donör W3110 suşu kültürü hazırlayın E. coli LB'de, gece boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütülen 1x ampisilin ile.
   2. Bu gece boyunca 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂ ve% 0.1-0.2 glikoz ile desteklenmiş 1 mL taze LB'de 1:100 oranında seyreltin.
   3. Bu bakteri seyreltmesini 37 °C'de 2 saat boyunca 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütün.
   4. Bu hücreler erken logaritmik büyüme fazına ulaştığında (gözle görülür büyüme ve hafif bulanıklık), piyasada bulunan 40 μL P1 faj ekleyin ve 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile 37 °C'de bırakın.
      1. Faj ilavesinden önce, bu hücrelerin 600 nm'de ölçülen optik yoğunluğu yaklaşık 0.4 olmalıdır (6).
   5. Kültür parçalanana kadar hücreleri 1-3 saat izleyin.
      1. Lizis, hücresel döküntülerin artmasına ve bulanıklıkta kayda değer bir azalmaya neden olacaktır (yani, kültürün içini görebildiğinde hücreler parçalanmış olarak kabul edilecektir).
   6. Lisata birkaç damla (50-100 μL) kloroform ekleyin ve girdap ile karıştırın.
      1. Kloroform, kalan donör hücreleri öldürerek, sadece faj bırakarak ve bu lizatın titresini artırarak faj lizatını sterilize eder.
   7. Kalıntıları temizlemek ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarmak için lizatı 14.000 rpm'de 2 dakika santrifüjleyin.
   8. Birkaç damla kloroform ekleyin ve bir günden fazla olmamak üzere 4 ° C'de saklayın.
2. Transdüksiyon
   1. 1 mL'lik bir alıcı J53 suşu E. coli kültürü hazırlayın ve gece boyunca LB'de 37 ° C'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile büyütülür.
   2. 100 μL donör faj lizatını (2.1) 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca kapak açık olarak inkübe edin.
      1. Bu inkübasyon, P1 lizat çözeltisinde kalan herhangi bir kloroformun, alıcı hücrelere eklenmeden önce buharlaşmasına izin verir.
   3. Alıcı, suş hücrelerini 6.000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyerek nazikçe pelet haline getirin.
   4. Bu hücreleri 100 mM MgSO₄ ve 5 mM CaCl₂ içeren 300 μL taze LB içinde yeniden süspanse edin. (P1 fajının bulaşıcı olması için kalsiyuma ihtiyacı vardır).
   5. Alıcı bakteri hücrelerini ve hazırlanmış donör faj lizatını kullanarak iki reaksiyon oluşturun: 1) 100 μL alıcı J53 suşu E. coli ve 100 μL donör faj lizatını birleştiren transdüksiyon reaksiyonu ve 2) 100 μL alıcı J53 suşu E. coli ve 100 μL LB'yi birleştiren negatif kontrol 100 mM MgSO₄ ve 5 mM CaCl₂.
   6. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin ve 220 rpm'de çalkalayın.
   7. 1 mL LB ve 200 μL 1M sodyum sitrat (pH = 5.5) ekleyin ve 220 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
      1. Sitrat, kalsiyum ile şelatlayarak P1'in enfektivitesini azaltmak ve alıcı bakterilerin parçalanmasını önlemek için kullanılır.
      2. Bu çözeltinin inkübasyonu, ampisilin direnç markörünün ekspresyonuna izin verir.
   8. 5 dakika boyunca 6.000 rpm'de santrifüjleme ile pelet hücreleri.
   9. Hücre peletlerini 100 μL LB içinde 100 mM sodyum sitrat (pH 5.5) ile yeniden süspanse edin. İki LB agar plakası üzerinde her iki reaksiyon için vorteks ve plaka tam çözeltisi.
      1. LB plakası, aktarılan numune için 1x Amp'ye sahip olmalı ve negatif kontrol için Amp'ye sahip olmamalıdır.
      2. Bu plakadaki P1 faj kontaminasyonu, dondurucu stokları hazırlanmadan önce yeniden çizgilenmeyi gerektirir.
      3. Faj uzaklaştırılmazsa, bu kolonilerden yetiştirilen kültürler, bir kalsiyum şelatörü bulunmadıkça büyümez.
   10. Her iki plakadan yaklaşık 3-4 koloni toplayın ve 100 μL 1 M sodyum sitrat (pH = 5.5) ile yayılmış iki LB agar plakası üzerinde tekrar çizin.
       1. LB plakası, aktarılan numune için 1x Amp'ye sahip olmalı ve negatif kontrol için Amp'ye sahip olmamalıdır.
   11. Faj içermeyen kolonilerin büyümesine izin vermek için plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   12. Her iki plakadan koloniler toplayın ve bunları 37 ° C'de 5 mL LB'de 220 rpm'de havalandırma ve çalkalama ile gece boyunca kültürleri büyütmek için kullanın.
   13. Toplam kültür hacminin 4.5 mL'sini kullanarak DNA miniprep ile bu kültürlerden DNA'yı izole edin.
       1. 35 μL nükleaz içermeyen su kullanarak DNA'yı güçlendirin.
       2. Elde edilen konsantrasyonu Nanodrop ile ölçün. Saf DNA, yaklaşık 1.8'lik bir absorbans oranı (A_260/280) üretecektir.
   14. %100 gliserol ve bakteri kültürünün 1:1 karışımını yaparak 1 mL gliserol stokları hazırlamak için her kültürün kalan 0,5 mL'sini kullanın.
   15. Bakteriyel gliserol stoklarını -80 °C'de saklayın.

3. Veri Analizi ve Sonuçları

1. qPCR ile transdüksiyonun doğrulanması
   1. Altı qPCR reaksiyonu için iki qPCR ana karışımı hazırlayın, üçü ampisilin direnç geni için qPCR primerleri kullanarak ve diğer üçü bir temizlik geni için qPCR primerleri kullanarak (reaksiyon başına 14.5 μL): 12.5 μL qPCR tampon karışımı + 1 μL ileri astar + 1 μL ters astar.
      1. Bu deneyde SYBR Green master mix kullandık.
      2. Temizlik gen primerleri, DNA giraz B'yi kodlayan bakteri geni içindeki bir DNA segmentini amplifiye etmek için tasarlanmıştır (7).
   2. Her qPCR reaksiyonu için, her reaksiyondan (10.5 μL) 100 μg DNA'yı 14.5 μL qPCR ana karışımı ile birleştirin.
   3. Bir qPCR makinesi ve Tablo 1'de listelenen termosiklasyon protokolü kullanılarak, altı reaksiyonun tümü için ampisilin direnci ve temizlik genleri için amplifikasyon ölçüldü.
   4. qPCR tarafından üretilen Cq değerleri, ampisilin direnç geninin normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliğini hesaplamak için kullanıldı (Şekil 3), bu da ampisilin direnç geninin başarılı transdüksiyonunu doğruladı.
      1. Bir numunenin Cq değeri veya döngü niceleme değeri, arka plan eşiğini aşan bir sinyalin tespit edildiği en eski PCR döngü numarasıdır. Düşük Cq değerleri daha fazla hedef diziye karşılık gelir, bunun tersi de geçerlidir.
      2. Bir örnek içindeki bir genin normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliği, bu Cq değerleri kullanılarak, temizlik geninin değerinin hedef geninkinden çıkarılması ve normalleştirilmiş transdüksiyon verimliliğini 2^(-ΔCq) ile hesaplamak için kullanılabilecek bir ΔCq değeri üretilmesiyle hesaplanabilir.

	Sıcaklık	Zaman
Denatürasyon	94 °C	2 dk
40 döngü:
Denatürasyon	94 °C	15 sn
Tavlama, uzatma ve floresan okuma	60 °C veya en düşük astar Tm	1 dk

Tablo 1: qPCR Termosiklasyon Protokolü