$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tipik olarak, yeni mRNA'larda tam dizisinin sadece bir kısmı bilinir. mRNA'nın uçlarındaki eksik nükleotid dizileri, cDNA Uçlarının Hızlı Amplifikasyonu veya RACE adı verilen PCR tabanlı bir yöntem kullanılarak belirlenebilir.
Ökaryotlarda, olgun mRNA'lar her iki uçta da belirgin yapısal özelliklere sahiptir. Beş asal uçta, çoğu, beş asal ila beş asal trifosfat bağı yoluyla mRNA'ya bağlı metillenmiş bir guanozin kalıntısına sahiptir. Bu aynı zamanda beş asal başlık olarak da bilinir. Üç asal uçta, çoğu ökaryot, poli(A) kuyruğu adı verilen 20 ila 250 adenilat kalıntısından oluşan bir kuyruğa sahiptir.
Şimdi, küçük bir segmentin bile nükleotid dizisi mRNA'nın herhangi bir yerinde biliniyorsa, üç asal ucuna kadar olan dizi, gene özgü bir primer ve üç asal uçta poli(A) kuyruğuna tavlanan spesifik olmayan bir oligo(dT) primer kullanılarak amplifiye edilebilir. RACE tekniğinin bu alt kümesine üç asal RACE denir ve transkript varyantlarının ve farklı üç asal Çevrilmemiş Bölgelerin veya UTR'lerin saptanmasına izin verir.
Beş asal uçtaki dizi benzer şekilde yükseltilebilir. Bunu yapmak için, önce beş asal uca bir poli(A) kuyruğu eklenir. Daha sonra, eklenen kuyruğa tavlanan spesifik olmayan bir oligo (dT) primer ve gene özgü bir primer kullanılarak, beş asal uca kadar olan dizi amplifiye edilebilir. RACE'in bu alt kümesi, beş asal RACE olarak bilinir ve diferansiyel beş asal ek varyantlarını ve alternatif beş asal UTR'leri bulmak için kullanılır.
Belirli bir gen tarafından kodlanan farklı transkriptleri tanımlamak için üç asal RACE gerçekleştirmek için, RNA önce ilgilenilen organizma veya dokudan izole edilir. Daha sonra, cDNA, bir oligo(dT) primer ve bir RNA şablonundan tamamlayıcı DNA üreten bir ters transkriptaz enzimi kullanan bir ters transkripsiyon reaksiyonu ile izole edilmiş mRNA'lardan sentezlenir. Daha sonra, üretilen cDNA havuzundan, hedef cDNA'nın bilinmeyen üç asal ucu, spesifik olmayan oligo(dT) primer ve gene özgü bir primer kullanılarak PCR yoluyla uzatılır ve PCR reaksiyonu sırasında amplifiye edilir.
Bununla birlikte, spesifik olmayan primerin jenerik doğası ve gene özgü primer tarafından rastgele yanlış astarlama nedeniyle, hedef dışı cDNA'lara tavlanabilirler ve bu da onların da amplifiye olmasına neden olabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, ilk primer setinin aşağı akışına bağlanan iç içe geçmiş primerler kullanılarak ikinci bir PCR turu gerçekleştirilir. Bu ikinci primer seti, ilgilenilen cDNA'yı daha da çoğaltır, ancak spesifik olmayan ürünü değil, reaksiyonun özgüllüğünü ve verimini arttırır.
Son olarak, PCR ürünleri, hedef genin farklı transkriptlerini boyutlarına göre ayıran ve farklı bantlar üreten agaroz jel elektroforezi kullanılarak ayrılır. İlgilenilen bant daha sonra eksize edilebilir, saflaştırılabilir ve son olarak transkriptin tam dizisini elde etmek için sıralanabilir.
Bu videoda, Drosophila dSmad2 geni tarafından kodlanan farklı transkriptleri tanımlamak ve izole etmek için üç asal RACE tekniğini göstereceğiz.
cDNA'nın sentezine ve amplifikasyonuna başlamadan önce, bu örnekte ilgilenilen gen olan dSmad2 için beş asal spesifik bir primer oluşturmak için bir primer tasarım yazılımı kullanın. Astarın oldukça spesifik olmasını sağlamak için, yaklaşık 24 nükleotid olmalı ve 55 ila 65 santigrat derece arasında değişen bir Tm'ye sahip olmalıdır. Ardından, ilk astarın üç asalında bulunan ve aynı zamanda hedef diziye özgü olan ikinci bir iç içe astar tasarlayın.
Başlamak için, piyasada bulunan bir RNA ekstraksiyon kiti ile 10 tam yetişkin sinekten RNA'yı çıkarın. RNA ekstrakte edildikten sonra, peleti 20 mikrolitre nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. 50 mikrolitrelik bir reaksiyon için, her numune tüpüne 5 mikrolitre reaksiyon tamponu ekleyin ve 24 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyerek reaksiyonun hacmini artırın. Ardından, genomik DNA'nın amplifikasyonunu önlemek için 1 mikrolitre DNaz I ekleyin. Son olarak, numuneleri 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.
DNaz işleminden sonra, enzimi tüplerin her birinde 1 mikrolitre 25 milimolar EDTA ile inaktive edin. RNA'yı saflaştırmak için numuneyi bir spin sütununa ekleyin. Ardından, RNA konsantrasyonunu ölçmek için bir mikro hacim spektrofotometresi kullanın. Nükleaz içermeyen su ekleyerek konsantrasyonu mikrolitre başına 100 nanograma ayarlayın.
Şimdi, ters transkripsiyon reaksiyonu için bir ana karışım hazırlayın. Test DNA örneklerine ek olarak, uygun tüpten ters transkriptazı atlayarak bir negatif kontrol ekleyin. Reaksiyonları 42 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. Ardından, tüpleri beş dakika boyunca 85 santigrat derecede inkübe ederek ters transkriptazı inaktive edin. Daha sonra, reaksiyon toplamını 100 mikrolitreye çıkarmak için her tüpe 80 mikrolitre TE tamponu ekleyerek DNA seviyelerini seyreltin.
Artık cDNA sentezlendiğine göre, ilgilenilen geni PCR yoluyla çoğaltın. Bunu yapmak için önce ilk tur amplifikasyon PCR karışımını hazırlayın. cDNA şablonuna ek olarak, ters kopyalanmamış üründen şablonu kullanan bir negatif kontrol reaksiyonunun yanı sıra, primer olmayan bir kontrol olarak gene özgü primere sahip olmayan bir reaksiyonu da dahil edin.
Reaksiyonlar hazırlandıktan sonra, ısıtılmış bir kapakla donatılmış bir termodöngüleyicide PCR amplifikasyonlarını gerçekleştirin. Daha sonra, 19 mikrolitre TE tamponuna 1 mikrolitre PCR ürünü ekleyerek ürünleri 1 ila 20 arasında seyreltin. Bu seyreltilmiş ürünleri kullanarak ikinci tur amplifikasyon PCR karışımını hazırlayın. Ardından, ikinci PCR'yi çalıştırmak için bir termosikler kullanın.
PCR fragmanlarını izole etmek için, 100 mililitre TAE tamponu başına 1 gram agaroz ekleyerek %1'lik bir agaroz jeli hazırlayın. Karışımı mikrodalgada iki dakika eritin ve ardından SYBR Safe lekesi veya etidyum bromür ekleyin. Erimiş karışımı bir jel tepsiye dökün ve kurumasına izin verin.
Jel sertleşirken, numune sayısına karşılık gelen bir parafilm parçasına 1 mikrolitrelik damlacık 6X Yükleme Boyası pipetleyin. Her damlacığa 5 mikrolitre numune ekleyin. Şimdi, numuneleri 1 kilobaz DNA merdiveni ile birlikte jelin üzerine yükleyin. Jeli 120 voltta yaklaşık 45 dakika veya boya önü jelin %75'i bitene kadar çalıştırın.
Jelin çalışması bittiğinde, jel bantlarını bir UV aydınlatıcı altında kontrol edin. Bantları bulun ve bir neşter kullanarak kesin. Piyasada bulunan bir spin kolon kiti kullanarak cDNA parçalarını saflaştırın. Saflaştırıldıktan sonra, cDNA fragmanları eksi 20 santigrat derecede saklanabilir veya daha fazla analiz için hemen kullanılabilir.
Bu deneyden önce, Drosophila dSmad2 için iki transkript, Drosophila genomik veritabanı FlyBase'de açıklandı. Bu genin beklenen eklenmesine bağlı olarak, üç asal RACE protokolü ile iki ürün tanımlanmalıdır.
Bununla birlikte, bu deneyden elde edilen sonuçlar, dSmad2 için üç farklı transkript ortaya koymaktadır. Tahmin edilen ürünler arasında, bir transkript baskındır ve biri daha düşük bir seviyede ifade edilir. Ek olarak, 750 baz çiftinde görülebilen, daha önce tanımlanmamış daha küçük bir ürün tespit edildi.
