Name: Retina Yatay Dilim Hazırlık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Öğrenin, retina nöronlarının dendritik morfolojisini koruyan yeni bir dilimleme yöntemi. Bu teknik, geleneksel yöntemlere göre daha üstün sonuçlar sağlayarak retinal devrelerin fonksiyonel analizini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr teşekkür ederim. Retinanın yatay dilim hazırlama prosedürü kurmak için bize değerli tavsiyeleri ve önerileri veren Richard H. Masland ve Akimichi Kaneko.

<ol><li> Agar bloğu (30 mg / ml, yani% 3, distile su) hazırlayın. Çözülür ve mikrodalga ilk ve bir cam tabak içine dökün. 4 ° C&#39;de buzdolabında çanak tutun İpucu: agar blok önceden hazırlanmış olmalıdır. </li><li> Hazırlayın düşük sıcaklık eritme agaroz jel (orta, 25 mg / ml, yani% 2,5 &#39;i,). Çözülür ve mikrodalga. 35 ° C&#39;de sıcak su banyosunda tutun İpucu: agaroz jel çok sıcak NOT tutun. Çok sıcak ise, bu katılaşmış olması için uzun bir süre alır ve jel retinanın öldürebilir . </li><li> Hayvan, aydınlatmak bir göz küresi Euthanize ve Göz yuvası gibi açın. Vitreus mizah sıvılaştırılması için açılan Göz yuvası varsa mutlaka orta hiyalüronidaz 10 dakika (0.07 mg / ml) için ıslatılır. </li><li> Agar (örn., 1 cm x 1,5 cm fare retina) bir blok halinde kesin ve anında yapıştırıcı vibratome bir sahnede sıkıca bağlı. Agar bloğu ıslak tutun. </li><li> Dilimleme makinesi az 5 derece bıçak yerleştirin. Yaklaşık hızda agar bloğu üst yüzeyi hafifçe kesti. 50 mm / sn, frekans. 50 Hz. İpucu: agar blok üst yüzeyi tamamen düz ve pürüzsüz olduğundan emin olun. Bazı kesim (en az 3 kez), agar bloğu, pürüzsüz ve düz bir yüzey elde etmek için gerekli olabilir . </li><li> Göz yuvası hiyalüronidaz olmadan orta ile durulayın. Retina pigment epitel izole etmek ve bir parça filtre kağıdı üzerinde fotoreseptör-tarafı aşağı yerleştirin. Filtre kağıdı sıkıca retina eklemek için, filtre kağıdı birkaç kez retina vakum. İpucu: retina tamamen düz filtre kağıdı takılı olduğundan emin olun. Filtre kağıdı üzerinde bir retina koymak sonra, retina (Fig.2A) çevreleyen fazla filtre kağıdı kesti. Fazla filtre kağıdı, genellikle uygun retina tabakası girecek bir bıçak önler . </li><li> Agar bloğu aşırı orta yavaşça silin ve agar blok dikkatlice filtre kağıdı retina. Agar blok filtre kağıdı sıkıca yerleştirmek için, filtre kağıdı kenarına anında yapıştırıcı takın. İpucu: agar blok üst yüzeyi mümkün olduğunca ön unexpectable çatlak önlemek için, retinanın yerleştirin. </li><li> Düşük sıcaklıkta eriyen agaroz jel retinanın üzerine yavaşça dökün. 1 dakika bekleyin ve yavaşça soğumasını orta dökün. Agaroz jel hızlı katılaşmış olur. İpucu: Çok sıcak agaroz jel retinanın öldürür. </li><li> Agar bloğun üst yüzeyinden birkaç yüz mikron bıçak pozisyonu kaldırın ve yavaşça katılaşmış agaroz jel üst kesim. </li><li> Bıçak konum aşağı indirin. Retinanın iç nükleer tabaka (yaklaşık agar bloğun üst yüzeyinden 200 ila 250 mikron) proksimal üçte biri düzeyinde kesin. İpucu: Çok fazla bıçak hızı ciddi retina zarar verecektir. Yaklaşık. 50 mm / sn (50 Hz) uygun olur. </li><li> Amacrine hücreleri artık yüzü aşağı olduğuna dikkat edin. Dikkatle katılaşmış agaroz jel ile birlikte retina dilim pick up ve yüzü yukarı bir oda ya da bir tabak içinde yerleştirin. İpucu: Fare retinanın küçük ve dalgalı olduğu için, mükemmel bir yatay dilim uygun bir tabaka elde etmek zordur. Bir &quot;eğik&quot; dilim retinanın göreceli düz bir dilim almak için alternatif bir yöntem olabilir . Eğik dilim almak için, filtre kağıdı ve agar bloğu olarak Fig.2B gösterilen retina arasında başka bir filtre kağıdı koyun . Amacrine hücre soma dilim yüzeyinde bazı alanlarda mükemmel bir yatay dilim bekleyemezsiniz rağmen, her zaman vardır. </li></ol>

<ol><li>Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+spatiotemporal+patterns+of+dendritic+Ca2%2B+signals+in+goldfish+retinal+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells.</a> Brain Res. , 64-73 (2004).</li>
<li>Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+currents+stabilize+the+membrane+potential+in+dendrites+of+mouse+amacrine+cells%3A+patch-clamp+recordings+and+single-cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell.</a> , 328-340 (2004).</li>
<li>MA, M. acN. eil, RH, M. asland <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. , 971-982 (1998).</li>
</ol>

Tüm deneysel protokolleri hayvan kullanımı için sağlık kuralları National Institutes göre yapılmıştır.

Retinanın yatay dilim hazırlık birçok önemli avantajları vardır. İlk olarak, amacrine hücreleri ve yatay hücreleri gibi, yatay dendritler genişletmek hücrelerin morfolojisi, korunur. Bu hücrelerinin morfolojisi fizyolojik özelliği ile karşılaştırmak için oldukça önemlidir, böylece 20 farklı tipte (MacNeil ve Masland, 1998), retina amacrine hücreleri üzerinde olduğu kanıtlanmıştır. İkincisi, tüm montaj retinada, glial hücre s endfeets geniş kapsama alanı, yama pipetler erişim amacrine hücreleri engeller. Amacrine hücrelerinin...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1296</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz L</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>317-01182</td><td>Düşük sıcaklıkta eriyen agaroz</td></tr><tr><td>Hiyalüronidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Tip I-S, 300 U/mg</td></tr><tr><td>Besiyeri</td><td></td><td></td><td>mM cinsinden: 102 NaCl, 3.1 KCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 23 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; ve 10 glikoz, pH 7.8'de tutulmuş veya Ames&amp;rsquo; Çözeltisi (Sigma)</td></tr><tr><td>Mikrodalga fırın</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıcak su banyosu</td><td></td><td></td><td>35 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Vibratom dilimleyici</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>MF-Membran filtreler</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>Filtre kağıdı, gözenek boyutu 0.45 &amp;#181;m</td></tr><tr><td>Diseksiyon aletleri</td><td></td><td></td><td>pens, bistüri ucu, kıskaç, cımbız, &lt;em&gt;vb&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td>Hızlı yapıştırıcı</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;örneğin&lt;/em&gt; Alonalpha, Krazy Glu</td></tr><tr><td>50 mL Şırınga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr></tbody></table>

retina yatay dilim hazırlık

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Geleneksel dikey dilim ve retinanın tüm hazırlık retina devrelerin fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Ancak, amacrine hücreleri gibi retinal nöronların, hücrelerin morfolojisi dikey dilimler halinde ağır hasarlı olması gerekiyordu ki, yatay dendritler genişletmek. Bütün montaj hazırlanmasında, özellikle yama klemp kayıtları için, orta tabaka retina nöronlar glial hücre (Müller hücre) ler endfeets geniş kapsama alanı nedeniyle kolayca erişilebilir değildir. Burada, sağlam retina nöronların dendritik morfoloji korumak için yöntem dilimleme roman açıklar. Retina düşük sıcaklık erime agaroz jel gömülü sonra dilim vibratome dilimleme makinesi kullanarak retinanın iç tabakası yatay olarak yapılmıştır. Retinanın bu yatay dilim hazırlanmasında, yama klemp kayıt, kalsiyum görüntüleme tekniği, immünhistokimya ve RT-PCR tek hücreli kullanarak, kendi morfolojisi ile karşılaştırıldığında retinal nöronların fonksiyonu okudu.

Geleneksel dikey dilim ve retinanın tüm hazırlık retina devrelerin fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Burada, sağlam retina nöronların dendritik morfoloji korumak için yöntem dilimleme roman açıklar.

Retina Yatay Dilim Hazırlık

Geleneksel olarak, retinal devrelerin fonksiyonlarını incelemek için retinanın dikey kesitleri ve bütün montaj (whole-mount) preparatları kullanılmıştır. Ancak, birçok...

İşte efsane burada ve bu bir resimli makale.

horizontal-slice-preparation-of-the-retina

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Insan dışı primat gelişimi ve yaşlanma anlamak için önemli bir translasyonel türüdür. Primat retinanın anatomik organizasyonu, insanlarda normal ve patolojik durumları önemli bilgiler verebilir.

Beyin Ağ Geçidi: Primate Göz Diseksiyon

İşte biz elektrofizyolojik kayıtlar için fare retina karanlık adapte dilim üretmek için bir prosedür açıklanmaktadır.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması...

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

8 gün yaşlı bir fare Sinir retina% 4 jelatin bloğunun üstünde olduğunu. Vibratome ile fotoreseptör tabakası (200 um), izole edildikten sonra, fotoreseptör kültür mekanik ve enzimatik ayrışma sonrasında tohumlanır. fotoreseptör moleküler ve biyokimyasal analizler ya da transplantasyon için kullanılabilir.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

Fare gözünden retina dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve retina nöronlarında ışık tepkilerinin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz. Tüm prosedür karanlığa uyarlanmış koşullarda gerçekleştirilir.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Retina doku Imaging geleneksel biyokimyasal yöntemlerle toplanan tek hücreli bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı üzerinden Zebra balığı retina dilimleri hazırlanması için confocal düşsel açıklar. Floresan genetik olarak kodlanmış sensörler ve göstergesi boyalar görselleştirme çok sayıda biyolojik süreçlerin ayrı retina hücre türlerinde izin vermeyin.

Ex Vivo deneyler görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden hazırlanması taze retina dilimleri

Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.

Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Öğrenin, retina nöronlarının dendritik morfolojisini koruyan yeni bir dilimleme yöntemi. Bu teknik, geleneksel yöntemlere göre daha üstün sonuçlar sağlayarak retinal devrelerin fonksiyonel analizini kolaylaştırır.

Retina Yatay Dilim Hazırlık

Daha fazla video keşfet