Çevre transkriptomik kullanarak Deniz Mikrobiyal Toplulukları Gen İfade Analizi

Bu prosedür, su örneklerinden deniz mikrobiyal biyokütlesinin beş ve üç mikrometre filtrelerden ön filtrasyon yoluyla elde edilmesiyle başlar ve ardından 0.22 mikrometrelik bir filtreye toplanır. Toplam RNA daha sonra 0.22 mikrometre filtrede tutulan organizmalardan ekstrakte edilir. RNA'mız, seçici enzimatik bozunma ve eksiltici hibridizasyon ile toplam RNA'dan çıkarılır, zenginleştirilmiş Mr.N, poliA kuyruğu ve in vitro transkripsiyon yoluyla doğrusal olarak amplifiye edilir.

Amplifiye edilmiş antisens RNA daha sonra rastgele heksamer kullanılarak çift sarmallı CD NA'ya dönüştürülür. Elde edilen CD NA klonlanabilir ve sıralanabilir veya doğrudan pyro dizilenebilir. Merhaba, ben Georgia Üniversitesi Deniz Bilimleri Bölümü'nde Dr.Marianne Moran'ın laboratuvarından Rachel Persky.

Bugün size çevresel örneklerden gen ifadesine bakmak için bir prosedür göstereceğiz. Çevresel meta transkriptomik kullanma. Scott Gifford size RNA koleksiyonu için çevresel örneklerin nasıl işleneceğini gösterecek.

Size örneklerden ve Johanna RIN'lerden RNA'yı nasıl çıkaracağınızı göstereceğim. AON, RNA uzaklaştırılmasını gösterecektir. Maria Kosta daha sonra RNA amplifikasyonu ve CD NA sentezi adımlarından geçecektir.

Öyleyse başlayalım. Çevresel RNA toplamaya başlamak için, borunun bir ucunu numune almak için istenen derinlikte suya yerleştirerek filtre hattı sistemini kurduk ve diğer ucunu pompayı borunun iki ucu arasına yerleştirerek yüksek hacimli üç mikrometrelik bir filtreye takıyoruz. Üç mikrometre filtre daha sonra 0.22 mikrometre filtre kulesine bağlanır ve çıkış 0.22 mikrometre kuleden dereceli bir kargoya yönlendirilir.

Durulamak için sistemden birkaç litre su akıtın. Bittiğinde, hattan kalan suyu boşaltmak için pompa çalışırken boruyu sudan çıkarın. Ardından, filtre kulesine 0,22 mikrometrelik bir filtre yerleştirmek için bir çift forseps kullanın ve kapatın.

Hattın ucunu tekrar suya yerleştirin ve pompayı açın. Havanın her iki filtreden de dışarı atılmasına izin verin ve damacana ile filtrelenen su hacmini izleyin. İstenilen hacim filtrelendikten sonra, hattı sudan çıkarın ve kalan suyu sistemden boşaltın.

Filtre kuruduktan hemen sonra, üst filtre plakasını hızlı bir şekilde çıkarın ve filtre kağıdını katlayın. Filtreyi bir girdap paketine yerleştirin ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Deneye başlamadan önce, RNA'ların her yerde bulunması ve mRNA'ların hızla bozulması nedeniyle, çalışma yüzeyleri ve pipetler de dahil olmak üzere ribonükleaz içermeyen bir ortamda çalışmak için standart önlemlere uyulması gerektiğini not etmek önemlidir.

Bunu akılda tutarak, bu prosedürde kullanılan herhangi bir malzemeyi tutarken temiz eldivenler giyilmelidir. Ve numuneler mümkün olduğunca kısa sürede işlenmelidir. 0.22 mikrometre filtreden toplam RNA ekstraksiyonuna başlamak için, 50 mililitrelik konik bir tüpe beta meto etanol eklenmiş sekiz mililitre RLT tamponu ekleyerek boncuk boncuk tüpleri hazırlıyoruz.

Daha sonra, bir mobil güç toprak ekstraksiyon kitinden bir ila iki mililitre RNA boncukları eklenir. Donmuş filtreyi dondurucudan hızlı bir şekilde çıkarın ve dünya paketinde saklayın. Bir tokmakla parçalayın.

Parçalanmış filtreyi hazırlanan 50 mililitrelik konik tüpe ekleyin ve tüp kapağını 10 dakika boyunca parfüm veya laboratuvar bandı girdabı ile kapatın. Daha sonra 50 mililitrelik tüpü 5.000 RPM'de bir dakika santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, lizatın mümkün olduğu kadar çoğunu çıkarın ve beş dakika boyunca tekrar santrifüjlemeden önce 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

5.000 kez G'de, süpernatant daha sonra yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarılır ve lizata bir hacim% 100 etanol eklenir. 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, lizatı 18 ila 21 gauge iğneden çekin ve yaklaşık beş kez geri geçirin. Sonraki ekstraksiyon adımları, üreticinin talimatlarını izleyerek KaiGen R'yi ve easy mini kitini kullanın, lizatı sağlanan kolona vakum manifoldu ile veya tekrarlanan santrifüjleme ile uygulayın.

Toplam RNA spektrosunu fotometrik olarak ölçün. Toplam RNA verimini belirledikten sonra, herhangi bir DNA kontaminasyonunu gidermek için üreticinin talimatlarına göre Ambien turbo DNA ücretsiz kitini kullanıyoruz. Şimdi RNA ekstraksiyonları tamamlandığına göre, toplam RNA'yı Johanna'ya vereceğim, o da birinci ve ikinci RRNA çıkarma adımlarını yapacak.

Teşekkürler Rachel. RRNA çıkarmaya başlamak için, steril RNA içermeyen 0.5 mililitrelik bir tüpte kullanmadan önce mRNA'yı sadece 10 kez reaksiyon tamponunu nazikçe karıştırın ve kısaca santrifüjleyin, uygun hacimlerde 10 kat reaksiyon tamponu RNA inhibitörü, toplam RNA numunesi ve sonlandırıcı eksonükleazı birleştirin. Merkez üssü protokolüne göre, reaksiyonu ısıtılmış bir kapak veya su banyosu olan bir termosiklerde 60 dakika boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, reaksiyonu bir fenol etanol çökeltme ile sonlandırın Önce toplam 200 mikrolitre hacme RNA serbest su ekleyerek ve ardından mRNA santrifüjüne bire bir fenol kloroform çözeltisi hacim ekleyerek. Sulu fazı toplayın ve ardından yüzde yüz etanol ile çökeltin ve saldırın. Bu potansiyel bir durma noktasıdır.

RNA, numuneyi sonraki uygulamalarda kullanmaya hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. İlk mRNA zenginleştirmesini tamamladıktan sonra, numunemizden kalan RRNA'yı çıkarmak için üreticinin talimatlarına göre Ambien mikrop zenginleştirme ve mikrop ekspres kitlerini kullanacağız. Ökaryotik RRNA'nın uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için mikrop zenginleştirme kitini kullanacağız.

Tüm hacimler, üreticinin talimatları okunarak belirlenir. Pipetlemeye başlamak için, 300 mikrolitre bağlayıcı tamponu 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun. Maksimum 30 mikrolitre hacimde beş ila 100 mikrogram toplam RNA ekleyin ve girdap yapın.

Bağlama tamponuna beş mikrogram RNA için iki mikrolitre yakalama oligo karışımını yavaşça ekleyin ve tüpe hafifçe vurun. Karışımı kısaca döndürün. Karışımı 70 santigrat derecede 10 dakika denatüre ettikten sonra karışımı 37 derecede bir saat diz çökürün.

Bu inkübasyon sırasında, oligo mag boncukları bir kez nükleaz içermeyen suda ve bir kez bağlayıcı tamponda yıkayarak ve boncukları yıkamalar arasında manyetik bir stand üzerinde yakalayarak hazırlayın. Boncukları buz üzerinde saklayın ve oda sıcaklığına kadar ısıtın. Kullanmadan beş dakika önce, yıkama solüsyonunu bir ısı bloğunda 37 santigrat dereceye ısıtın.

RNA yakalama oligo karışımını yıkanmış oligo mag boncuklarına ekleyin, gömün, tüpü hafifçe karıştırın ve döndürün. Karışımı 37 santigrat derecede 15 dakika kısaca inkübe edin. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve süpernatan içeren mRNA'yı aspire etmeden ve ardından buz üzerindeki bir toplama tüpüne aktarmadan önce yaklaşık üç dakika bekleyin.

Daha sonra, yakalanan boncuklara 100 mikrolitre önceden ısıtılmış yıkama solüsyonu ekleyin. Ve nazikçe girdap yapın, boncukları yakalayın ve süpernatan aptalı kurtarın. Bu süpernatant, buz üzerindeki toplama tüpünde Mr.NA.

Artık prokaryotik RRNA'yı çıkarmak için kullanacağımız ambi mikrop ekspres kitini kullanarak prokaryotik RRNA'yı çıkarmaya hazırlanırken buzun üzerine bir toplama tüpü yerleştirin. RRNA kontaminasyonunu ve MR'yi kontrol etmek için biyoanalizör veya Experion kullanın. NA kalitesi. Bu potansiyel bir durma noktasıdır.

RNA eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. RRNA çıkarıldıktan sonra, mRNA'mızı amplifiye etmek için üreticinin talimatlarına göre Ambien mesajı AMP iki bakteri kitini kullanacağız. Artık saf bir mRNA örneğine sahip olduğumuza göre, deneyi Maria'ya devredeceğim, o sizi mRNA amplifikasyonu ve CDNA sentezinden geçirecek.

Teşekkürler Hannah. mRNA amplifikasyonuna başlamadan önce, Ambien mesajının her bir bileşeninin hacimlerini hesaplayın AMP iki bakteri kiti ana karışımları çevrimiçi, steril bir RNA içermeyen mikro füj tüpüne 1000 nanograma kadar toplam RNA yerleştirerek şablon RNA'nın poliadenilasyonuna başlarız. Bir RNA'yı in vitro transkripsiyon yoluyla sentezlemek için ilk tamponda 6,5 mikrolitre numune kullanın ve RNA'sız su kullanmayın.

Düzgün sıcaklıkları nedeniyle bir hibridizasyon fırını veya inkübatör kullanılması tavsiye edilir. Ve tüplerin içinde yoğuşma oluşmaması son derece önemli olduğundan, 14 saatlik bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu inkübasyonunu şiddetle tavsiye ediyoruz. En yüksek A RNA verimi için bir RNA verimini en üst düzeye çıkarmak için, IBT'yi 40 mikrolitrelik bir son reaksiyon hacminde gerçekleştirin, A RNA'yı yaklaşık 10 mikrolitrelik kuatlar halinde eksi 80 santigrat derecede saklayın.

RNA amplifiye edildikten sonra, tamamlayıcı veya CDNA'yı sentezleme zamanıdır. Promega evrensel ribot Klonu. CDNA sentez sistemi kiti, bir NA'dan CD NA'yı sentezlemek için kullanılır. Kit, iki mikrogramı, bir NA'yı CD NA'ya dönüştürmek için talimatlar sağlar. Bir NA'ya altı ila 10 mikrogram girdi yapılmasını ve reaksiyonların buna göre ölçeklendirilmesini öneririz.

CD NA'yı bir etanol çökeltmesi veya promega sihirbazı DNA temizleme sistemi kullanarak temizleyin. Üreticinin talimatlarına göre, numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın, çift sarmallı CDNA, bu noktada 10 litre deniz suyundan doğrudan sıralanabilir, yaklaşık 10 mikrogram çevresel RNA çıkardık ve amplifiye MR'nin dönüştürülmesiyle 20 kat büyütüldük. NA'dan çift sarmallı CDNA'ya, çevresel transkriptlerin dizilenmesi ve analizi için yeterli miktarda materyal üretildi. Çevresel meta transkriptomik kullanarak deniz mikrobiyal topluluklarından gen ekspresyonunu nasıl değerlendireceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü yaparken mRNA'nın hızla bozulduğunu ve RNA'ların her yerde bulunduğunu daima unutmayın. Bu nedenle, kaburga çekirdeği içermeyen bir ortamda çalışmak için standart önlemleri alın ve numuneleri mümkün olan en kısa sürede işleyin. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.