Çevre transkriptomik kullanarak Deniz Mikrobiyal Toplulukları Gen İfade Analizi

Bu prosedür, su örneklerinden denizel mikrobiyal biyokütlenin beş ve üç mikrometrelik filtrelerle ön filtrasyon yapılması ve ardından 0,22 mikrometrelik bir filtre üzerinde toplanmasıyla başlar. Daha sonra, 0,22 mikrometrelik filtre üzerinde tutulan organizmalardan toplam RNA ekstre edilir. Seçici enzimatik degradasyon ve subtraktif hibridizasyon ile zenginleştirilen Mr.N, toplam RNA'dan uzaklaştırılır ve polyA kuyruklama ile in vitro transkripsiyon yoluyla lineer olarak amplifiye edilir.

Amplifiye edilen antisense RNA, ardından rastgele hekzamerler kullanılarak çift zincirli CD NA'ya dönüştürülür. Elde edilen CD NA klonlanıp dizilenebilir veya doğrudan piro-dizileme işlemine tabi tutulabilir. Merhaba, ben Georgia Üniversitesi Deniz Bilimleri Bölümü'nden Dr. Marianne Moran'ın laboratuvarından Rachel Persky.

Bugün size çevresel örneklerden gen ekspresyonunu inceleme prosedürünü göstereceğiz. Çevresel meta transkriptomik yöntemini kullanacağız. Scott Gifford, RNA toplama işlemi için çevresel örneklerin nasıl işleneceğini gösterecek.

Örneklerden RNA'nın nasıl izole edileceğini ve Johanna RIN değerlerinin nasıl belirleneceğini göstereceğim. AON, RNA uzaklaştırma işlemini uygulamalı olarak gösterecek. Ardından Maria Kosta, RNA amplifikasyonu ve cDNA sentezi adımlarını anlatacak.

Hadi başlayalım. Çevresel RNA toplama işlemine başlamak için, hortumun bir ucunu örnekleme için istenen derinlikteki suya yerleştirip karşı ucunu yüksek hacimli 3 µm'lik bir filtreye bağlayarak filtre hattı sistemini kuruyoruz ve pompayı hortumun iki ucu arasına yerleştiriyoruz. Ardından 3 µm'lik filtre, 0.22 µm'lik filtre kulesine bağlanır ve çıkış akışı 0.22 µm'lik kuleden dereceli bir kaba yönlendirilir.

Sistemi durulamak için birkaç litre su geçirin. İşlem tamamlandığında, hattaki kalan suyu tahliye etmek için pompa çalışırken hortumu sudan çıkarın. Ardından, bir pens yardımıyla filtre kulesine 0,22 µm'lik bir filtre yerleştirin ve kuleyi kapatın.

Hattın ucunu tekrar suyun içine yerleştirin ve pompayı çalıştırın. Havanın her iki filtreden de tahliye olmasına izin verin ve damacanadaki su hacmini takip ederek filtrelenen su miktarını izleyin. İstenen hacim filtrelendiğinde, hattı sudan çıkarın ve sistemde kalan suyu tahliye edin.

Filtre kurur kurumaz, üst filtre plakasını hızla çıkarın ve filtre kağıdını katlayın. Filtreyi bir whirl pack içine yerleştirin ve sıvı azot ile şok dondurun. Deneye başlamadan önce, RNA'ların her yerde bulunduğunu ve mRNA'ların hızla degrade olduğunu, bu nedenle çalışma yüzeyleri ve pipetler de dahil olmak üzere ribonükleazsız bir ortamda çalışma standart önlemlerinin takip edilmesi gerektiğini belirtmek önemlidir.

Bu husus göz önünde bulundurularak, bu prosedürde kullanılan tüm malzemelerle çalışırken temiz eldivenler giyilmelidir. Ayrıca örnekler, mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir. 0,22 mikrometre filtreden toplam RNA ekstraksiyonuna başlamak için, 50 mililitrelik konik bir tüpe beta-meto etanol eklenmiş sekiz mililitre RLT tamponu ekleyerek boncuklu tüpleri hazırlıyoruz.

Ardından, mobil güç toprak ekstraksiyon kitinden bir ila iki mililitre RNA boncuğu eklenir. Dondurulmuş filtre, dondurucudan hızla çıkarılır ve dünya paketinde tutulur. Bir tokmak yardımıyla parçalanır.

Parçalanmış filtreyi hazırlanmış 50 milliliter konik tüpe ekleyin ve tüp kapağını parafilm veya laboratuvar bandıyla kapatarak 10 dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, 50 milliliter tüpü 5, 000 RPM hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, lizatın mümkün olduğundan fazlasını uzaklaştırın ve beş dakika boyunca tekrar santrifüjlemeden önce 15 milliliter tüpe aktarın.

5.000 ×g'de santrifüjleme sonrası, süpernatant yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarılır ve lizata bir hacim %100 etanol eklenir. 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, lizatı 18 ila 21 gauge bir iğne aracılığıyla çekin ve yaklaşık beş kez geri püskürtün. Sonraki ekstraksiyon adımları için, üretici talimatlarını izleyerek KaiGen R and easy mini kit kullanın ve lizatı vakum manifolduyla veya tekrarlayan santrifüjleme ile sağlanan kolona uygulayın.

Toplam RNA miktarını spektrofotometrik olarak belirleyin. Toplam RNA verimini saptadıktan sonra, DNA kontaminasyonlarını gidermek için Ambien turbo DNA free kitini üretici talimatlarına uygun olarak kullanıyoruz. RNA ekstraksiyonları tamamlandığına göre, birinci ve ikinci rRNA giderme adımlarını gerçekleştirecek olan Johanna'ya toplam RNA'yı teslim edeceğim.

Teşekkürler Rachel. rRNA uzaklaştırma işlemine başlamak için, kullanmadan önce 10x reaksiyon tamponunu steril, RNA içermeyen 0,5 mililitrelik bir tüp içinde nazikçe karıştırın ve kısa süreliğine santrifüjleyin; ardından 10x reaksiyon tamponu, RNA inhibitörü, toplam RNA örneği ve terminator eksonüklazın uygun hacimlerini birleştirin. Epicentre protokolüne göre, reaksiyonu ısıtmalı kapaklı bir termosayklerda veya su banyosunda 30 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, önce toplam hacim 200 µL olacak şekilde RNAse free water ekleyerek ve ardından mRNA santrifüj tüpüne bir hacim oranında bir-bir fenol kloroform çözeltisi ilave ederek reaksiyonu fenol etanol çöktürme yöntemiyle sonlandırın. Sulu fazı toplayın ve ardından %100 etanol ve tuz ile çöktürün. Burası potansiyel bir duraklama noktasıdır.

RNA, sonraki uygulamalarda numuneyi kullanmaya hazır olana kadar -80 °C'de saklanabilir. İlk mRNA zenginleştirmesini tamamladıktan sonra, numunemizdeki kalıntı rRNA'ları temizlemek için üretici talimatlarına uygun olarak Ambien microbe enrich ve microbe express kitlerini kullanacağız. Ökaryotik rRNA'ların uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için microbe enrich kitini kullanacağız.

Tüm hacimler, üretici talimatları okunarak belirlenir. Başlamak için, bir 1,5 mililitrelik tüpe 300 µL bağlama tamponu pipetleyin. Maksimum 30 µL hacimdeki 5 ila 100 µg toplam RNA ekleyin ve vorteksleyin.

Bağlama tamponu içerisindeki 5 µg RNA için 2 µL yakalama oligo karışımını nazikçe ekleyin ve tüpü hafifçe tıklatın. Karışımı kısa süreliğine santrifüjle çöktürün. Karışımı 37 °C'de bir saat boyunca bekletmeden önce, 70 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin.

Bu inkübasyon sırasında, oligo manyetik boncukları bir kez nükleaz içermeyen su ile ve bir kez bağlanma tamponu ile yıkayarak hazırlayın ve yıkamalar arasında boncukları manyetik bir stantta tutun. Boncukları buz üzerinde saklayın ve oda sıcaklığına kadar ısıtın. Kullanımdan beş dakika önce, yıkama solüsyonunu bir ısıtıcı blokta 37 °C'ye ısıtın.

Yıkanmış oligo manyetik boncuklara RNA yakalama oligo karışımını ekleyin, tüpü nazikçe karıştırın ve santrifüjleyin. Karışımı 37 °C'de 15 dakika boyunca kısa süreli inkübe edin. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve mRNA içeren süpernatantı aspire edip buz üzerinde bir toplama tüpüne aktarmadan önce yaklaşık üç dakika bekleyin.

Ardından, yakalanan boncuklara önceden ısıtılmış 100 µL yıkama solüsyonu ekleyin. Boncukları nazikçe vorteksleyin ve süpernatanı geri kazanın. mRNA içeren bu süpernatanı buz üzerindeki toplama tüpüne aktarın.

Ambi microbe express kit kullanarak prokaryotik RRNA'yı uzaklaştırmaya hazırlanırken bir toplama tüpünü buz üzerine yerleştirin; bu kiti artık kalan prokaryotik RRNA'yı uzaklaştırmak için kullanacağız. RRNA kontaminasyonunu ve mRNA kalitesini kontrol etmek için bioanalyzer veya Experion kullanın. Burası potansiyel bir durdurma noktasıdır.

RNA, -80 °C'de saklanabilir. rRNA uzaklaştırıldıktan sonra, mRNA'yı amplifiye etmek için üretici talimatlarına uygun olarak Ambien message AMP two bacteria kit kullanacağız. Böylece saf bir mRNA örneği elde ettiğimize göre, deneyi mRNA amplifikasyonu ve cDNA sentezi süreçlerini anlatacak olan Maria'ya devrediyorum.

Teşekkürler Hannah. mRNA amplifikasyonuna başlamadan önce, Ambien message AMP two bakteri kiti master mix'lerinin her bir bileşeninin hacimlerini hesaplayın; ardından, 1000 nanogram'a kadar toplam RNA'yı steril, RNA içermeyen bir mikro santrifüj tüpüne koyarak kalıp RNA'nın poliadenilasyonuna başlayalım. In vitro transkripsiyon yoluyla bir RNA sentezlemek için ilk tamponda 6.5 microliter örnek kullanın ve RNA içermeyen su eklemeyin.

Homojen sıcaklık sağlamaları nedeniyle bir hibridizasyon fırını veya inkübatör kullanılması önerilir. Tüplerin içinde kondansasyon oluşmaması son derece önemli olduğundan, 14 saatlik bir in vitro transkripsiyon reaksiyon inkübasyonu şiddetle tavsiye edilir. En yüksek A RNA verimini elde etmek için IBT işlemini 40 µL final reaksiyon hacminde gerçekleştirin ve A RNA'yı yaklaşık 10 µL'lik miktarlarda -80 °C'de saklayın.

RNA amplifiye edildikten sonra, komplementer DNA veya cDNA sentezleme aşamasına geçilir. RNA'dan cDNA sentezlemek için Promega universal ribot Clone cDNA sentez sistemi kiti kullanılır. Kit, iki mikrogram RNA'yı cDNA'ya dönüştürmek için talimatlar sağlar. Biz, altı ila 10 mikrogram RNA girişi yapılmasını ve reaksiyonların buna göre ölçeklendirilmesini öneriyoruz.

CD NA'yı etanol çöktürme veya Promega Wizard DNA temizleme sistemi kullanılarak temizleyin. Üretici talimatlarına göre örnekleri -80 °C'de saklayın; çift zincirli cDNA bu aşamada doğrudan dizilenebilir. 10 L deniz suyundan yaklaşık 10 µg çevresel RNA ekstre ettik ve 20 kat amplifiye ettik. Amplifiye edilen mRNA'nın çift zincirli cDNA'ya dönüştürülmesiyle, çevresel transkriptlerin dizilenmesi ve analizi için yeterli miktarda materyal üretilmiştir. Çevresel metatranskriptomik kullanarak denizel mikrobiyal topluluklardan gen ekspresyonunun nasıl değerlendirileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, mRNA'nın hızla degrade olduğunu ve RNA'ların her yerde bulunduğunu daima hatırlayın. Bu nedenle, ribonükleazsız bir ortamda çalışmak için standart önlemleri alın ve örnekleri mümkün olduğunca hızlı bir şekilde işleyin. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.