Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip
February 20th, 2009
Karmaşık lokomotor davranış çalışma Drosophila melanogaster Yeteneği belirli bir sineğin hareket değişiklikleri ölçmek için bağımlı. Bu makale, yüksek çözünürlüklü bir izleme sistemi ile bunun nasıl yapılacağını gösteriyor.
Video izleme testinde, sinekler anestezi kullanılmadan kare bir gözlem odasına yüklenmelidir. Bunu yapmak için, sinekleri odaya sokmak için haznedeki vida delikleri ile küçük bir huni hizalanmalıdır. Bu huniyi kullanarak, vidalar daha sonra haznenin deliklerini kapatır ve hareketi başlatmak için havalandırma deliklerinden bir hava darbesi uygulanır.
Odanın üzerinde asılı duran bir video kamera, bu hareketi yakalar ve sineklerin yollarının izlendiği ve analiz edildiği bir bilgisayara gönderir. Merhaba, ben Brandeis Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeki Griffith Laboratuvarı'ndan Justin Slawson. Bugün size hareketin yüksek çözünürlüklü video takibi için bir prosedür göstereceğiz.
Bu prosedürü laboratuvarımızda yetişkin sineklerde lokomotif davranışını incelemek için kullanacağız. Öyleyse başlayalım. Deneye başlamak için sinekler ve mayasız standart ortam içeren şişeler yetiştirin.
Bu protokol çok sayıda sinek gerektirir, bu nedenle haçların buna göre ayarlanması gerekir. Sinekler, 25 santigrat derecede 12 saatlik aydınlık karanlık bir döngüde yetiştirilmelidir. Aus'tan bir ila üç gün sonra sinekleri toplayın, sinekleri maya içermeyen medya içeren test tüplerine ayırmak için bir karbondioksit difüzörü kullanın, test tüpü başına 10 erkek sıralayın.
Davranışsal deneyleri çalıştırmadan önce karbondioksit kullandıktan sonra en az bir veya iki gün bekleyin. Sinekler toplandıktan ve sıralandıktan sonra, video izleme sisteminde çalıştırılabilirler. Video izleme deneyleri, %70 nem ile 25 santigrat derece sabit bir sıcaklığı koruyan bir ortam odasında yapılır.
Hareket halindeki sinekleri video kasete almak için, kaydedilecek alanın üzerine bir dijital video kamera asmanız gerekir. Kamera aşağı bakacak şekilde, izleme yazılımımız kontrast tabanlı olduğu için kamerayı bir ışık kutusunun üzerine asıyoruz. Ardından, bir yangın kablosu kablosu kullanarak kamerayı bir bilgisayara bağlayın.
Videoyu doğrudan bilgisayara kaydetmek için Windows Movie Maker yazılım programını kullanıyoruz. Bu protokolde hava darbeleri uygulanacağından, odada bir hava akış kaynağı bulunmalıdır. Kauçuk boru, hava filtrasyonu için hava kaynağını bir karbon filtreye bağlar.
Kauçuk boru ayrıca karbon filtrenin diğer tarafını içi boş bir kauçuk tıpa aracılığıyla bir erlenmeyer şişesine bağlar. Şişe, havayı nemlendirecek yaklaşık yarım inç su ile doldurulmalıdır. Şişe ayrıca, daha fazla kauçuk boru ile Ys şekilli bir valfe bağlanması gereken küçük bir yan kola sahip olmalıdır.
Y valfinin bir kolu bir akış ölçere bağlanırken, diğer kolu kare hareket odasına bağlanır. Bu kare hareket odası, odayı izleme sistemine bağlamadan önce sineklerin oda içinde uçmasını önlemek için küçük damla tepsilerinin eklenmesiyle Wolf Etal 2002'nin tasarımına dayanmaktadır, tüm hazne bileşenlerini sterilize etmek için% 70 etanol kullanmayı unutmayın. Kullanmadan önce bileşenlerin sürmesine izin verin.
Artık izleme sistemi hazır olduğuna göre, sinekleri odaya teslim etmek için sinekleri hareket odasına teslim edebiliriz. Normalde haznenin küçük pleksiglas üst kısmını sabit tutan vidaları çıkarın. Ardından pleksiglas üst kısmı, vida deliği doğrudan iç haznenin üzerine oturacak şekilde konumlandırın.
İletkenlikten hemen önce sinekleri uyuşturmak. Davranışsal bir tahlil, performansı potansiyel olarak tehlikeye atabilir. Anesteziden kaçınmak için, sinekleri odaya hafifçe vurmak için küçük bir çıkışa sahip bir huni kullanın.
Küçük çıkışlı bir huni yapmak için, huninin ucuna bir P 1000 mavi pipet ucu takın. Açıklığı bir sineğin geçebileceği kadar büyük yapmak için pipet ucunun en ucunu kesmek için makas kullanın. Ardından, sinekleri içeren bir test tüpü alın ve huninin üzerine baş aşağı yerleştirin.
Ardından huninin ucunu vida deliğine yerleştirin. Sineklere zarar verebileceği veya zarar verebileceği için huniyi hareket ettirmeyin. Bunun yerine, tüm sinekler odanın içine girene kadar tüm hazne hunisini ve hepsini hafifçe vurun.
Bu çarpmanın şokunu emmek için bir mouse pad kullanın. Sinekler içerideyken, huniyi çıkarın ve pleksiglas üst kısmı vida yataklarının üzerine yeniden yerleştirin, ardından pleksiglas üst kısmı yerine oturtun. Sinekler düzgün bir şekilde yüklendikten sonra, hazneyi bir ışık kutusunun üzerine yerleştirin.
Çevre odasındaki diğer ışıkları kapatın ve sineklerin 30 dakika boyunca odaya alışmasına izin verin. 30 dakikalık alıştırma süresinden sonra, teste başlamak için lokomotor tahlili ile devam edin. Hava akış sistemindeki Y valfini, hava sadece akış ölçere akacak şekilde değiştirin, havayı açın ve havayı istenen hıza kadar yükseltin.
Dakikada dört ila altı litre arasındaki herhangi bir hız işe yarayacaktır. Genellikle dakikada beş ila beş buçuk litre kullanırız. İstenen hava hızına ulaşıldığında, Y valfini, hava hareket odasına akacak şekilde değiştirin.
Bu hava darbesini 15 saniye boyunca zamanlayın ve ardından havayı kapatırken aniden kapatın. Kamerayı kayıt moduna geçirin. Bu adım, hepsini bir kerede yapmak için pratik gerektirir.
Saniyede 10 kare hızında 32. denemeleri ve genotip başına en az sekiz denemeyi kaydediyoruz. Deneme sürümü tamamlandığında kaydı durdurun ve deneme süreleri tamamlandığında filmi kaydettiğinizden emin olun. Lokomotor test videolarının hareket takibini gerçekleştirmek için video analizine devam edebiliriz.
Bu yazılımı kullanabilmek için dinamik görüntü analiz sistemini kullanıyoruz. QuickTime 7.5 0.5 ile videoları A VI dosya formatına dönüştürün. Ardından, kontrasta dayalı olarak sinekleri izlemek için eşiğe göre otomatik izleme işlevini ve ardından sayısallaştırmak için izleme işlevinden yol oluşturma işlevini kullanın.
Bu izlemeler daha sonra her bir sineğin anlık hızlarını bir veritabanı dosyasına çıkarmak için hesaplama parametreleri işlevini uygular. Bu işlev aynı zamanda veri yumuşatmaya da izin verir. 5, 15, 60, 15, 5 yumuşatma penceresi kullanıyoruz.
Bu bilgiler bir veritabanı dosyası olarak çıktısı alındıktan sonra, dosyaları Microsoft Excel'de açıp kaydediyoruz. Excel dosyaları, anlık hızları derlemek ve hareket dinamiklerini anlamak için gerekli ek parametreleri hesaplamak için bir MATLAB komut dosyası kullanılarak işlenir. Ve oyun yapısı.
İşte bu testten temsili bir sonuç. Soldaki şekil, vahşi tip Kanton organizmalarının izlerini gösterirken, sağdaki şekil, üst üste binen iki büyük delesyonun çaprazlanmasıyla oluşturulan dask geni için boş olan sinekleri göstermektedir. Paradigmamızda görebileceğiniz gibi, Dask boş sinekleri, literatürde farklı bir lokomotor test türü kullanılarak daha önce bildirilmiş olan Kanton S'ye kıyasla büyük ölçüde azalmış hareket gösterir.
Size az önce bir lokomotor video izleme testinin nasıl kurulacağını ve çalıştırılacağını gösterdik. Bu prosedürü yaparken, sirkadiyen ritim sorunlarından kaçınmak için tahlilleri her gün aynı iki ila üç saatlik zaman aralığında gerçekleştirmeyi hatırlamak ve davranışsal tepkilerin belirli bir günde normal aralıkta olduğundan emin olmak için her zaman önce vahşi tip organizmaları çalıştırmayı unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, Drosophila melanogaster'deki lokomotor davranışları kantitize etmek için yüksek çözünürlüklü bir video izleme sistemi kullanan bir yöntemi gösterir. Prosedür, anestezi kullanmadan uçak hareketinin detaylı analizini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Davranış Analizi
- Video İzleme Teknolojisi
Arka Plan
- Drosophila melanogaster, lokomosyonu incelemek için bir model organizmadır.
- Hareketin kantitize edilmesi, karmaşık davranışları anlamak için gereklidir.
- Yüksek çözünürlüklü izleme sistemleri, hareket analizinin doğruluğunu artırır.
- Bu çalışma, alanındaki araştırmacılar için bir protokol sunar.
Çalışmanın Amacı
- Uçak lokomosyonunu izlemek için bir yöntemi göstermek.
- Araştırmacılar için detaylı bir protokol sağlamak.
- Drosophila'da karmaşık lokomotor davranışların incelenmesini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Uçaklar, anestezi olmadan kare gözlem odasına yüklenir.
- Bir huni, uçakları odaya yönlendirmek için kullanılır.
- Vidolar odacık deliklerini kapatır ve hava darbeleri lokomosyonu başlatır.
- Hareket analiz için bir video kamera tarafından kaydedilir.
Ana Sonuçlar
- İzleme sistemi, uçak hareketini başarıyla kaydeder.
- Hareket yolları bir bilgisayar tarafından izlenir ve analiz edilir.
- Yöntem, lokomotor davranışın kantitize edilmesini sağlar.
- Sonuçlar, uçaklarda çeşitli davranışsal yönleri incelemek için kullanılabilir.
Sonuçlar
- Yüksek çözünürlüklü izleme sistemi, Drosophila lokomosyonunu incelemek için etkilidir.
- Bu yöntem, davranışsal sinirbilim araştırmalarını geliştirebilir.
- Diğer uygulamalar arasında genetik modifikasyonların hareket üzerindeki etkilerini incelemek yer alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying locomotor behavior in model organisms enables mechanistic de-risking of neuropharmacological targets by linking genetic perturbations to functional phenotypes. This high-resolution video tracking approach supports target validation through reproducible, quantitative phenotyping in Drosophila, a genetically tractable system for early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing real-time, anesthesia-free behavioral readouts that reflect neuronal circuit function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring locomotor output as a functional readout of neuronal activity.
- Operational Value: Supports biological de-risking through anesthesia-free, real-time quantification of movement parameters such as speed, acceleration, and bout structure.
- Strategic Value: Facilitates phenotypic screening of genetic models to clarify pathway involvement and prioritize targets with strong behavioral correlates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, contrast-based video tracking with 10 msec temporal resolution for high-content locomotor phenotyping.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via controlled environmental conditions (25°C, 70% humidity) and standardized air pulse initiation.
- Strategic Value: Generates quantitative outputs (average speed, max speed, time in motion) suitable for automated analysis and cross-genotype comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by linking locomotor deficits to genetic modifications, such as Dask null phenotypes.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation using consistent behavioral endpoints across studies.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by offering mechanistically interpretable, quantifiable behavioral data.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by transforming genetic or pharmacological manipulations into quantifiable locomotor phenotypes, supporting hypothesis testing and lead optimization.
- Discovery Biology: Enables pathway clarification and target validation by correlating genetic lesions with changes in locomotor dynamics.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chamber setup, air pulse delivery, and contrast-based tracking software.
- Analytics: Outputs instantaneous speed, acceleration, and bout structure data for statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a scalable, reproducible phenotyping platform for neurobehavioral assessment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening genetic models, pharmacological compounds, or environmental stressors in Drosophila-based discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in behavioral phenotypes through high-resolution, real-time tracking.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via controlled environmental parameters and automated trajectory analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by supplying objective, quantitative locomotor data that reduces reliance on subjective scoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on behavioral effect size and reproducibility across genetic backgrounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, behavioral assay design, and video-based motion tracking software.
- Dependent on imaging infrastructure including a contrast-sensitive camera, light box, and airflow delivery system for pulse initiation.
- Necessitates cross-team standardization of environmental controls (temperature, humidity, light cycle) and acclimation protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different chamber sizes, fly densities, or genetic backgrounds affecting motility.
- Limited by the need for manual fly loading via funnel and air pulse timing, which requires operator training for consistency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Introduction
1:06
Feeding and management of flies
1:54
Setting up the tracking system in a controlled environment
3:46
Delivering flies to the locomotion chamber
5:25
Running the Locomotor Assay
6:29
Analysis of Videos
7:57
Representative Results
8:35
Conclusion
