Name: Kemik İliği Hematopoetik Hücreler, Homing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Keşfedin kemik iliği hematopoetik hücrelerin homing mekanizmasını izole etme, boyama ve takip yöntemleriyle. Bu protokol genetik olarak farklı hayvanlarda hücre göçünü karşılaştırmak için kullanılır ve transplantasyon başarısını artırmaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu protokol Dr David Scadden laboratuvar test ve optimize edilmiştir. Finansman, Dana-Farber Kanser Enstitüsü / Massachusetts Genel Hastanesi Klinik Hematoloji ve Onkoloji Burs Programı tarafından sağlanmaktadır.

<ol><li> Biz, deneyde kullanılmak üzere hücrelere açılan homing deney başlar. Alıcı hayvanların uzun kemiklerde nişler tüm kemik iliği homing WT C57BL/6J (WT) gibi hayvanlardan elde edilen kemik iliği hücreleri için farklı ve transgenik olanlar eğer bu deneme için biz bulmaya ilgilenen Lysophosphatidic Reseptör 1 (LPAR1) (KO) nakavt. </li><li> Deney başlamadan önce, bu deney için gerekli malzemeleri toplamak. Hücrelerin yerine ex-vivo analizi için kullanılan bir alıcı hayvan nakledilen olacak laboratuvar, özellikle tüm fare diseksiyonları bir laminer akış doku kültürü kaputu yürütülmektedir. Biz kaput içinde mavi bir levha koyarak başlar. Ihtiyaç duyulan diğer nesneleri forseps bir çift ve otoklavda sterilize edilmiş keskin bir makas, neşter ve alkol steril tek kullanımlık bezlerden içerir. Biz değiştirilmiş PBS ve steril bir 6 plaka, harç gerekecektir, havaneli şart, 50cc mavi konik tüp ve 70uM bir tek filtre tepesinde. </li><li> Biz bir WT ve bir KO fare alarak başlar. </li><li> Bu fareler, CO 2 Solunduğunda ötenazi ve daha sonra 5 saniye boyunca% 70 isopropranolol batırılmış. Bu adım, kirlenmesini fare kürk ve bizim ellerimizde ilgi hücreleri, hücreler ya da deneysel sonuçlar verim herhangi bir uzlaşma değil önler. </li><li> Fareler daha sonra bir çift forseps ve keskin bir makas kullanarak sırayla disseke edilir. Biz genellikle rutin bir mesele olarak WT fare ile başlar. Küçük bir snip, karın ve deri daha sonra ellerini kullanarak gerilir üzerinde fare ventral deri yapılır. Cilt kolayca arka bacaklarda çıkıyor. Femur ve tibia sonra femur başı, bu büyük bir miktar kemik iliği içerdiğinden çıkarmak için özen ayıklanır. Üst ekstremitelerde, gövde hareketsiz tutarak sadece onlara çekiş uygulanarak hayvan gövde ayrıdır. Bu, tek parça olarak üst ekstremitelerde kaldırır. Humeri sonra üst ekstremitelerde ayıklanır. </li><li> Kaldırılan kemikler 6 kuyucuğu eklenmiş olan modifiye PBS yerleştirilir. Modifiye PBS ısı inaktive fetal Bovine Serum ve EDTA 0,5 M pH8 2 cc 2 ml ekleyerek yapılır. Bu çözüm daha sonra bir Nalgene 0.45 um filtre süzülür 4 santigrat derece sıcaklıkta ve en az bir ay süreyle saklanabilir. </li><li> WT ve KO kemikleri doğru tespit edebilmek için plakasını kuyuların etiketlemek için esastır. </li><li> Fare karkaslar kaldırılır ve bertaraf. </li><li> Yeni bir sayfa kaput yerleştirilir ve kemikler tek bir neşter kullanılarak temizlenir. </li><li> Temizlenmeli kemiklerin harcı bir süre tek bir fare yerleştirilir. İki ml modifiye PBS harç eklenir ve kemiklerin bir havaneli kullanarak ezilmiş. Sonra 10 ve havaneli fro hareketleri ve kemikleri dairesel dönme hareketleri ile onları ezebileceği ilk parça için önemli. Ben genellikle 50 saat yönünde, daha sonra 50 saat yönünün tersine hareketleri yapmak ve böylece havanda sol malzeme, renk ve modifiye PBS beyaz kadar beyaz veya şeffaf kalır malzeme eklendi. </li><li> 50 dairesel kırma hareketleri her ayarladıktan sonra, harç, 50 ml konik tüpün üstüne yerleştirilen 70 UM filtre sıvı transferi. Filtre Her aktarımdan sonra harç 2 ml PBS eklemek için ihmal etmeyin. Denemek ve bu hücrelerin apoptozis yol açacak gibi ezebileceği kuru kemiklerin veya uzun bir süre için onlara kuru ayrılmak istemiyorum. </li><li> Harç malzemesi beyaz olduktan sonra, filtre malzemesi harç transfer ve kırma tekrar yapılır. Bu filtre hücreleri israf edilmemesini sağlar. Genellikle hücre çıkarma, hangi zamanda harç beyaz renkli malzeme tekrar yapmak için bir veya iki adet dairesel dönme hareketleri alır. </li><li> Konik tüp çözüm (lütfen WT ve KO fare ayrı hücrelere tutmak için unutmayın. Dolayısıyla 1200 rpm&#39;de 10 için iki farklı boru (KO hücreleri ile WT hücreleri bir diğer). Santrifüj olacak santrifüj dakika. </li><li> Her tüp için ayrı aspiratör pipetler kullanarak süpernatantı aspire. ACK lizis tamponu 2 cc her pelet ekleyin. Bu lizis tamponu steril olmalıdır. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Her tüpe 8 cc modifiye PBS ekleyin. 96 plaka iki ayrı kuyu içine her tüpten 10 ul ve pipet alın. Santrifüj tüpleri yerleştirin ve 10 dakika 1200 rpm&#39;de onları döndürün. </li><li> Tüpler iplik olmasına rağmen, ilgi hücreleri taşıyan 96 plaka her kuyuya tryphan mavisi 30 ul ve modifiye PBS 60 ul ekleyin. </li><li> Bir hemasitometre ekleyin ve bu karışımı 10 ul (yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın lütfen) dört dış kare hücreleri saymak. </li><li> Ml başına her örnek hücre sayımı, 4 ve multiplie bölünmüş böylece sayılır hücrelerinin sayısı100 000 d. </li><li> Santrifüj tamamlandıktan sonra, santrifüj tüpleri kaldırmak ve ml&#39;de 20 milyon hücre bir konsantrasyonda kalsiyum, magnezyum veya L glutamin olmadan PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Büyük olasılıkla, KO hayvan için WT ve 5 ml hacim hacmi yaklaşık 5 ml olacak. Biz bu adımı itibaren protokol PBS değişmiyor PBS kullanarak olacak. </li><li> Her tüp eklemek DII, bir hücre boyama boya, 5uM son bir konsantrasyon elde etmek için. 10 saniye vorteksleyin. 37 derece 10 dakika inkübe edin ve ışığa maruz kalmasını önlemek. </li><li> Tüpler 1200 rpm&#39;de 10 dakika süreyle PBS ve spin ile doldurun. </li><li> Santrifüj sonra, süpernatant aspirat ve ml&#39;de 40 milyon hücre PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 27G iğne (WT fare ve KO fareler için 5 şırınga için 5 şırınga) ile 1 cc şırınga içine 500 ul yükleyin. Her kohort için 6 şırınga hazırlamak için ihtiyatlı olabilir. Önümüzdeki yapacağız kuyruk ven enjeksiyonları yanıltıcı olabilir gibi ekstra bir tane yardımcı olabilir. </li><li> Dağılmakta DII tutmak için şırınga folyo ile örtün. </li><li> 500 ul her bir alıcı hayvan hücresi karışımı enjekte edilir (her kohort için 5). </li><li> Bu hayvanlar, enjeksiyon için 4-24 saat önce 9 Gy ışınlama ile ışınlanmış olması gerekir. </li><li> Enjeksiyon sonrası 48 saat, her alıcı hayvanın arka bacaklarda hasat kemik iliği. </li><li> Bağışçılar için yukarıda açıklandığı gibi işleyin. PBS 1 cc her hayvan hücreleri tekrar Hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı alın. </li><li> BD gelen LSR II akış sitometresi veya eşdeğer bir enstrüman okuyun. Sonuç DII pozitif analiz kemik iliği hücrelerinin yüzdesi ya da mutlak sayısı olarak ifade edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Adams, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+at+the+endosteal+niche+is+specified+by+the+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor.</a> Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).</li>
<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).</li>
</ol>

Homing süreci bu sayede kemik iliği hücreleri kök hücreleri, progenitör hücreler ve farklı hücreler, kan akışı veya farelerde kemik iliği boşluğuna enjekte edildikten sonra kemik iliği onların yol içine dahil. Tanımı açık olarak, bir bilim adamı, hematopoietik kök hücre, progenitör hücreler ya da hücre sıralayarak izole işaretleyicidir tarafından belirlenen ve farklılaşmış hücrelerin homing çalışma seçebilirler. Tipik olarak, bilim adamları, soy belirteçler için tükenmiş kemik iliği hücreleri enjekte ve dolayısıyla prog...

<table><tbody><tr><td>DPBS (Dulbecco&amp;rsquo;s Fosfat Tamponlu Salin Çözeltisi)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Steril Fetal Bovin Serumu</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>BS3033</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA (pH 8.0)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-150</td><td></td></tr><tr><td>Tryphan Blue çözeltisi</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lizleme Tamponu</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Isopropranolol U.S.P.</td><td>Denison Pharmaceuticals, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD hücre etiketleme çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI hücre etiketleme çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

kemik İliği hematopoetik hücreler, homing

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing nakledilen hematopoetik hücreler ve aşılamak ya da kemik iliği ikamet kurmak mümkün sağlayan bir olgudur. Çeşitli chemomkines ve reseptörler hematopoietik kök hücre homing katılıyor. [1, 2] Bu yazıda, hematopoietik kök hücre çalışmalarında kullanılan klasik homing protokol özetliyor. Genel olarak bu homing ihtiyaçları araştırılmalıdır hücre popülasyonu izole Bu nüfusun ilgi bir boya ile boyanması ve bu hücrelerin bir alıcı hayvan kan akışı içine enjekte içerir. Alıcı hayvan sonra enjeksiyon ve ilgi boya için pozitif hücrelerin yüzdesi ya da mutlak sayısı için değerlendirilen kemik iliği sonra önceden belirlenmiş bir zamanda kurban. En yaygın deneysel şemaları, genetik olarak farklı iki hayvanlardan elde edilen hematopoietik hücreleri (vahşi bir hayvan ve ilgili knock-out) homing verimlilik biri karşılaştırılır. Bu makale, deney gibi çerçevesinde hematopoetik hücre homing protokol tanımlamaktadır.

Bu makale, kemik iliği hematopoetik hücrelerin kendi nişler homing çalışma için kullanılan bir protokol tanımlamaktadır.

Kemik İliği Hematopoetik Hücreler, Homing

Homing, transplant edilen hematopoetik hücrelerin kemik iliğine göç edebildiği ve burada tutunabildiği veya yerleşebildiği fenomendir. Çeşitli...

Homing, transplant edilen hematopoetik hücrelerin alıcının kemik iliğine giden yolu bulması fenomenidir. Bu makale, hematopoetik hücrelerin kemik iliğindeki ilgili bölgelere homing sürecini incelemek için bir protokol tanımlamaktadır. Bu işlem, ilgili hücre popülasyonunun izole edilmesi, bu popülasyonun bir boya ile boyanması ve alıcı hayvanın kan dolaşımına enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir.Belirli bir süre sonra, hayvan vücudundaki boyaya pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir. Bu yöntemle, genetik olarak birbirinden farklı iki hayvandan alınan bu hücrelerin homing verimliliği karşılaştırılabilir. Merhaba, ismim RHI Reen Yusef; Massachusetts General Hastanesi Rejeneratif Tıp Merkezi ve Harvard Kök Hücre Enstitüsü'nde, Dr. David Skadden'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım.Bugün sizlere, hematopoetik kök hücrelerin normalde bulundukları yer olan kemik iliğine yönelimini (homing) incelemek için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu protokolü, çeşitli genetik olarak değiştirilmiş farelerden elde edilen hematopoetik kök hücrelerin yönelimleri arasındaki farkları incelemek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Homing deneyine başlamak için, hem WT hem

homing-of-hematopoietic-cells-to-the-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Kemik iliğindeki histolojik verileri kantitatif olarak analiz etmek için bir strateji sunulmuştur. Doku kesitlerindeki floresan etiketli hücrelerin konfokal mikroskobu, otomatik olarak analiz edilen 2 boyutlu görüntülerle sonuçlanır. Farklı hücre tiplerinin birlikte lokalizasyon analizleri, simüle edilmiş görüntülerden elde edilen verilerle karşılaştırılarak hücresel etkileşimler hakkında nicel bilgiler verilir.

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Farelerde farklı insanlaştırılmış kemik iliği nişleri oluşturmak ve canlı görüntü oluşturmak için bir yöntem sunulmuştur. İnsan mezenşimal hücreleri tarafından oluşturulan destekleyici niş dayanarak, insan endotel hücrelerinin eklenmesi, insan damarlarının oluşumunu indüklerken rhBMP-2 ilavesi, insan-fare kimerik olgun kemik dokusunun oluşumunu indükler.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Burada, insan kemik iliğinin in vivo yapısının karmaşıklığını yansıtan, çok çeşitli normal ve patolojik olayları ince bir şekilde incelemek için uygun bir model sağlayan, uygulaması kolay, standartlaştırılmış, mikrofizyolojik bir sistemi tanımlıyoruz.

Fizyolojik veya Tümöral Bağlamlarda Yerleşik Hücreler Arasındaki Dinamiği ve Etkileşimleri Araştırmak için Bir İnsan Kemik İliği 3D Modeli

Biz, gelişimi sırasında büyük bir hematopoetik organ olarak plasenta tespit ettik. Biz, hematopoietik kök hücreler (HKH'lerin) üretilen ve benzersiz microenvironmental nişler içinde plasenta genişletilmiş iki bulundu. Burada, fare plasenta HKH'lerin izolasyonu ve görselleştirme için gerekli deneysel teknikler açıklanmaktadır.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Keşfedin kemik iliği hematopoetik hücrelerin homing mekanizmasını izole etme, boyama ve takip yöntemleriyle. Bu protokol genetik olarak farklı hayvanlarda hücre göçünü karşılaştırmak için kullanılır ve transplantasyon başarısını artırmaya yardımcı olur.

Kemik İliği Hematopoetik Hücreler, Homing

Daha fazla video keşfet