Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Opus Lavu Sitlerinin mikroenjeksiyonu, ardından ince kesitli elektron mikroskobu, nükleo sitoplazmik taşınmayı incelemek için mükemmel bir sistemdir. Bu deneyde, oositler kollajenaz ile yaprakları dökülür ve altıncı aşama sitler seçilir ve çok kuyulu bir tabağa yerleştirilir. Sitler daha sonra, substratın çekirdeğe girmesine izin vermek için sitlerin oda sıcaklığında inkübe edilmesinden sonra bir nükleer ithalat substratı ile mikro enjekte edilir.

Sitler sabitlenir ve diseke edilir. Diseke edilen sitler, düşük erime noktalı arolara gömülür, tekrar osmiyum tetroksit ile sabitlenir, kurutulur ve bir epoksi reçinesine gömülür. Epoksi gömülü numuneler bir ultra mikrotom ile kesitlere ayrılır ve kesitler bir bakır em numune ızgarası üzerine yerleştirilir.

Boyamadan sonra, kesitler bir transmisyon elektron mikroskobu altında görselleştirilir. Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Zooloji Bölümü'nden Dr.Nellie Pane'in laboratuvarından Sarah Cohen. Ben Shelly Ow, aynı zamanda Panta laboratuvarından.

Bugün size Zenap Lavis Sitlerinin Mikroenjeksiyonu için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü virüs gibi kargoların nükleer ithalatını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Deneye başlamak için, 20 mililitre kollajenaz çözeltisi içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yaklaşık iki santimetrelik Zenap Lavis yumurtalığından küçük bir parça yerleştirin. Kollajenaz, sitleri çevreleyen folikül hücrelerini çıkarır, daha sonra tüpü çalkalayıcı platformuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca 100 RPM'de hafifçe roketleyin. Bu süre farklı kollajenaz lotlarına göre değişir.

Bu nedenle, bir saat sonra, sitlerden küçük bir örnek alın ve bunları diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Gereken şekilde. Yaprakları dökülmüş sitler birbirinden iyi bir şekilde ayrılmalıdır. Kolayca kaydığını görmek için bir sirke içine bir cam iğne sokun.

Sitler yeterince yaprak dökmemişse, kollajenaz çözeltisinde bırakın ve her beş dakikada bir tekrar kontrol edin. Sitler yeterince deregüle edildikten sonra, modifiye edilmiş çubuk salin ile üç kez yıkayın ve MBS artı% 1 Penisilin streptomisin içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, mikroenjeksiyon için olgun aşama altı sitleri seçin.

Bu sitler büyüktür ve siyah hayvan yarımküresi ile kremsi renkli bitkisel yarımküre arasında iyi bir kontrast vardır. Olgun aşama altı sitleri çok kuyulu bir tabağa aktarın. Bunu yapmak için, oositlerin kesintisiz emilmesine izin vermek için ucunda kesilmiş bir pipet ucuna sahip 200 mikrolitrelik bir pipetleyici kullanın ve oositleri dikkatlice çok kuyucuğa aktarın.

10 mikrolitrelik kuyu hacmine sahip mikro kuyu olmayan bir çanak kullanıyoruz, EO siteleri artık mikro enjeksiyona hazır. 10 mikrolitre substrata bir mikrolitre %1 brom fenol mavisi ekleyerek mikro enjekte edilecek içe aktarma substratını hazırlayın. Brom fol blue boya, mikroenjeksiyonun görselleştirilmesini sağlar.

Daha sonra 100 milimetre çapında bir Petri kabına küçük bir paraform şeridi yerleştirin ve param şeridi üzerine beş mikrolitrelik bir damla enjeksiyon çözeltisi dağıtın. Daha sonra, enjeksiyon artı Matt Çektirme ile 6,6 mikrolitrelik bir Drummond mikro pipeti çekerek bir enjeksiyon iğnesi elde edin İğne üzerinde her 0,5 milimetrede bir nokta işaretleri yaparak enjeksiyon iğnesini kalibre edin, bu da 50 nanolitrelik bir hacme karşılık gelir. Mikro enjektörü aspirasyon moduna ayarlayın ve iğneyi sitoplazmik enjeksiyon için enjeksiyon solüsyonu ile doldurun.

İğnenin ucunu, yaklaşık 45 derecelik bir açıyla hayvan yarım küresine çok yakın olan bitkisel yarımküredeki bir sirke sokun. Ardından mikro enjektör ayarını mikro enjeksiyona çevirin ve her bir sirke 50 nanolitre içe aktarma substratı ile mikro enjeksiyon yapın. Enjeksiyonlar tamamlandığında enjekte edilen substrat miktarını izlemek için iğne üzerindeki nokta işaretlerine dikkat edin.

Sitleri MBS ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Sitleri oda sıcaklığında istenen süre boyunca inkübe edin. Nükleer zayıf kompleksler veya NPC'lerle ilişkili içe aktarma substratının gözlemlenmesine izin veren zaman noktalarını seçin.

NPC'ye aktif olarak taşınan proteinler ve virüsler için genellikle 10 ila 30 dakika arasındaki zaman noktalarını kullanırız. Bu zaman noktaları aynı zamanda enjeksiyon bölgesine ve proteinin boyutuna da bağlıdır. İnkübasyon tamamlandığında, sitleri MBS'de% 2 glutaraldehit içeren dört mililitrelik bir cam şişeye aktarın ve ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin, sitleri MBS ile üç kez yıkayın, şimdi sitleri incelemeye hazırız.

Sitleri düşük tuz tamponu ile doldurulmuş küçük Petri kabına aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu ve diseksiyon cımbızı kullanarak, sebze direğini her oositten çıkarın. Oositi bir cımbızla stabilize etmek faydalıdır, diğer çift ise bitkisel direği çıkarmak için makas gibi kullanılır, bu diseksiyon adımı, elektron mikroskobu için numuneleri keserken ve kesitlere ayırırken çekirdeği bulmayı çok daha kolay hale getirir.

Bu noktada, sitozolde mavi bir renk tonunun varlığı, başarılı bir mikroenjeksiyon olduğunu gösterir ve başarılı bir şekilde mikro enjeksiyon yapılmamış sitleri atar. Daha sonra, disseke edilen sitleri tekrar LSB'de% 2 glutaraldehit ile fiksasyondan sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca sabitleyin, disseke sitleri LSB ile üç kez yıkayın. Sitler yıkandıktan sonra, enjekte edilen oositleri gömme ve ince kesit alma için hazırlamaya hazırız.

Disseke edilmiş oositleri bir çöküntü slaytına aktarın, mümkün olduğu kadar çok sıvıyı aspire edin ve ardından kurumaması için hızlı hareket edin. Aros hala yumuşakken disseke edilmiş sitleri %2 düşük erime noktalı aros ile örtün. Sitleri birbirinden ayırmak için bir pipet ucu kullanın ve her bir sitin yukarı veya aşağı baktığından, ancak yanlara doğru olmadığından emin olun.

Agrosların yaklaşık 10 dakika katılaşmasına izin verin. Agros katılaştıktan sonra, arosları her biri bir disseke sit içeren küçük parçalara ayırmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Daha sonra aros gömülü sitleri dört mililitrelik bir cam şişeye yerleştirin ve döner bir karıştırıcı direk kullanarak, oda sıcaklığında bir saat boyunca LSB'de% 1 osmiyum tetroksit ile sabitleyin.

Bir saat boyunca sabitledikten sonra, gerekirse numuneyi LSB'de üç kez yıkayın. Numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede saklayın ve ertesi gün protokole devam edin. Numuneleri sırayla %50 %70 ve %90 etanol içinde 20 dakika dehidre edin, ardından her biri 15 dakika boyunca %100 etanol içinde iki kez kurutun.

Son olarak, dehidrasyon adımları tamamlandıktan sonra numuneleri 15 dakika boyunca %100 aseton ile kurutun. Numuneleri bir saat boyunca bire bir epon, flua ve aseton karışımı ile sızın, ardından iki saat boyunca iki ila bir epon ve aseton karışımı ile infiltrasyonu ve son olarak en az altı saat boyunca saf epon içinde infiltrasyon yapın. Son sızma adımı tamamlandığında, numuneleri taze, saf epon ile doldurulmuş düz gömme kalıplarına yerleştirin.

Sitleri, çekirdeğin enjeksiyon bölgesine daha yakın olan tarafı kesilecek şekilde yönlendirin. Birinci. Bu durumda, diseke edilen sitlerin tarafı bölümlere ayrılacaktır. İlk olarak, bu adım, seçilen alt tabakanın içe aktarılmasını görselleştirme şansını optimize eder.

Sitler düzgün bir şekilde yönlendirildikten sonra, epro'yu 60 santigrat derecede iki gün boyunca polimerize edin. Polimerizasyon adımından sonra, bir ultra mikrotom kullanarak epoksi gömülü numunelerin 50 nanometre kalınlığında kesitlerini elde edin. Bölümleri bir bakır em numune ızgarası üzerinde toplayın, numuneleri boyayın ve bunları bir transmisyon elektron mikroskobu altında görselleştirin.

Protokol başarılı olduysa, nükleer zarf ve NPC'ler em mikrograflarında açıkça görülebilir olmalıdır. Enjekte edilen substrata ve enjeksiyon ile fiksasyon arasındaki süreye bağlı olarak, substrat NPC'deki NPC'nin sitoplazmik yüzünde veya NPC'nin nükleer yüzünde görünür olmalıdır. Bu temsili sonuç, vao virüsünün kapsidleri ile enjekte edilmiş bir zenap sitinden bitişik sitoplazma ve çekirdeğe sahip bir nükleer zarf kesitini göstermektedir.

A-C-M-N-P-V ok uçları NPC'leri gösterir ve bir NPC'nin sitoplazmik yüzüne kenetlenen bir kapsid beyaz bir okla gösterilir. Buna karşılık, bu şekil, farelerin parvo virüsü ile enjekte edilmiş bir zenap oositinden bitişik sitoplazma ve çekirdeğe sahip bir nükleer zarf kesitini göstermektedir. Bu tekniği kullanarak, MVM'nin nükleer zarfın bozulmasına neden olduğunu bulduk.

Parantezler nükleer zarftaki kırılmaları gösterir. Ok uçları NPC'leri gösterir ve nükleer zarfla ilişkili varsayılan MVM kapsidleri beyaz oklarla gösterilir. Size az önce xap levu sitlerini nasıl mikro enjekte edeceğinizi ve inceleyeceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, farklı kollajenaz lotlarının değiştiğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, yaprak dökümü için en uygun zamanı belirlemek için kolajenazınızı dikkatlice test edin. Ayrıca, yaprak dökme ve MBS yıkama adımından sonra, sitler mikroenjeksiyondan önce bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklanabilir.

Son olarak, kalçanızı her zaman buzun üzerinde saklamak için tutun ve asla ozun kurumasına izin vermeyin. Tüm dehidrasyon ve sızma adımları sırasında tamamen suya batırılmalıdırlar. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.