Name: Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Öğrenin, Xenopus laevis oositlerine mikroenjeksiyon yaparak nükleer ithalat substratlarının hücre içi taşımını inceleyin. Bu yöntem, ince kesit elektron mikroskobisi ile nükleoplazmik transport mekanizmalarını görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

David Theilmann (Pasifik Agri-Gıda Araştırma Merkezi, Summerland, British Columbia) bakülovirüs AcMNPV sağlamak ve yararlı bir tartışma için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Kanada Yenilik Vakfı (CFI), Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR), Michael Smith Sağlık Araştırması (MSFHR) Vakfı Enstitüleri ve Doğa Bilimleri Fakültesi ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) hibe tarafından desteklenen .

Bölüm 1: mikroenjeksiyon için Xenopus oosit hazırlanması <ol><li> Xenopus laevis yumurtalık bir küçük parça (yaklaşık 2 cm) 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.82 mm: kalsiyum-ücretsiz modifiye Barth Kullanıcı tuzlu su 20 ml kollajenaz çözüm (5 mg / ml kollajenaz içeren bir 50 ml konik tüp içine yerleştirin MgSO 4, 10 mM HEPES, pH 7.5). Kollajenaz oosit çevreleyen folikül hücreleri çıkarmak için kullanılır. </li><li> Çalkalayıcı platform üzerinde tüp yerleştirin ve bir saat (100 RPM) hafifçe sallayın. Bu sefer farklı birçok kollajenaz ile değişir. Böylece bir saat sonra oosit, küçük bir örnek alır ve onları incelemek diseksiyon mikroskobu altında. Düzgün de folliculated oosit birbirinden ayrılmış olmalı ve bu yumurtanın içine bir bardak iğne eklemek için kolay olmalıdır. Oosit yeterince de folliculated değilseniz, kollajenaz çözüm sol ve her beş dakikada bir tekrar kontrol edilir. </li><li> (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.82 mM MgSO 4, 0.33 mM Ca (NO 3) 2, 0.41 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, pH 7.5) modifiye Barth en tuzlu oosit üç kez yıkayın, ve bunları aktarmak MBS artı% 1 penisilin / streptomisin içeren bir 100 mm çaplı Petri kabı. Oosit artık microinjected hazır. Mikroenjeksiyon başka bir gün yapılacak ise, bir hafta boyunca, 4 ° C&#39;de oosit saklayın. </li><li> Diseksiyon mikroskop kullanarak, mikroenjeksiyon için olgun sahne VI oosit seçin. Bu oosit siyah hayvan yarımkürede arasında iyi bir kontrast ve krem ​​renkli bitkisel yarımkürede, büyük. </li><li> Bir kuyu plaka (Nunc, 10 ul iyi hacim) olgun aşamasında VI oosit aktarın. Bu oositlerin undisrupted emme izin sonunda kesilmiş bir pipet ucu ile 200-ul pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. </li></ol> Bölüm 2: Xenopus oositleri Mikroenjeksiyon <ol><li> Mikroenjeksiyon görselleştirme yardımcı olmak için,% 1 bromphenol mavi küçük bir miktar ekleyerek microinjected ithalat substrat hazırlayın. Örneğin, substrat 10 ul bromphenol mavi 1 ul ekleyin. </li><li> 100 mm çaplı Petri kabı Parafilm küçük bir şerit yerleştirin ve Parafilm şerit enjekte edilecek çözümün bir 5-ul damla dağıtmak. </li><li> Enjekte edilebilir bir çözüm ile daha önce kalibre edilmiş bir enjeksiyon iğnesi (enjekte + Matic Çektirme 6.6-ul mikropipet Drummond çekerek edilen) doldurun. Bunun için, mikroenjektör aspirasyon modunda ayarlanır. 50 nl bir birime karşılık her 0.5 mm, enjeksiyon iğnesi kalibre etmek için iğne nokta işaretleri yapmak. </li><li> Sitoplazmik enjeksiyon için, yaklaşık 45 derecelik bir açıyla, hayvan yarımkürede çok yakın, bitkisel yarımkürede bir oosit içine iğne ucu takın. Microinject mikroenjektör ayarı açın ve ithalat substrat 50 nl her oosit microinject. Iğne nokta işaretleri enjekte edilmiştir substrat miktarını izlemek için kullanılır. </li><li> Enjekte edilen oosit MBS ile dolu bir küçük (35 mm çap) Petri kabı Transferi, ve zaman istenilen miktarda oda sıcaklığında inkübe NPC&#39;ler ile ilişkili ithalat yüzey gözlem izin verecek şekilde (zaman noktaları seçilir; Bu durumda proteinler ve aktif NPC doğru taşınır virüsler için 10 ile 30 dakika arasında, bu sefer de) enjeksiyon yerinde ve protein / virüs boyutunu bağlıdır. </li><li> Inkübasyon tamamlandığında, MBS% 2 glutaraldehyde içeren 4 ml cam şişe oosit transferi, ve 4 gecede düzeltmek ° C </li></ol> Bölüm 3: Xenopus oositleri Diseksiyon <ol><li> Ertesi gün, MBS oosit 3 kere yıkayın. </li><li> Düşük tuz tamponu (: 1 mM KCl, 0.5 mM MgCl 2, 10 mM Hepes, pH 7.5 LSB) ile dolu küçük bir Petri kabı oosit aktarın. Diseksiyon mikroskobu kullanma ve cımbız diseksiyon her oosit bitkisel kutup çıkarın. Diğer çifti makas gibi bitkisel kutup kaldırmak için kullanılır, bir çift cımbız ile disseke oosit stabilize etmek için yararlıdır. Bu noktada sitoplazmada mavi bir belirti varlığı mikroenjeksiyon başarısını değerlendirmek mümkündür. Protokolü sadece başarıyla microinjected oosit devam etmektedir. Buna ek olarak, örnekleri, EM için hazırlıklı olmak, bu diseksiyon adım kırparak ve numunelerin kesit çekirdeğini bulmak için çok daha kolay hale getirir. </li><li> % 2 oda sıcaklığında bir saat LSB glutaraldehid disseke oosit tekrar sabitleyin. </li><li> Fiksasyon sonra, LSB disseke oosit üç defa yıkamak. </li></ol> Bölüm 4: Injected Oosit gömme ve EM İnce-Kesit için hazırlanması <ol><li> Disseke oosit bir depresyon slayt aktarın. Pos olarak sıvı aspire(bu yüzden kurumasına kalmamasıdır) sible ve sonra hızlı bir şekilde% 2 düşük erime agaroz ile disseke oosit kapsar. Agaroz hala yumuşak olmasına rağmen, oosit birbirinden ayırmak için bir pipet kullanın ve her oosit yüzü yukarı veya aşağı olduğunu sağlamak için (yanlara değil). </li><li> Agaroz yaklaşık 10 dakika katılaşmasını sağlayın. Agaroz katılaşır sonra, küçük parçalar halinde, her bir disseke oosit içeren içine agaroz kesmek için jilet kullanın. </li><li> Agaroz gömülü oosit 4 ml cam şişe yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saat için% 1 LSB olarak 4 OsO sonrası onları düzeltmek. </li><li> Örnek LSB üç kez yıkayın. Gerekirse, 4 ° C gecede numune saklamak ve ertesi gün devam protokol. </li><li> Sırayla (20 dakika her biri için 50, 70, ve% 90 etanol), alkol artan serisi örnekleri kurutmak. Bu, 15 dakika her biri için% 100 etanol iki değişiklikleri takip eder. Son 15 dakika için% 100 aseton ile örnekleri kurutmak. </li><li> ,, En az altı saat süreyle 2:1 iki saat EPON ve aseton karışımı ve sonunda saf EPON infiltrasyonu ile takip bir saat 01:01 EPON karışımı (Fluka) ve aseton, örnekleri Infiltrate. </li><li> Taze saf EPON düz gömme kalıplara yerleştirin örnekleri ile dolu. Oosit şekilde odaklı olduğunu enjeksiyon yakın çekirdeğin yan - Bu durumda disseke olmuştur oosit yan ilk kesitli olacak. Bu adım, seçilen substrat ithalat görselleştirme şansı en iyi hale getirir. </li><li> Son olarak, iki gün, 60 ° C için EPON polimerize </li><li> Örnekleri görselleştirmek için, blokları ultramicrotome kullanarak kesilmiş ve sonra kesitli vardır. Bölümler EM ızgaraları, standart prosedür kullanılarak boyandı aktarılır ve bir transmisyon elektron mikroskobu ile görüntülendi. Standart EM prosedür olarak protokol bu bölümü görünmeyecektir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları: Protokolü başarılı olmuşsa, daha sonra nükleer zarf (NE) ve NPC&#39;ler EM mikrograflar açıkça görünür olmalıdır. Substrat enjekte edilir ve enjeksiyon ve fiksasyon arasındaki zaman miktarına bağlı olarak, yüzey NPC, ya da nükleer yüzüne NPC NPC sitoplazmik yüzü görünür olmalıdır. Şekil 1 bir kesit bakülovirüs AcMNPV capsids enjekte edilmiş bir Xenopus oosit dört saat 4 ° C&#39;de inkübe komşu sitoplazma (c) ve nukleus (n), KD, ve gömme ve ince kesit için işlenmiş gösterir . EM olarak nitelendirdi. Arrowheads NPC&#39;ler noktası. Kapsid yerleştirme bir NPC sitoplazmik yüzü beyaz bir okla gösterilir. Buna karşılık, dört saat boyunca oda sıcaklığında inkübe Fare parvovirus Dakika Virüsü (MVM), enjekte edildiği bir Xenopus oosit (c) komşu sitoplazma ve çekirdek (n) ile kesit Şekil 2 KD gösterir ve EM açıklandığı gibi gömme ve ince kesit için işlenmiş. Bu tekniği kullanarak, MVM KD (Cohen ve Panté, 2005) bozulmasına neden olur ki bulduk. Parantezler NE tatili göstermektedir. Arrowheads NPC&#39;ler noktası. KD ile ilişkili olası MVM capsids beyaz oklarla gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Şekil 1" width="600" height="459" /> Şekil 1: Elektron mikrograf 4 inkübe bakülovirüs Ac MNPV capsids enjekte edilmiş bir Xenopus oosit (c) komşu sitoplazma ve çekirdek (n) ile KD kesit ° C, dört saat için işlenmiş gömme ve ince kesit EM olarak nitelendirdi. Arrowheads NPC&#39;ler noktası. Capsids beyaz oklarla gösterilir. Ölçek çubuğu: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Şekil 2" width="600" height="264" /> Şekil 2: Elektron mikrografı, dört saat boyunca oda sıcaklığında inkübe Fare parvovirus Dakika Virüsü (MVM), enjekte edildiği bir Xenopus oosit (c) komşu sitoplazma ve çekirdek (n) ile KD kesit ve EM açıklandığı gibi gömme ve ince kesit için işlenmiş. Arrowheads NPC&#39;ler noktası. Parantezler NE tatili göstermektedir. KD ile ilişkili olası MVM capsids beyaz oklarla gösterilir. Ölçek çubuğu: 100 nm.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

Mikroenjeksiyon ince kesit EM ile birlikte Xenopus oositleri Nükleositoplazmik taşıma çalışmak için son derece etkili bir araçtır . Bu sistem, sitoplazmik filamentler ve nükleer sepeti (Panté 2006) gibi NPC yapısal bileşenleri ile bir nükleer ithalat substrat örnek etkileşim için ithalat farklı adımlar, NPC ile eşleştirmek için kullanılır olmuştur. Aynı zamanda nükleer kopyalayan virüs nükleer ithalat (; Rabe ve ark, 2003; Cohen ve Panté, 2005 Panté ve Kann, 2002) çalışma için kullanılır olmuştur. ...

xenopus laevis oosit, mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Ince kesit, elektron mikroskobu (EM) tarafından takip Xenopus laevis oositlerin Mikroenjeksiyon Nükleositoplazmik taşıma eğitimi için mükemmel bir sistem. Çünkü, büyük bir çekirdek ve yüksek yoğunluklu nükleer gözenek kompleksler (NPC), nükleer taşıma Xenopus oosit kolayca görüntülenebilmekte . Nükleer ithalat ve ihracat mekanizmalarına daha fazla fikir, bu sistemin kullanımı (Panté 2006) ile elde edilmiştir. Buna ek olarak, çeşitli virüslerin konak çekirdeğinde çoğaltmak nükleer ithalat yolları incelemek Xenopus oositler mikroenjeksiyon kullandık. Burada bir nükleer ithalat substrat Xenopus oositlerin sitoplazmik mikroenjeksiyon göstermektedir. Ayrıca görünüm için enjekte oosit hazırlanması ince kesit diseksiyonu, dehidratasyon, ve oosit, epoksi gömme reçine içine yerleştirilmesi de dahil olmak üzere, EM. Son olarak, bakülovirüs Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) ya da Fare (MVM) parvovirus Dakika Virüs kapsid microinjected ve tekniğinin potansiyel uygulamaları tartışmak oosit temsilcisi sonuçlar sağlar .

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon göstermektedir<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Bir nükleer ithalat substrat yanı sıra görünüm için ince kesit elektron mikroskobu ile enjekte edilen oosit hazırlanması oosit.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Xenopus laevis oositlerine mikroenjeksiyon yapılması ve ardından ince kesitli elektron mikroskobisi (EM) uygulanması, nükleositoplazmik ... incelemek için mükemmel bir sistemdir.

Opus Lavu oositlerine mikroenjeksiyon yapılması ve ardından ince kesit elektron mikroskobisinin uygulanması, nükleo-sitoplazmik transportun incelenmesi için mükemmel bir sistemdir. Bu deneyde, oositler kollagenaz ile defoliye edilir ve altıncı evre oositler seçilerek çok kuyucuklu bir kaba yerleştirilir. Ardından, substratın çekirdeğe girmesine izin vermek için oositler oda sıcaklığında inkübe edilir ve oositlere bir nükleer import substratı mikroenjekte edilir.Sitler fikse edilir ve diseke edilir. Diseke edilen sitler düşük erime noktalı agar içine gömülür, osmiyum tetroksit ile tekrar fikse edilir,yıkanır ve bir epoksi reçineye gömülür. Epoksiye gömülen örnekler bir ultramikrotom ile kesitlenir ve kesitler bakır EM örnek ızgarasına yerleştirilir.Boyama işleminden sonra, kesitler bir transmisyon elektron mikroskobu altında görüntülenir. Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Zooloji Bölümü'ndeki Dr. Nellie Pane laboratuvarından Sarah Cohen. Ben de Pane laboratuvarından Shelly Ow.Bugün size Xenopus laevis hücrelerine mikroenjeksiyon prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, virüsler gibi kargoların nükleer importunu incelemek için kullanıyoruz. Haydi başlayalım.Deneye başlamak için, yaklaşık iki santimetrelik küçük bir Zenap Lavis over parçasını, 20 milliliters kollagenaz çözeltisi içeren 50 milliliter konik tüpe yerleştirin. Kollagenaz, oositleri çevreleyen folikül hücrelerini uzaklaştırır; ardından tüpü çalkalayıcı platforma yerleştirin ve 100 RPM hızında 30 dakika boyunca hafifçe sallayın. Bu süre, kollagenazın farklı lotlarına göre değişiklik gösterebilir.Bir saat sonra, sitlerden küçük bir örnek alın ve bunları bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Uygun şekilde defolye edilmiş sitler, birbirinden iyice ayrılmış olmalıdır. İğnenin kolayca kaydığını görmek için bir sitin içine cam bir iğne yerleştirin.Eğer sitler yeterince defoliye olmamışsa, kollajenaz çözeltisinde bırakın ve her beş dakikada bir tekrar kontrol edin. Sitler yeterince deregüle olduğunda, onları modifiye bar salini ile üç kez yıkayın ve MBS artı %1 Penicillin streptomycin içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, mikroenjeksiyon için olgun altıncı evre sitleri seçin.Bu oositler, siyah hayvansal hemisfer ile krem rengindeki bitkisel hemisfer arasında belirgin bir kontrast sunan büyük hücrelerdir. Olgun altıncı evredeki oositleri çok kuyucuklu bir kaba aktarın. Bunu gerçekleştirmek için, oositlerin bozulmadan vakumlanmasını sağlamak amacıyla ucu kesilmiş bir pipet ucu takılı 200 µL'lik bir pipet kullanın ve oositleri dikkatlice çok kuyucuklu kaba transfer edin.10 µL kuyucuk hacmine sahip mikro kuyucuksuz bir kap kullanıyoruz; EO bölgeleri artık mikroenjeksiyon için hazırdır. 10 µL substrata 1 µL %1 bromfenol mavisi ekleyerek mikroenjeksiyon yapılacak substratı hazırlayın. Bromfenol mavisi boyası, mikroenjeksiyonun görselleştirilmesini sağlar.Ardından, 100 milimetre çapındaki bir Petri kabına küçük bir parafilm şeridi yerleştirin ve parafilm şeridinin üzerine beş mikrolitre enjeksiyon çözeltisi damlatın. Sonra, 6,6 mikrolitrelik bir Drummond mikro pipeti ve inject plus Matt Puller kullanarak bir enjeksiyon iğnesi hazırlayın. İğne üzerine, 50 nanolitrelik bir hacme tekabül eden her 0,5 milimetrede bir nokta işaretleri koyarak enjeksiyon iğnesini kalibre edin. Mikro enjektörü aspirasyon moduna getirin ve iğneyi sitoplazmik enjeksiyon için enjeksiyon çözeltisi ile doldurun.İğne ucunu, vejetal hemisferde, hayvan hemisferine çok yakın bir noktaya yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. Ardından, mikro enjektör ayarını mikro enjeksiyon konumuna getirin ve her bir hücreye 50 nanolitre import substratı mikro enjekte edin. Enjeksiyonlar tamamlandığında, enjekte edilen substrat miktarını izlemek için iğne üzerindeki nokta işaretlerini takip edin.Hücreleri MBS ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında istenen süre boyunca inkübe edin. Nükleer por kompleksleri veya NPC'ler ile ilişkili import substratının gözlemlenmesine olanak tanıyan zaman noktalarını seçin.NPC'ye doğru aktif olarak taşınan proteinler ve virüsler için tipik olarak 10 ile 30 dakika arasındaki zaman noktalarını kullanırız. Bu zaman noktaları aynı zamanda enjeksiyon bölgesine ve protein ile virüsün boyutuna bağlıdır. İnkübasyon tamamlandığında, hücreleri MBS içinde %2 glutaraldehit içeren dört mililitrelik cam bir şişeye aktarın ve dört derece Celsius'ta gece boyunca sabitleyin; ertesi gün hücreleri MBS ile üç kez yıkayın, artık hücreleri diseke etmeye hazırız.Sitleri, düşük tuzlu tamponla doldurulmuş küçük bir Petri kabına aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu ve diseksiyon pensleri kullanarak, her oositten vejetal kutbu çıkarın. Bir çift pensle oositi sabitlemek ve diğer çifti vejetal kutbu çıkarmak için makas gibi kullanmak faydalıdır; bu diseksiyon adımı, elektron mikroskopisi için numuneler kırpılırken ve kesit alınırken çekirdeği bulmayı çok daha kolaylaştırır.Bu noktada, sitozoldeki mavi renklenmenin varlığı başarılı bir mikroenjeksiyonu gösterir; mikroenjeksiyonu başarıyla gerçekleştirilemeyen sitleri ayıklayın. Ardından, diseke edilen sitleri oda sıcaklığında bir saat boyunca LSB içindeki %2 glutaraldehit ile tekrar fikse edin; fiksasyon sonrası diseke edilen sitleri üç kez LSB ile yıkayın. Sitler yıkandıktan sonra, enjekte edilen oositleri gömme ve ince kesit alma (em) işlemleri için hazırlamaya hazırız.Diseke edilmiş oositleri bir çukur lam üzerine aktarın, sıvının mümkün olduğunca fazlasını aspire edin ve ardından kurumamaları için hızlıca hareket edin. Agaroz henüz yumuşakken, diseke edilmiş sitleri %2 düşük erime noktalı agaroz ile örtün. Sitleri birbirinden ayırmak ve her bir sitin yan değil, ya yukarı ya da aşağı bakmasını sağlamak için bir pipet ucu kullanın.Agarozun yaklaşık 10 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. Agaroz katılaştığında, her biri bir diseke hücre içeren küçük parçalar halinde kesmek için bir jilet kullanın. Ardından, agaroz içine gömülmüş hücreleri dört mililitrelik bir cam flakona yerleştirin ve bir döner karıştırıcı yardımıyla, oda sıcaklığında bir saat boyunca LSB içindeki %1 osmiyum tetroksit ile fikse edin.Bir saatlik fiksasyondan sonra, gerekirse örneği LSB ile üç kez yıkayın. Örneği dört derece Celsius'ta gece boyunca saklayın ve protokole ertesi gün devam edin. Örnekleri sırasıyla %50, %70 ve %90 etanolde 20'şer dakika boyuncayeleatasyon işlemine tabi tutun, ardından %100 etanolde iki kez 15'er dakika boyuncayeleratasyon işlemini gerçekleştirin.Son olarak, numuneleri 100% aseton ile 15 dakika boyuncaydehidre edin. Dehidrasyon adımları tamamlandıktan sonra, numuneleri bir saat boyunca eşit oranda epon, flua ve asetondan oluşan bir karışımla infiltre edin; ardından iki saat boyunca ikiye bir oranda epon ve aseton karışımıyla infiltre edin ve son olarak en az altı saat boyunca saf epon içerisinde bekletin. Son infiltrasyon adımı tamamlandığında, numuneleri taze, saf epon ile doldurulmuş düz gömme kalıplarına yerleştirin.Sitoleri, çekirdeğin enjeksiyon bölgesine daha yakın olan tarafı kesilecek şekilde yönlendirin. Bu durumda, sitolerin diseke edilmiş tarafı kesilecektir. Öncelikle bu adım, seçilen substratın içeri alınmasının görselleştirilme şansını optimize eder.Hücreler uygun şekilde yönlendirildikten sonra, eponu 60 °C'de iki gün boyunca polimerize edin. Polimerizasyon adımının ardından, ultra mikrotom kullanarak epoksiye gömülü örneklerden 50 nm kalınlığında kesitler alın. Kesitleri bir bakır EM örnek ızgarası üzerinde toplayın, örnekleri boyayın ve bir transmisyon elektron mikroskobu altında görüntüleyin.Protokol başarılı olduysa, elektron mikrograflarda nükleer zar ve NPC'ler net bir şekilde görülmelidir. Enjekte edilen substrata ve enjeksiyon ile fiksasyon arasındaki süreye bağlı olarak, substrat NPC'nin sitoplazmik yüzünde veya nükleer yüzünde görünmelidir. Bu temsili sonuç, vao virüsü kapsidleri enjekte edilmiş bir zenap hücresinden alınan, bitişik sitoplazma ve çekirdeği içeren bir nükleer zar kesitini göstermektedir.A-C-M-N-P-V ok uçları NPC'leri göstermektedir ve bir NPC'nin sitoplazmik yüzüne kenetlenen bir kapsid beyaz bir okla belirtilmiştir. Buna karşılık, bu şekil, fare parvo virüsü enjekte edilmiş bir zenap oositinden alınan, bitişik sitoplazma ve çekirdeğin bulunduğu bir çekirdek zarı kesitini göstermektedir. Bu tekniği kullanarak, MVM'nin çekirdek zarında bozulmalara yol açtığını bulduk.Köşeli ayraçlar nükleer zar डीएलyüklerini belirtmektedir. Ok başları NPC'leri göstermekte olup, nükleer zar ile ilişkili olduğu düşünülen MVM kapsidleri beyaz oklarla belirtilmiştir. Az önce size xap levu sitlerin nasıl mikroenjeksiyonla yükleneceğini ve diseke edileceğini gösterdik.Bu prosedürü uygularken, farklı kollajenaz lotlarının değişkenlik gösterdiğini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, defoliasyon için optimal süreyi belirlemek amacıyla kollajenazınızı dikkatlice test edin. Ayrıca, defoliasyon ve MBS yıkama adımından sonra, sitler mikroenjeksiyondan önce dört °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.Son olarak, bloklarınızı her zaman buz üzerinde saklayın ve asla kurumasını önlemeyin. Tüm dehidratasyon ve infiltrasyon basamakları boyunca tamamen daldırılmış olmalıdırlar. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis immatür oositlerini manipüle etme, oositlerin yumurtalara in vitro olgunlaşması ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, bazı maternal proteinlerin bozulmasına ve döllenmede ilgilenilen genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir ve bu nedenle erken embriyonik gelişimde spesifik faktörlerin rollerini incelemek için değerlidir.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Protein sentezi kontrolü esas olarak translasyon başlatma adımında gerçekleşir, eksiklikler çeşitli bozukluklarla bağlantılıdır. Etiyolojilerini daha iyi anlamak için, burada translasyon başlatma faktörü eIF4G1'in bir mutantının varlığında mos transkriptinin translasyonunu değerlendiren Xenopus laevis oositlerini kullanan bir protokol tanımladık.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

El yazması burada Xenopus floresan levhası 'ligandların salgılanmasını ve difüzyon analiz yöntemleri basit bir kümesi sağlar. Bu ligand dağılımını değiştirmek için başka proteinlerin yeteneğini test ve morfojen degradeler düzenleyen mekanizmalar içgörü verebilir deneyleri izin verdiği için bir ortam sağlar.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

Yetkin ektodermde bir yanıtı indükleyebilen genlerin ekspresyon klonlaması için bir Xenopus oosit ve hayvan başlığı sistemini tanımlıyoruz ve bu tür genlerin sonraki analizi için teknikleri tartışıyoruz. Bu sistem, çok çeşitli gen ürünlerinin fonksiyonel olarak tanımlanmasında faydalıdır.

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Burada, Xenopus laevis embriyolarının böbreğine yol açan bireysel blastomerlere enjeksiyonları hedeflemek için kader haritalarını ve soy izleyicilerini kullanmak için bir protokol sunuyoruz.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

Tek foliküllerin izolasyonu, sitoplazmik RNA mikroenjeksiyonları, çevre hücre tabakalarının çıkarılması ve Xenopus oositlerinde protein ekspresyonu için optimize edilmiş prosedürler anlatılmaktadır. Ek olarak, ligand kapılı iyon kanalları ile yapılan elektrofizyolojik deneylerde hızlı çözelti değişiklikleri için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

Burada, Xenopus oositlerinde boşluk bağlantı proteinlerini eksprese etmek ve yüksek yan akım ölçüm modunda çift oosit voltaj-kelepçe kayıtları için tasarlanmış ticari bir amplifikatör kullanarak iki appoze oosit arasındaki bağlantı akımını kaydetmek için bir protokol sunuyoruz.

Ksenopus Oositlerinden Boşluk Bağlantı Akımının Kaydedilmesi

Öğrenin, Xenopus laevis oositlerine mikroenjeksiyon yaparak nükleer ithalat substratlarının hücre içi taşımını inceleyin. Bu yöntem, ince kesit elektron mikroskobisi ile nükleoplazmik transport mekanizmalarını görselleştirmeyi sağlar.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Daha fazla video keşfet