Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Bu prosedür, morfo ve in vitro transkribe edilmiş kap mRNA'nın hazırlanmasıyla başlar. Bir mikro pipet, morfo içeren çözeltinin sifonlanmasıyla doldurulur ve enjeksiyon hacmi daha sonra bir mikrometre bir hücre aşaması kullanılarak kalibre edilir. Zebra balığı embriyoları daha sonra toplanır ve yumurta sarısı mikro enjeksiyonları için bir mikroenjeksiyon odasına yerleştirilir.

Çalışma solüsyonu hücrenin hemen altındaki yumurta sarısına enjekte edilir ve hücre mikro enjeksiyonları için solüsyonu taşımak için sitoplazmik hareketler kullanılır. Enjeksiyonları takiben çözeltiyi hücre sitoplazmasına enjekte edin. Embriyoları E üç besiyerinde 28.5 santigrat derecede inkübe edin ve sonraki aşamalarda ilgilenilen fenotipler için puan alın.

Merhaba, ben laboratuvardan, Dr.Sasha'nın oğlu ve Yale Üniversitesi Tıp Fakültesi Genetik Bölümü'nden Shiloh Yuen. Bugün, zebra balıklarında mRNA aşırı ekspresyonu ve morfo oligo nükleotid gen yıkımı çalışmalarını gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda S cilium'un kistik böbrek hastalıklarındaki rolünü incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Gen fonksiyon çalışmaları için güçlü bir yaklaşım, zebra balığı embriyolarında in vitro transkribe edilmiş kapaklı RNA'yı mikro enjekte etmektir. Bu gösteride, EGFP etiketli bir transkripti mikro enjekte edeceğiz ve başarılı bir enjeksiyon için canlı tüm embriyo GFP ekspresyonunu görünür bir okuma olarak kullanacağız.

İlk olarak, ilgilendiğiniz transkript üzerinde bir in vitro cap RNA transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştireceğiz. Laboratuvarımızda, rutin olarak ilgilenilen A-C-D-N-A'yı bir PC'nin iki artı vektörüne yerleştiriyoruz ve M mesajı M makinesi SP altı kitini kullanarak büyük miktarlarda kapaklı RNA'nın in vitro sentez reaksiyonunu gerçekleştiriyoruz. Daha sonra, RNA örneğini RN easy mini kitinden geçirerek veya fenol kloroform ekstraksiyonu ve izopropanol çökeltme yoluyla saflaştıracağız.

RNA preparatının konsantrasyonunu dikkatlice belirleyin ve enjeksiyon gününde kullanıma hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. RNA örneği girdabını hafifçe çözün ve kısa bir süre döndürün. Şimdi steril su ve %0.025 ila %0.05 fenol kırmızısı nihai konsantrasyon ile çalışan bir çözelti hazırlayın, fenol kırmızısı, çözeltinin embriyoya enjeksiyonu için görünür bir belirteç görevi görür.

Burada% 0.05 fenol kırmızısı ile mikrolitre EGFP mRNA başına 100 nanogramlık bir çalışma çözeltisi hazırlayacağız. Son olarak, çalışma örneğini buz üzerinde tutun ve RNA stoğunu eksi 80 santigrat dereceye getirin. Bu numuneyi enjekte etmeye hazır olduğunuzda morfonun hazırlanmasına devam edin.

Morino antisens oligonükleotidler, hedeflenen bir proteinin translasyonunu bloke ederek veya prem NA'yı modifiye ederek gen ekspresyonunu değiştirmek için yaygın olarak kullanılır. Zebra balığındaki ekleme morfoları, gen fonksiyonunu yıkarak güçlü bir ters genetik aracı olarak hizmet eder. Burada, pkd iki'nin translasyonel başlatma bölgesine hedeflenen bir morf oligoyu mikro enjekte edeceğiz. Rutin olarak, gene tools LLC'den elde edilen bir gen için özel olarak tasarlanmış 300 M'lik bir morf oligo kullanıyoruz.

Daha sonra üç milimolar stok çözeltisi yapmak için 100 mikrolitre steril su ekliyoruz ve ardından çözeltiyi alikot ediyoruz ve enjeksiyon gününde kullanıma hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklıyoruz. Morino çözeltisini 65 santigrat derecede beş dakika ısıtıyoruz. Daha sonra çözeltiyi hemen buz üzerinde soğutuyoruz ve kısaca döndürüyoruz, bu adım oligodaki ikincil yapıları denatüre eder ve çözeltinin tamamen çözünmesini sağlar.

Daha sonra, Morpho çözeltisini steril suda ve %0,025 ila %0,05 pinal kırmızı nihai konsantrasyonda seyrelterek çalışan bir çözelti hazırlayacağız. Bu gösteride,% 0.05 fenol kırmızısı ile 0.5 milimolar PKD iki morino çalışma çözeltisi hazırlayacağız. Çalışma solüsyonunu oda sıcaklığında tutun ve bu numuneyi enjekte etmeye hazır olduğunuzda mikro pipet doldurma işlemine devam edin.

Başlamak için, enjeksiyonlar için kullanılacak mikro pipetler üretmemiz gerekecek. Bu, BOS silikat cam kılcal boruların bir mikro pipet polar cihazda ısıtılması ve çekilmesiyle yapılır. İğneler çekildikten sonra, az miktarda kil veya yapışkan bant bandının üzerinde bir Petri kabında tutulurlar.

Daha sonra, kama şeklindeki oluklarla kalıplanmış bir XE üç orta boy plakaya% 1.5 aros dökerek mikroenjeksiyon hazne plakaları hazırlayacağız. Bu, enjeksiyon sırasında embriyoları tutmak için kolay bir yöntem olarak hizmet edecektir. Tarım odası plakalarının daha sonra katılaşmasına izin verilir ve kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklanır.

Mikro pipeti doldurmaya başlamak için. 50 x büyütmede diseksiyon mikroskobu altında görülebilen bir açıklık oluşturmak için distal ucu forseps veya cerrahi tıraş bıçağı ile kesin. Daha sonra çalışma solüsyonunuzdan iki mikrolitre yerleştirin.

Bir kapak fişi üzerine bir damla olarak, bir mikro pipetin arkasını, hipodermik bir iğne üzerinde boru ile donatılmış beş mililitrelik bir şırıngaya takın ve mikro pipetin distal ucunu hafifçe çalışma solüsyonunuza daldırın. Mikro pipetin ucunu kırmamaya özen gösteriniz. Şırınganın pistonunu çekerek çalışma solüsyonunu mikro pipetin distal ucundan sifonlayın.

Ardından, mikro pipet enjeksiyon hacmini kalibre edeceğiz. Bir mikrometre sürgüsüne bir damla mineral yağ koyun ve basınç darbeli mikro enjektör aparatına giden gücü ve hava beslemesini açın. Ardından, mikro pipeti mikro enjektör aparatının mikro pipet tutucusuna takın.

Mikro enjektör basınç ayarlıdır ve diseksiyon mikroskobu altında ayak pedalına basılarak deşarjlar aktive edilir. Çalışma solüsyonunuzdan bir damla mikrometre yağının üzerine koymak için mikro enjektörü kullanarak enjeksiyon hacmini test edin. Yağın üzerinde bir küre şeklinde yüzerken damlanın çapını ölçün.

Enjeksiyon hacminizi dikkatli bir şekilde kalibre etmek için enjeksiyonun süresini ve basıncını ayarlayın. Bu adım, mikro enjeksiyon deneyinin tekrarlanabilirliğine yardımcı olur. Bu gösteride, tüm mikro enjeksiyonlar 0.15 milimetrelik bir damla çapı ile yapılacaktır.

Son olarak, enjeksiyon hacminiz kalibre edildikten sonra, mikro pipetin geri dolmasını ve sızmasını önlemek için mikro enjektör üzerindeki tutma düğmesini kullanın. Şimdi zebra balığı embriyolarını hazırlama zamanı. Zebra balığı, hazırlığa başlamak için her sabahın ilk birkaç saatinde rastgele çiftleşecek, bir hücre aşamasında embriyoları toplayacak ve bunları bir XE üç ortamına yerleştirecektir.

Üç mililitrelik bir transfer pipeti kullanarak, embriyoları mikroenjeksiyon haznesi plakalarındaki kama şeklindeki oluklar boyunca düzenleyin. Embriyoların sığ olması, suya batırılması ve su basmaması için ortamı çıkarın. Bu adım, embriyoların olukların dibine yerleştirilmesine ve ayrıca mikro pipet tarafından korionun nüfuz etmesine yardımcı olur.

Şimdi enjeksiyonlara başlayacağız. İlk olarak, embriyoları mikro pipet ile manipüle edeceğiz, böylece tek hücre evresindeki embriyonun sitoplazması diseksiyon mikroskobu altında görülebilir. Embriyoya enjekte etmek için mikro pipetin ucunu kırmamaya özen gösterin, mikro pipet ile koryona ve ardından yumurta sarısına nüfuz edin.

Bu gösteride, ilk olarak hücrenin hemen altındaki yumurta sarısına mikro enjeksiyon yapacağız ve sitoplazmik ve difüzyonun çalışma solüsyonunu hücreye getirmesine izin vereceğiz. Bu akış, çalışma çözeltisine eklenen fenol kırmızısı nedeniyle görülebilir. Bu tek hücreli bir embriyo olduğundan, serbest elle veya bir manipülatör ile enjekte edilebilir.

Ayrıca hücre sitoplazmasına doğrudan enjeksiyonu da göstereceğiz. Hücre içine doğrudan mikroenjeksiyon daha sağlamdır, ancak uygun embriyo oryantasyonu ve mikroenjeksiyon tekniği gerektiğinden zaman alıcıdır. Hücre zarı, yumurta sarısı zarından daha titiz olduğundan, hücreye ulaşmak için yumurta sarısından mikro pipete girmek genellikle daha hızlıdır.

Hayvan direğini oluğun dibine doğru yönlendiren ve sabit ellerle çalışan sitoplazma bu enjeksiyon yöntemine yardımcı olabilir. Mikroenjeksiyondan sonra, embriyoları E üç besiyeri olan bir Petri kabına yerleştirin ve normal gelişim için 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Embriyo gelişiminin önümüzdeki birkaç saati ve günü boyunca, ilgilendiğiniz fenotipler için embriyoları gözlemleyin.

Mikroenjeksiyonun başarısını doğrulamak için, kalkan aşamasından başlayarak gelişmekte olan embriyolarda GFP ekspresyonunu izleyeceğiz in vivo tam embriyo floresan mikroskobu yapının ekspresyonu, embriyonik gelişimin erken olayları sırasında en güçlü olanıdır ve genellikle gelişim sırasında azalacaktır. Enjekte edilen kapaklı RNA yavaş yavaş bozulur ve eksprese edilen proteinin stabilitesine bağlıdır. Daha önce yayınlanmış sonuçlara dayanarak, PKD iki morfinin, PKD iki mutant zebra balığında bulunan dorsal vücut ekseni eğriliğini taklit etmesini ve döllenmeden yaklaşık iki ila üç gün sonra böbrek kistlerini sunmasını bekliyoruz.

Bu prosedürü yaparken zebra balıklarında mRNA aşırı ekspresyonu ve morfo oligonükleotid gen yıkım çalışmaları yapmak için size sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği gösterdik, bunun önemli olduğunu unutmayın. Sabit bir el ile enjekte edin. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.