Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

Erkek ve dişi zebra balıkları, döllenmiş yumurtaların kolayca toplanabilmesi için tabana düştükleri bir üretim kafesinde çiftleştirilir. Ardından yumurtalar, bir Petri kabı içerisinde mikroskop lamına hizalanır. Daha sonra, dolu olan enjeksiyon iğnesi kesilir ve enjeksiyon ayarları, mikrometre ile ölçüldüğünde enjeksiyon bolusu istenen boyutta olacak şekilde düzenlenir.

Son olarak, yumurtalar sırayla tek tek enjekte edilir. Merhaba, ben Boston Çocuk Hastanesi Kardiyoloji Bölümü'ndeki John MA Laboratuvarı'ndan Jonathan Rosen. Ben de VY laboratuvarından Michael Sweeney.

Bugün, mRNA veya morfolinonun zebrafish embriyolarına nasıl enjekte edileceğini göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, belirli gen ürünlerinin nakavt (knockdown) veya aşırı ekspresyonunun etkilerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Başlangıç olarak, toplam yumurta üretimini artırmak için enjeksiyondan önceki gece balıkları ve çiftleşme tanklarını bölmeler yerleştirilmiş şekilde hazırlamamız gerekecektir. İstenirse balıklar, iki dişi bir erkek oranında yerleştirilebilir. Ertesi sabah oda ışıkları açıldıktan sonra, birkaç tanktaki bölmeleri çıkarın ve yaklaşık 20 dakika boyunca rahatsız edilmeden çiftleşmelerine izin verin. Bir süzgeç kullanarak yumurtaları çiftleşme kafeslerinden toplayın ve bir Petri kabına dökmeden önce yumurta suyu ile durulayın.

Yumurta suyu ile balıklar, enjeksiyon için ek yumurta serileri üretmek amacıyla daha büyük tanklarda yeniden gruplandırılabilir. Yumurta toplama zamanlamasını, yumurtaların tek hücreli evreyi geçmesine izin vermeden maksimum sayıda üretilecek şekilde ayarlayın. Son olarak, bir mikroskop lamını 100 milimetrelik bir Petri kabının ters çevrilmiş kapağına yerleştirin.

Yumurtaları bir transfer pipeti kullanarak lamın kenarına tek bir sütun oluşturacak şekilde hizalayın ve ardından yumurtaların karşı tarafındaki kenara bir Kim wipe bastırarak lamdaki fazla yumurta suyunu alın. Ardından, bir mikropipet çekicisi (micro pipette puller) kullanarak mikroenjeksiyon iğnelerini hazırlayacağız. Bir milimetre dış çapa sahip cam bir kapileri iki iğne olacak şekilde çekeceğiz ve bu iğneleri 150 milimetrelik bir Petri kabında saklayacağız. İğneler, silikon hamur (silly putty) rampaların üzerine yerleştirilerek önceden çekilebilir.

Şu ayarları kullanıyoruz. Isı 6, kutup 60, hız 80. Bir mikro yükleyici pipet kullanarak, iğnenin geniş ucuna üç µL enjeksiyon materyali yükleyin.

Birkaç kabarcık kalana veya hiç kabarcık kalmayana kadar bolusu iğne ucuna doğru sallayın. Ardından, hava kaynağını ve mikro enjektörü açacağız. İğneyi mikro enjektöre yerleştirin ve yuva içerisinde sızdırmaz bir şekilde oturduğundan emin olun.

Mikromanipülatörün, geniş bir hareket ve ayar aralığına izin verecek uygun bir konumda olduğunu kontrol edin. İğne ucunu mikroskobun görüş alanına getirin. Sahnenin yukarısına kaldırın ve ucun en ince bölgesine odaklayın.

İğnenin, korion ve vitellusu delecek kadar dar kalmasını ancak yine de tutarlı bir damlacık boyutu iletebilmesini sağlayacak bir noktadan, bir çift keskin pens yardımıyla koparın. Her enjeksiyonun hacmini hesaplamak için, bir mikrometre üzerine bir damla mineral yağ yerleştirin, iğneyi yağın içine sokun ve yağın içine bir damlacık çözelti enjekte etmek için ayak pedalına basın. İğneyi kırparken ve gerektiğinde enjeksiyon basıncını ayarlarken, yağ içine enjekte edilen damlacığın boyutunu izleyin.

0,1 milimetre çapındaki bir boncuk, 500 pikolitre enjeksiyon materyali içerir. Genellikle 500 pikolitre veya bir nanolitrelik enjeksiyon hacimleri kullanılır. İdeal enjeksiyon hacimleri, yumurta hacminin yaklaşık %10'unu dolduracaktır.

İğne ucunun kalitesi, hem enjeksiyon kolaylığı hem de sonuçların kalitesi ve tutarlılığı açısından kritik öneme sahiptir. Şimdi enjeksiyon prosedürünü başlatmak için enjeksiyon yapma zamanı geldi. Embriyoların dört hücre aşamasını geçmediğinden emin olun.

İdeal olarak, embriyo tek hücreli evrede olmalıdır. Ardından, iğneyi yumurta sütununa doğru indirin, korion yüzeyini delin ve izlerken tek bir pürüzsüz hareketle sarıya girin. Vitellüs kesesinde herhangi bir ezilme veya yırtılma olması durumunda, enjeksiyon materyalini sarıya enjekte edin.

Hava kabarcığı enjekte etmekten kaçının ve işlem sırasında görünür şekilde zarar gören embriyolara dikkat edin. Tutarlı bir damlacık boyutunu korumak için gerekirse basıncı ayarlayın ve bir pipet ucu kullanarak döllenmemiş görünen veya enjeksiyon işlemi sırasında tahrip olan yumurtaları uzaklaştırın. Bir yumurta sütununu tamamladıktan sonra, enjekte edilen yumurtaları temiz bir Petri kabına taşımak için yumurta suyundan oluşan hafif bir akış kullanın ve gerektiği kadar tekrarlayın.

Kontrol grubu olarak birkaç tane enjeksiyon yapılmamış embriyoyu saklayın. İlk günün ilerleyen saatlerinde ölü embriyoları uzaklaştırın ve enjekte edilen embriyoların sayısını kaydedin. Enfeksiyon riskini azaltmak için kapta bulunan yumurta suyunu periyodik olarak değiştirin.

Enjekte edilen maddeye bağlı olarak, embriyoların hayatta kalma oranının enjekte edilmemiş kardeşlerine göre daha düşük olabileceğini unutmayın. Neyse ki, çok sayıda embriyoyu enjekte etmek kolaydır, bu nedenle bu durum nadiren sorun teşkil eder. Şimdi, hem morfo enjeksiyonunun hem de mRNA'nın bazı temsili sonuçlarını göstereceğiz.

Döllenmeden 48 saat sonraki enjekte edilmemiş kontrol grubu, beklendiği gibi normal görünmektedir. Ancak, iki EEG benzeri tekrarın ilkini içeren HG izoformlarını baskılayan morpho HG E three i three eeg FFR one enjekte edilen embriyolarda beyin ödemi görülmektedir; heart glass mRNA enjeksiyonu da döllenmeden 24 saat sonra belirgin bir fenotip oluşturmuştur.

Enjeksiyon yapılmamış kontrol gruplarının başları normal görünüyordu. Buna karşılık, M NNA enjekte edilen embriyoların bazılarında opia görüldü. Tek hücreli evre sırasında morfolin veya mRNA enjeksiyonunun, sonraki gelişim aşamalarında belirli genlerin ekspresyonunu nasıl artırabileceğini veya azaltabileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, bunun da hatırlanması önemlidir.

mRNA'nın veya morpho'nun yüksek konsantrasyonu, morpho içeren embriyolarda spesifik olmayan letaliteye neden olabilir. Her birinin ampirik olarak test edilmesi gerekir, ancak tipik olarak 200 ile 500 micromolar arasındaki konsantrasyonlar, genel letaliteye yol açmadan gen aktivitesini spesifik olarak düşürür. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.