Name: İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Keşfedin insan pankreas adacık izolasyonu için otomatik sindirim ve doku koleksiyonu yöntemini. Bu prosedür, yüksek kaliteli adacıkların transplantasyon için elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

University of Illinois at Chicago gibi Adacık Hücre Kaynak Merkezi NIH hibe (RFA-RR 05-003), Christopher Vakfı, Efroymson Vakfı ve Tellabs Vakfı fon tarafından desteklenir.

1. Tesis kurulum <ol><li> İnsan adacık izolasyonu, takım çalışması gerektirir bir zaman hassas bir işlemdir ve bu nedenle, dört kişi bu işlemi yapmak için ihtiyaç vardır. Takım masaya ve pankreas cannulates cerrah tarafından yönetilmektedir. </li><li> Adacık izolasyon ekibi UIC adacık izolasyonu tesisi girer dakika başlar. Ekip üyeleri, santrifüj gibi, gerekli tüm enstrümantasyon, kontrol edilir ve açık olduğunu emin olun. Ayrıca, tüm davlumbaz ve yüzeyleri sterilize etmek için emin olun. </li><li> İki kişi kanülasyon tablo, sulu kar makinesi, sindirim devre, perfüzyon ünitesi, COBE arıtma makine ve cerrahi masaları kuracak. </li><li> Aynı zamanda, diğer iki ekip üyeleri, izolasyon sırasında gerekli ortam hazırlayacaktır. </li><li> Sonra, bakteriyoloji tüpleri (şişe, tüp, form ve çanta), numune alma tüpleri (ön yıkama ile dolu) ve değerlendirme tüpleri ve plakaları hazırlanır. </li><li> Aşağıdaki gibi ayarlayın arıtma tüpü hazırlayın: 1. tüp boş ve 150 ml işaretli, tüpler 2-12, 200 ml insan albumini (yıkama solüsyonu) ile desteklenmiş M199 medya ile doldurulmuş ve 230 ml &#39;işaretli, ve nihayet 50 ml konik tüp 50 ml yıkama solüsyonu ile doldurulur. Bu hazırlık adımları biz hazırlanması ve pankreas perfüze başlamaya hazır tam. </li></ol> 2. Pankreas hazırlanması ve perfüzyon <ol><li> Hazırlanması ve pankreasın perfüzyon başlamak için, bir operatör, steril tekniği kullanarak ambalaj organ kaldırır. Cerrah dekontaminasyon tablo pankreas transfer olacak. </li><li> Cerrah orijinal pankreas koruma çözümü ve hazırlanan &quot;İhale&quot; bakteriyoloji şişeleri doldurmak için kullanan bir operatörü, el ile bir adet 60 ml şırınga dolduracaktır. </li><li> Organ adacık izolasyonu (pankreas, satın alma sırasında hasar veya anatomik olarak anormal ise, adacık izolasyonu için kullanılan) için uygun olup olmadığını belirlemek için bir görsel denetim sonra, cerrah kollajenaz hazırlamak için bir operatör soracaktır. Yeniden askıya alınması zaman farklı enzim marka ve birçok arasında değişmektedir unutmayın. </li><li> Cerrah hazır olduğunda, dekontaminasyon tablo (Betadine, Fungizone / Sefazolin ve HBSS) dekontaminasyon çözümler getirmek ve onlara uygun kaplar içine dökün. Cerrah, bir dakika için her dekontaminasyon çözüm pankreas pankreas yıkama dekontaminasyon gerçekleştirir. Pankreas sonra tartılır olacağı küçük steril bir kavanoza konur. Ağırlığı toplu kayıt içine girildikten sonra, pankreas, bazı koruma çözümü ile kanülasyon tavaya konur. </li><li> Cerrah ortaya çıkarmak ve kısmen ana kanalı insizyon ve bir kanül ile pankreas her bir yarısı cannulate. Kanül dikiş tarafından temin edilecektir. Pankreas serpmek için, ilk perfüzyon ünitesi taşımak ve enzim çözeltisi havza içine dökün. Toplam perfüzyon süresi 5 dakika için 180 mmHg, sonra 5 dakika süreyle 80 mmHg, yaklaşık 10 dakika. Pankreas perfüzyon sonra şişmiş. </li><li> Kanülasyon tavaya yağ dokusu, pankreas dikkatli bir şekilde kesilmiş perfüze pankreas, taşıyın. Sonra 10-12 parçalar halinde kesilmiş ve pankreas sindirim için Ricordi Odası transfer. </li></ol> 3. Pankreas sindirim <ol><li> Sindirim adım başlamak için, boş Ricordi Odası pankreas aktarmak, ekranda koymak Pulmozyme 2.5 ml şişe, (odası doku blok büyük bir yığın önlemek) eklemek, oda kapatın ve sistemi doldurun. </li><li> 5 dakika boyunca çözüm pompalama başlayın. Odanın sıcak bir çözüm boyunca eşit dağıtmak için hafifçe sallayın. Beş dakika sonra, tüm sindirim aşaması için odasına yavaşça sallayın. 37 ° ˚ C sıcaklık koruyun </li><li> Rock odasının sıcaklığı 37 °, sonra odasına sallamak ulaşıncaya kadar yavaşça. Bir numune alın ve her iki dakikada bir ücretsiz adacıklar kapsamında olup olmadığını algılayabilir. Toplu kayıt sindirim tabloda adacık değerlendirme bilgileri kaydedin. Adacık yüzdesi% 50 çözüm ücretsiz ve izole edilmiş yüzen kadar izlemeye devam edin. </li></ol> 4. Doku toplama <ol><li> Adacıklar% 50 örneklerinde bulunur, sindirim devresinde soğuk RPMI seyreltme çözüm ekleyerek durdurulur. Doku, 500 ml konik tüpler 30 ml İnsan Albumin ile önceden doldurulmuş toplanan. Tüpler emme süpernatantı kapalı döndü ve pelet soğuk yıkama solüsyonu ile yıkayın. 1 dakika, 4 ˚ C 1100 RPM (dakikadaki dönüş) konik tüpler Spin </li><li> Tek bir 500 ml konik içine sindirilmiş pankreas dokusu ile askıya alma tüpleri birleştirin. Bir tüp, yıkanmış doku dolu olduğunda, spin ve tüm doku birden çok kez yıkanmış kadar yıkama işlemi tekrarlayın. Bu tüp spin ve tek bir 250 ml konik tüp içine doku transferi. 250 ml ile ses getirM199 yıkama solüsyonu HA ile desteklenmiş ve örnekleme için hazırlamak. </li><li> Bir pipet yardımıyla 1 ml örnek alın ve önceden 9 ml yıkama solüsyonu ile dolu bir 15 ml konik tüp ekleyin. Daha sonra bir ızgara sayma çanak içine doğrudan 1ml dışarı yavaşça tersine 15 ml konik tüp ve bu örnek karıştırın. Hücre sayımı ve seyreltme faktörü 2500 (10x250) kullanarak hücre sayısını hesaplamak. </li><li> 250 ml konik tüp Spin ve UW (Wisconsin Üniversitesi) genellikle organ korunması için kullanmak Çözüm 150 ml. UW eklendiğinde, pipet kullanarak hücre süspansiyonu iyice karıştırın. UW başlangıç ​​zamanını kaydedin ve arıtma operatörü iletişim. Buz ve bazen girdap tüp (ler) bırakın. Şimdi adacıklar arındırılmalıdır. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

Izolasyon sonucu 9,10 etkileyen çeşitli faktörler vardır. Bunların arasında, pankreas dokusu sindirim önemli bir rol oynar. Kendi insan adacık izolasyon deneyimine dayanarak, potansiyel adacık verim ve kaliteyi etkileyebilecek kritik noktaları, aşağıda özetlenmiştir. <ol><li> Enzimlerin farklı türleri kullanılmaktadır sindirim süresi farklı. </li><li> En kısa sürede% 40-50 olarak asiner doku tamamen ayrılmış adacıklar, sindirim seyreltme çözüm ekleyerek ve doku soğuma derhal durdurulması olmalıdır. </li><li> Doku Na...

<table><tbody><tr><td>Buz Karı Makinesi</td><td>ekipman</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>steril buz hazırlamak</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>ekipman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 Evirt Inverted Mikroskopi TLBD4.1</td><td>ekipman</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Izgaralı Hücre Kültür Kabı</td><td>ekipman</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>adacık sayımı</td></tr><tr><td>Dijital Benmari EX7</td><td>ekipman</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>Termometre</td><td>ekipman</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>MonoBloc Terazi AB 104-S</td><td>ekipman</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>pankreas ağırlığını ölçmek</td></tr><tr><td>MasterFlex II Hız Kontrol Cihazı</td><td>ekipman</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>digesyon sırasında akış hızını ayarlamak</td></tr><tr><td>Dijital Sight DS L1</td><td>ekipman</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon Ünitesi</td><td>ekipman</td><td>Özel Yapım</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon ünitesi için soğutucu</td><td>ekipman</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>Ricordi Odacığı</td><td>ekipman</td><td>University of Miami</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>RPMI dilüsyon solüsyonu</td><td>reaktif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>Wisconsin Üniversitesi (UW) solüsyonu</td><td>reaktif</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS)</td><td>reaktif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>%25 İnsan Albumini</td><td>reaktif</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>M199 medyumu (yıkama solüsyonu)</td><td>reaktif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaz NB1 GMP kalite</td><td>reaktif</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>Nötr Proteaz NB1 GMP kalite</td><td>reaktif</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>reaktif</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>Sefazolin</td><td>reaktif</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Ditizon</td><td>reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan pankreas adacık İzolasyonu: bölüm i: sindirim ve pankreas doku koleksiyon

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Tip 1 diyabet Yönetimi, yıl içinde 100 milyar dolar maliyet, hem birey ve toplum, külfetli. Glikoz izleme ve yeni insülin formülasyonları yaygın kullanımına rağmen birçok kişi hala yıkıcı ikincil komplikasyonlar gelişir. Pankreas adacık nakli, diyabetik hastalarda normal glukoz kontrolü yakın geri yükleyebilirsiniz<sup&gt; 1</sup&gt;, Yoğun insülin tedavisi ile ilişkili ciddi hipoglisemik atakların riski olmadan. Başarılı adacık nakli için yeterli adacık kitle sağlanması önemlidir. Ancak, donör özelliği, organ alımı ve korunması, izolasyon sonucunu etkileyebilecek<sup&gt; 2</sup&gt;. University of Illinois at Chicago (UIC) geliştirilmiş bir arıtma degrade başarılı bir izolasyon protokolü geliştirildi<sup&gt; 3</sup&gt;. Bu program, 2004 yılı Ocak ayında başlayan ve 300&#39;den fazla izolasyonların Kasım 2008&#39;de yapıldı. Pancreata (UW, Wisconsin veya HTK Üniversitesi, Histidin-Triptofan Ketoglutarate), soğuk muhafaza çözümleri gönderildi<sup&gt; 4-7</sup&gt; Hücre İzolasyonu Laboratuvar adacık izolasyonu için UIC. Pankreas adacık Ricordi tarafından tanımlanan yöntem değiştirilmiş bir versiyonu olan UIC yöntemi ile izole edildi<em&gt; Ve ark.</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Kısaca, çevre doku pankreas temizlendikten sonra, enzim solüsyonu (Serva kollajenaz + Nötr Proteaz veya Sigma V enzim) ile perfüze edildi. Şişmiş pankreas Ricordi sindirim odasına transfer değiştirilmiş bir kapalı dolaşım tüp sistemine bağlı ve 37 ° C&#39;ye kadar ısındı. Sindirim sırasında, oda hafifçe sarsıldı. Örnekleri sindirim ilerlemeyi izlemek için sürekli olarak alınmıştır. Mikroskop altında ücretsiz adacıklar saptandı sonra, sindirim soğuk kızarma tarafından durduruldu (4 ° C) enzim sulandırmak için dolaşım sistemi içine RPMI seyreltme çözeltisi (Mediatech, Herndon, VA). Doku, insan albumini ile desteklenmiş M199 medya toplanır ve yıkandıktan sonra, ön arıtma sayımı için örnek ve arıtma önce UW solüsyonu ile inkübe edildi. İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür: Arınma süreci Bölüm II açıklanacaktır.

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu için prosedürler: değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanılarak (bölüm I sindirim ve pankreas dokusu toplanması).

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

Tip 1 diyabetin yönetimi, yıllık 100 milyar doların üzerinde maliyetiyle hem bireyler hem de toplum için külfetlidir. ... yaygın kullanımına rağmen

Bu prosedür, normal donör pankreas dokusunun temini ile başlar. Kısa bir düzeltme adımının ardından, genişlemiş pankreas eşit parçalara bölünür ve sindirim haznesine aktarılır. Pankreas kanüle edilir ve otomatik bir perfüzyon makinesi aracılığıyla kanül üzerinden kollajenaz çözeltisi infüze edilir.Son olarak, pankreas dokusu geniş hacimli konik tüplere toplanır ve nihayetinde, sonraki bir videoda gösterilecek olan adacık transplantasyonu için daha fazla saflaştırılır. Merhaba, ben Illinois Üniversitesi Chicago'daki Cerrahi Bölümü'ndeki İnsan Adacık Programı Laboratuvarı'ndan American Chief. Merhaba, benim adım Barbara Barbero ve ben de İnsan Adacık Programı'ndayım.Bugün size insan pankreas adacıkları izolasyonu prosedürünü göstereceğiz. Klinik kullanım için yüksek kalitede insan adacıkları elde etmek amacıyla tesisimizde bu prosedürü kullanıyoruz. Haydi başlayalım.İnsan adacık izolasyonu, ekip çalışması gerektiren ve zamana duyarlı bir işlemdir; bu nedenle prosedürün gerçekleştirilmesi için dört kişi gereklidir. Ekibe, pankreası diseke eden ve kanüle eden cerrah liderlik eder. Adacık izolasyonu, ekibin UIC göz kapağı izolasyon tesisine girdiği andan itibaren başlar.Ekip üyeleri, santrifüj gibi tüm gerekli cihazların kontrol edildiğinden ve açıldığından emin olurlar. Ayrıca tüm çeker ocakların ve yüzeylerin sterilizasyonunu sağlarlar. İki kişi; kanülasyon masasını, slush makinesi sindirim düzeneğini, devre perfüzyonunu, ünite cope saflaştırma makinesini ve cerrahi masaları kurarlar.Aynı anda, diğer iki ekip üyesi izolasyon sırasında gerekli olan besiyerlerini hazırlayacaktır. Ardından, bakteriyoloji tüpleri, örnekleme tüpleri, değerlendirme tüpleri ve plakları hazırlanır. Saflaştırma tüp setini şu şekilde hazırlayın: ilk tüp boş olmalı ve 150 milliliters seviyesinde işaretlenmelidir.2 ile 12 arasındaki tüpler 200 milliliters M1 99 besiyeri ile doldurulur. Besiyeri human albumin veya yıkama solüsyonu ile takviye edilir ve 230 milliliters seviyesinde işaretlenir. Son olarak, bir adet 50 milliliter konik tüp 50 milliliters yıkama solüsyonu ile doldurulur.Bu hazırlık adımları tamamlandığında, pankreasın hazırlanmasına ve perfüzyonuna başlamaya hazırız. Pankreasın hazırlama ve perfüzyon işlemine başlamak için, operatör organı paketinden çıkarır. Cerrah, steril teknik kullanarak pankreası dekontaminasyon masasına aktaracaktır.Cerrah, bir adet 60 cc şırıngayı orijinal pankreas koruma solüsyonu ile dolduracak ve bunu, önceden hazırlanmış temin bakteriyoloji şişelerini doldurmak için kullanacak olan bir operatöre teslim edecektir. Organın adalecik izolasyonu için uygun olup olmadığını belirlemek amacıyla yapılacak görsel incelemenin ardından cerrah, bir operatörden kolajenaz hazırlamasını isteyecektir. Hazırlama işlemi bir choate'dir.Alım sırasında pankreas hasar görmüşse veya anatomik olarak anormalse, adalık hücre izolasyonu için kullanılamaz. Resus süspansiyon süresinin farklı enzim markaları ve lotları arasında değişiklik gösterdiğini unutmayın. Cerrah hazır olduğunda, dekontaminasyon solüsyonlarını dekontaminasyon masasına getirin ve uygun kaplara boşaltın.Cerrah, pankreası bir dakika boyunca yıkayarak dekontamine edecektir. Ardından pankreas, her bir dekontaminasyon çözeltisi için, tartılacağı küçük steril bir kavanoza yerleştirilir. Ağırlık parti kaydına girildikten sonra, pankreas kanülasyon tepsisine yerleştirilir.Bazı koruma çözeltileri kullanılarak cerrah, ana kanalı açığa çıkarıp kısmen insize edecek ve pankreasın her iki yarısını, pankreasa perfüzyon yapmak için sütürle sabitlenmiş kanüllerle kanüle edecektir. İlk olarak, örneği perfüzyon ünitesine taşıyın ve enzim çözeltisini havuzun içine dökün. Toplam perfüzyon süresi, beş dakika boyunca 80 mmHg basınçta olmak üzere yaklaşık 10 dakikadır.Ardından, beş dakika boyunca 180 milimetre cıva basınçta, pankreas genişlemiş görünecektir. Perfüzyondan sonra, perfüze edilen pankreası, yağlı dokunun pankreastan dikkatlice temizlendiği kanülasyon kabına taşıyın. Sonra pankreası 10 ila 12 parçaya bölün ve sindirim için kayıt odasına aktarın.Sindirimi başlatmak için pankreası boş kayıt haznesine aktarın. Hazneyi tıkamaya dikkat ederek ekranda gösterilen 1,25 mL'lik bir pulmozyme flakonu ekleyin, hazneyi kapatın ve sistemi doldurun. Çözeltiyi beş dakika boyunca pompalayın.Sıcak çözeltinin her yere eşit şekilde yayılması için hazneyi nazikçe sallayın. Beş dakika sonra, tüm sindirim aşaması boyunca hazneyi nazikçe çalkalayın. Sıcaklığı 37 °C'de tutun.Her iki dakikada bir örnek alın ve mikroskop altında serbest gözeler (eyelets) olup olmadığını tespit edin; göze değerlendirme bilgilerini parti kaydının sindirim tablosuna kaydedin. Gözelerin %50'si çözeltide serbest ve izole olarak yüzene kadar izlemeye devam edin. Örneklerde gözelerin %50'sinin serbest olduğu tespit edildiğinde, soğuk RPMI dilüsyon çözeltisi ekleyerek sindirim işlemi durdurulur.Devre dokusu, önceden 30 mililitre insan albümini ile doldurulmuş 500 mililitrelik konik tüplere toplanır. Konik tüpler, 4 °C'de bir dakika boyunca 1100 RPM'de santrifüj edilir.Tüpler santrifüj edildikten sonra, süpernatantı vakumla çekin ve pelletini yıkayın. Soğuk yıkama solüsyonu ile, sindirilmiş pankreas dokusu içeren tüm toplama tüplerini tek bir 500 mililitrelik konik tüpte birleştirin. Bir tüp yıkanmış doku ile dolduğunda santrifüj edin ve tüm doku birden fazla kez yıkanana kadar yıkama işlemini tekrarlayın.Bu tüpü santrifüjleyin ve dokuyu tek bir 250 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hacmi, insan albümini eklenmiş M1 99 yıkama solüsyonu ile 250 mililitreye tamamlayın ve örnekleme için hazırlayın. Bir pipetle bir mililitrelik örnek alın ve bunu dokuz mililitre yıkama solüsyonu ile önceden doldurulmuş 15 mililitrelik bir konik tüpe ekleyin.Ardından, 15 mililitrelik konik tüp nazikçe altüst edilerek karıştırıldı. Bu örnekten bir mililitre doğrudan bir sayım lamı üzerine alındı. Hücreler sayıldı ve hücre sayısı hesaplandı.2.500'lik bir dilüsyon faktörü kullanarak, 250 mililitrelik konik tüpü döndürün ve 150 mililitre uw. University of Wisconsin Çözeltisi ekleyin. UW eklendiğinde, pipetle karıştırarak hücre süspansiyonunu iyice homojen hale getirin; işlemi kaydedin ve saflaştırma operatörüne bildirin.uw'deki başlangıç zamanı. Tüpleri buz üzerinde bekletin ve ara ara hafifçe çalkalayın. Şimdi, adacıklar bu adımda daha fazla saflaştırılabilir; sayım yapmak için saflaştırılmamış pankreas dokusundan bir örnek alınır.Numuneye dione çözeltisi eklendiğinde, yalnızca adaçık popülasyonu kırmızıya boyanacaktır. Ardından bunların kalitesi ve miktarı değerlendirilebilir. Başarılı adaçık transplantasyonu için önemli olan, yüksek sayıda kaliteli insan pankreas adaçığının izole edilmesine yönelik bir prosedürü göstermiş olduk.Deneyimlerimize dayanarak, insan adacıklarının %40 ila %50'si çevreleyen iç dokudan ayrır ayrılmaz, sindirim karışımını seyrelterek ve soğutarak sindirim işlemini mümkün olan en kısa sürede durdurmamız gerekir. Toplama, yıkama ve karıştırma sırasında dokuya nazik davranmak da önemlidir. Yüksek saflıkta insan adacıklarının üstün düzeyde geri kazanımıyla sonuçlanan, University of Chicago'nun oldukça başarılı saflaştırma yöntemini kullanmanızı öneririz.Bu yöntem ayrıca izolasyon süresini önemli ölçüde kısaltarak eyelet'e bağlı iskemi kaynaklı hasarı minimize edecektir. İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

human-pancreatic-islet-isolation-part-i-digestion-collection

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu (Bölüm II: insan adacıklar arıtma ve kültür) için prosedürleri değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanarak.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Araştırma için tip 2 diyabetik adacık kaynağı yetersiz. Burada kısmi pankreatektomi geçiren hastalardan izole adacıklar için protokol paylaşın. Bu yaklaşım, tip 2 diyabetik adacıklar elde etmek için eşsiz bir mekan temsil eder ve temel ve klinik çalışmalar için yeterli sayıda non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu.

Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu

Langerhans Adacıkları olarak da adlandırılan pankreas adacıkları, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik işlevler için hormonlar üreten bir endokrin hücre kümesidir. Bu protokol, ekzokrin pankreas dokusunu sindirmek için önce Ampulla of Vater yoluyla kollajenaz perfüze ederek pankreas adacıklarını izole etmek için bir yöntemi ve adacıkları farelerden saflaştırmak için basitleştirilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüjünü açıklar.

Kollajenaz Perfüzyonu ile Pankreas Adacıkları İzolasyonu: Pankreas Adacığı Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzimatik Bir Yöntem

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Burada, bir damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisini kullanarak izole insan pankreatik izletden tek hücrelerin yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Pankreas metaplastik hücreleri, pankreas tümörlerine yol açan kötü huylu hücrelerin öncüleridir. Bununla birlikte, sağlam canlı pankreas hücrelerini izole etmek zordur. Burada pankreas dokusu ayrışması için etkili bir yöntem sunuyoruz. Hücreler daha sonra tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi) veya iki veya üç boyutlu birlikte kültürleme için kullanılabilir.

Canlı Tek Hücreleri İzole Etmek için Pankreas Doku Diseksiyonu

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Keşfedin insan pankreas adacık izolasyonu için otomatik sindirim ve doku koleksiyonu yöntemini. Bu prosedür, yüksek kaliteli adacıkların transplantasyon için elde edilmesini sağlar.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

Daha fazla video keşfet