Stres Cevaplarının sırasında Bitki Hormonları İzlenmesi

Bu prosedür, seramik boncuklar kullanılarak bitki materyalinin homojenizasyonu ve ardından organik fazı elde etmek için di kloral metan ekstraksiyonu ile başlar. Santrifüjlemeyi takiben numuneler hava altında kurutulur ve buhar fazı ekstraksiyonu için hazırlanır. Buhar fazı ekstraksiyon filtrelerinden elde edilen elusiyenden sonra, kütle spektrometresi ve gaz kromatografisi kullanılarak bitki hormonu analizine geçilebilir.

Merhaba, ben San Antonio'daki Texas Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeki JU Engelberg Laboratuvarı'ndan Marie Engelberg ve ben Ju Engelberg. Bugün size önemli bitki hormonlarının eş zamanlı olarak ölçülmesi için basit bir prosedür göstereceğiz. Bu hormonlardaki değişiklikleri izlemek için bu yöntemi rutin olarak kullanıyoruz ve böcek ödül teknolojisini planlıyoruz.

Ayrıca yağ asidi bileşimindeki değişiklikleri de izleyebiliriz. Öyleyse başlayalım. Ekstraksiyon için önce iki mililitrelik vidalı kapaklı şişeler hazırlamanız gerekir.

Bunu yapmak için, bir şişeye 400 mikrolitre ekstraksiyon çözeltisi ve mikrolitre başına 10 nanogramda ilgili dahili standarttan 10 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, şişeleri sıvı nitrojen içinde dondurun. Dondurduktan sonra seramik boncukları şişelere ekleyin.

Şişeler hala sıvı nitrojen içinde yerleştirilirken, bitki materyalini 50 ila 200 miligram arasında ekleyin. Eklenen bitki materyalinin ağırlığının, daha sonra taze ağırlığa dayalı olarak kesin miktar tayinine izin vermek için daha fazla işlemden önce tahmin edilmesi gerektiğini unutmayın. Şişeyi bir kapakla sıkıca kapatmadan önce tüm sıvı nitrojenin buharlaştığından emin olun.

Homojenizasyon sırasında çözücülerin ve ekstrakte edilen bileşiklerin dökülmesini önlemek için kapağın kauçuk bir contaya sahip olduğundan emin olun. Dokuyu hızlı bir hazırlık veya PSU boncuk öğütücüde homojenize edin. 30 saniye boyunca PSU'lar için 6.000 hızında homojenizatör.

Homojenize edildikten sonra, şişeleri homojenizatörden ayrı ayrı çıkarın ve her numuneye bir mililitre di kloral metan eklemek için kapağı dikkatlice açın, şişeleri tekrar sıkıca kapatın ve homojenizasyondan sonra 6.000'de 10 ila 15 saniye homojenize edin, şişeleri bir masa üstü santrifüje aktarın ve organik fazı 10'da sulu fazdan ayırın, 000 kez. 60 saniye boyunca G. Faz ayrımından sonra, alt yeşil tabakayı tek tek şişelerden temiz dört mililitrelik bir cam şişeye aktarın.

Bu, hormonları ve iç standartları içeren organik fazdır. Su veya üst faz transferinden kaçının, çözücüyü yaklaşık 10 ila 25 dakika boyunca bir manifolddan hava ile üfleyin. Sürenin uzunluğu numuneye bağlı olacaktır.

Numunelerin kuru olup olmadığını dikkatlice görmek için tek bir hava akış ucuyla kontrol edin. Numuneleri aşırı kurutmadığınızdan emin olun çünkü bu, bileşik kaybına neden olabilir. Numuneler kurutulduktan sonra, numunelerimizdeki karboksilik asit içeren bileşiklerin metilasyonuna başlayabiliriz.

İlk olarak, her bir şişeye hacimce dokuz ila bir hacim 100 mikrolitre D etil eter metanol karışımı ekleyin. Daha sonra, heksan içinde iki molar trimetil Cyl Diaz metan çözeltisinden dört mikrolitre ekleyin. Şişeleri hemen Teflon kaplı silikon septum em ile donatılmış üstü açık bir vidalı kapakla kapatın, şişeleri hafifçe sallayın ve oda sıcaklığında 25 ila 30 dakika inkübe edin.

Bir ısıtma bloğunu açın ve istenen toplama sıcaklığına ayarlayın. Metillenmiş bileşiklerin uçuculuğu, boyutlarına ve polar grupların sayısına bağlı olarak değişecektir. Sıcaklıklar 80 ila 200 derece arasında değişebilir, 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, her bir şişeye heksan içinde dört mikrolitre iki molar asetik asit çözeltisi ekleyerek metilasyon reaksiyonunu durdurun.

Bu, istenmeyen ikincil reaksiyonu önlemek için yapılır. Buhar fazı ekstraksiyonu için kullanılan filtreler el yapımıdır. Teflon tüplerden yapılmıştır.

Bir taraftan, yaklaşık dört santimetre uzunluğunda, iyi oturan bir cam tüp yerleştirilir. Yaklaşık 20 ila 30 miligram emici tutan iki paslanmaz çelik kafes diski görebilirsiniz. Metillenmiş ve uçucu bitki hormonlarının toplanması için kullanılacak filtreleri 200 mikrolitre metanol kullanarak yıkayın.

Ardından, filtreleri iki kez 200 mikrolitre di kloral metan ile yıkayın. Her hava, filtrelerden kalan çözücüyü kurutur. Filtreler artık buhar fazı ekstraksiyonu yoluyla uçucu hormonların yakalanması için kullanılabilir.

Numunelerin 30 dakika inkübe edilmesinden sonra, dört mililitrelik flakon kapaklarının kauçuk septası bir neşter ile kesilir. Artık ekstrakte edilen materyal, buhar fazı ekstraksiyonu ile bitki hormonlarını toplamak için toplanmaya hazırdır. Temizlenen filtreler, dakikada yaklaşık 800 mililitrelik bir akış hızında ayrı vakum hatlarına bağlanır.

Filtreler daha sonra kesilen septadan şişeye yerleştirilir. Hava girişi görevi görmesi için küçük bir pipet ucu da yerleştirilmiştir. Prosedürün bu ilk kısmı sırasında, şişenin içindeki herhangi bir sıvının filtre ucuyla temas etmesini önlemek için filtrenin yerleştirildiği şişelerin dik konumda tutulması gerekir, bu da filtreyi kirletebilir.

Ve daha sonra GCMS, tüm sıvı filtreden buharlaşana kadar şişeleri elle tutar. Daha sonra ekli filtrelere sahip şişeler ısıtma bloğuna yerleştirilir ve ısıyla buharlaşan bileşikler üç dakika boyunca toplanır. Bu son buhar fazı ekstraksiyon adımından sonra, filtreleri hala takılı olan şişeleri bir rafa yerleştirin ve soğumalarını bekleyin.

Filtreler oda sıcaklığına ulaştığında eklerle donatılmış 1,5 mililitrelik GC şişeleri hazırlayın. Yine, şişelere 150 mikrolitre di kloral metan içeren bir döngü. Filtreden kalan çözücü üflendikten sonra, şişeler kapatılır ve artık gaz kromatografisi kütle spektrometresi ile analiz edilebilir.

Analiz için, enjeksiyon bileşikleri bir dakika boyunca 40 santigrat derecede tutulan bir HP bir MS sütunu üzerinde ayrıldıktan sonra kimyasal iyonizasyon modunda çalıştırılan bir kütle spektrometresine arayüzlenmiş bir bölünmüş bölünmüş liste enjektörü ile donatılmış bir gaz kromatografı kullanın. Sıcaklık, dakikada 15 santigrat derece ile 10 dakika boyunca iki 50 Santigrat derece arasında programlanır ve dakikada 0,7 mililitrelik sabit bir akışta taşıyıcı gaz olarak helyum bulunur. MS tabanlı analiz için, hem dörtlü hem de iyon tuzağı tabanlı kütle spektrometresi bir CI gazı olabilir.

İzobütan veya metanol kullanılabilir. Bununla birlikte, her durumda, iyonlaşma reaksiyonunun fragmanları, seçilen iyon sayım programları oluşturulmadan önce kontrol edilmelidir. CI reaktifi olarak bir Satürn MS 2200 kütle spektrometresi ve metanol ile birleştirilmiş bir varyant GC 3, 900 gaz kromatograf sistemi kullanıyoruz.

Programımızın açıklaması için lütfen yazılı protokolümüze bakınız. Tüm bileşiklerin, ticari olarak mevcut otantik standartlarla karşılaştırılarak tanımlandığından emin olun. JA SA ve A BA'nın miktar tayini, tepe alanı ekstrakte edilen iyonların, ilgili dahili standardın tepe alanı ekstrakte edilen iyonları ile ilişkilendirilmesiyle yapılır ve ayrıca kullanılan bitki materyalinin taze ağırlığına dayanır.

GCM S dosyalarından verileri çıkardıktan ve bazı hesaplamalar yaptıktan sonra, etinin, tedavi edilmemiş kontrollerle karşılaştırıldığında önemli miktarda salisilik asit, monik asit ve ayrıca abik asit birikimine neden olduğunu bulduk. Her bir hormon için veriler tek bir çalışmadan alınmıştır ve bu yöntemin multipleks hormon analizi için kapasitesini göstermektedir. Önemli bitki hormonlarını ve diğer sinyal bileşiklerini çıkarmak ve ölçmek için size kolay ama etkili bir prosedür gösterdik.

Gerçekleştirmesi kolaydır ve gördüğünüz aletlerin çoğu standart laboratuvar malzemesinden kolayca yapılabilir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.