Stres Cevaplarının sırasında Bitki Hormonları İzlenmesi

Bu prosedür, bitki materyalinin seramik boncuklar kullanılarak homojenizasyonu ve ardından organik fazı elde etmek için diklorometan ekstraksiyonu ile başlar. Santrifüjleme işleminin ardından örnekler hava altında kurutulur ve buhar fazı ekstraksiyonu için hazırlanır. Buhar fazı ekstraksiyon filtrelerinden elüsyon yapıldıktan sonra, kütle spektrometrisi ve gaz kromatografisi kullanılarak bitki hormonu analizine geçilebilir.

Merhaba, ben San Antonio'daki Texas Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden JU Engelberg Laboratuvarı'ndan Marie Engelberg ve ben de Ju Engelberg. Bugün size önemli bitki hormonlarının eş zamanlı tayini için basit bir prosedür göstereceğiz. Böcek etkileşimleri üzerine olan çalışmalarımızda, bitkilerdeki bu hormonlardaki değişimleri izlemek için bu yöntemi rutin olarak kullanıyoruz.

Yağ asidi kompozisyonundaki değişiklikleri de izleyebiliriz. Öyleyse başlayalım. Ekstraksiyon için öncelikle iki mililitrelik, vidalı kapaklı şişeler hazırlamanız gerekir.

Bunu yapmak için, bir viale 400 µL ekstraksiyon çözeltisi ve 10 ng/µL konsantrasyonunda ilgili internal standartten 10 µL ekleyin. Ardından, vialleri sıvı azot içerisinde dondurun. Dondurma işleminin ardından, viallere seramik boncukları ekleyin.

Tüpler hâlâ sıvı azot içindeyken, 50 ile 200 miligram arasında bitki materyali ekleyin. Daha sonra taze ağırlığa dayalı olarak yapılacak kesin nicelendirmeye olanak sağlamak için, eklenen bitki materyalinin ağırlığının daha ileri işlemlerden önce tahmin edilmesi gerektiğini unutmayın. Tüp kapağıyla sıkıca kapatmadan önce tüm sıvı azotun buharlaştığından emin olun.

Homojenizasyon sırasında solventlerin ve ekstrakte edilen bileşiklerin dökülmesini önlemek için kapağın kauçuk bir contaya sahip olduğundan emin olun. Dokuyu, bir fast prep veya PSU boncuklu öğütücüde homojenize edin. PSU'lar için homojenizatörü 6,000 hızında 30 saniye boyunca çalıştırın.

Homojenizasyon tamamlandıktan sonra, tüpleri homojenizatörden tek tek çıkarın ve her örneğe bir mililitre diklorometan eklemek için kapağı dikkatlice açın; tüpleri tekrar sıkıca kapatıp 6.000 devirde 10 ila 15 saniye boyunca homojenize edin. Homojenizasyon sonrası tüpleri bir masaüstü santrifüje aktarın ve organik fazı sulu fazdan 10.000 ×g hızında 60 saniye boyunca ayırın. Faz ayrımının ardından, tüplerdeki alt yeşil katmanı temiz bir dört mililitrelik cam tüpe aktarın.

Bu, hormonları ve internal standartları içeren organik fazdır. Suyun veya üst fazın transferinden kaçının, çözücüyü bir manifold üzerinden hava ile yaklaşık 10 ila 25 dakika boyunca uçurun. Süre, örneğe bağlı olarak değişecektir.

Numunelerin kuruyup kurumadığını dikkatle gözlemlemek için tek bir hava akış ucuyla kontrol edin. Bileşik kaybına neden olabileceği için numunelerin aşırı kurutulmadığından emin olun. Numuneler kuruduğunda, numunelerimizdeki karboksilik asit içeren bileşiklerin metilasyonuna başlayabiliriz.

Öncelikle, her bir şişeye dokuzla bire hacimce oranlanmış dietil eter metanol karışımından 100 microliters ekleyin. Ardından, heksan içinde iki molar trimetil diazometan çözeltisinden dört microliters ekleyin. Şişeleri, Teflon kaplı silikon septumlu açık üst vidalı kapaklarla hemen kapatın, şişeleri nazikçe çalkalayın ve oda sıcaklığında 25 ila 30 dakika inkübe edin.

Bir ısıtma bloğunu açın ve istenen toplama sıcaklığına ayarlayın. Metillenmiş bileşiklerin uçuculuğu, boyutlarına ve polar grup sayılarına bağlı olarak değişecektir. Sıcaklıklar 80 ile 200 derece arasında olabilir; 30 dakikalık inkübasyonun ardından, her tüpe heksan içinde iki molar asetik asit çözeltisinden dört mikrolitre ekleyerek metilasyon reaksiyonunu durdurun.

Bu işlem, istenmeyen ikincil reaksiyonların önlenmesi için yapılır. Buhar fazı ekstraksiyonu için kullanılan filtreler el yapımıdır. Bu filtreler Teflon tüplerden imal edilmiştir.

Bir taraftan, yaklaşık dört santimetre uzunluğunda, iyi oturan bir cam tüp yerleştirilir. Yaklaşık 20 ila 30 miligram absorban tutan iki paslanmaz çelik ağ disk görülebilir. Metillenmiş ve uçucu bitki hormonlarının toplanması için kullanılacak filtreleri 200 µL metanol kullanarak yıkayın.

Ardından, filtreleri 200 µL diklorometan ile iki kez yıkayın. Filtrelerde kalan çözücüyü havada kurutun. Filtreler artık buhar fazı ekstraksiyonu yoluyla uçucu hormonların tutulması için kullanılabilir.

Numunelerin 30 dakika inkübe edilmesinin ardından, dört mililitrelik flakon kapaklarının kauçuk septaları bir skalpel ile kesilir. Artık ekstre edilen materyal, bitki hormonlarını buhar fazı ekstraksiyonu ile toplamak üzere toplanmaya hazırdır. Temizlenmiş filtreler, dakikada yaklaşık 800 mililitre akış hızında bireysel vakum hatlarına bağlanır.

Ardından filtreler, kesilmiş septumlardan geçirilerek flakona yerleştirilir. Bir hava girişi görevi görmesi için küçük bir pipet ucu da yerleştirilir. Prosedürün bu başlangıç aşamasında, flakon içindeki herhangi bir sıvının filtre ucuna temas ederek filtreyi kontamine etmesini önlemek için, filtrelerin yerleştirildiği flakonlar dik konumda tutulmalıdır.

Ardından, tüm sıvı filtre üzerinden buharlaşana kadar GCMS tüpleri elle tutulur. Daha sonra, filtreleri takılı olan tüpler ısıtma bloğuna yerleştirilir ve buharlaşan bileşikler üç dakika boyunca toplanır. Bu son buhar fazı ekstraksiyon adımından sonra, filtreleri hâlâ takılı olan tüpleri bir rafa yerleştirin ve soğumalarını bekleyin.

Filtreler oda sıcaklığına ulaştığında, insert yerleştirilmiş 1,5 mililitre GC şişelerini hazırlayın. Şişelere 150 mikrolitre diklorometan içeren bir loop ile ekleme yapın. Filtrede kalan çözücü dışarı atıldıktan sonra şişelerin kapakları kapatılır ve artık gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi ile analiz edilebilir.

Analiz için, enjeksiyon sonrası bileşiklerin 40 °C'de bir dakika boyunca tutulan bir HP one MS kolonunda ayrıştırılmasının ardından, kimyasal iyonizasyon modunda çalışan bir kütle spektrometresine bağlı split/splitless enjektör donanımlı bir gaz kromatografı kullanın. Sıcaklık, taşıyıcı gaz olarak 0,7 mL/dakika sabit akışta helyum kullanılarak, dakikada 15 °C artışla 250 °C'ye programlanır ve burada 10 dakika tutulur. MS tabanlı analiz için, CI gazı olarak hem kuadrupol hem de iyon tuzağı tabanlı bir kütle spektrometresi kullanılabilir.

İzobütan veya metanol kullanılabilir. Ancak, her iki durumda da, seçilen iyon sayım programları oluşturulmadan önce iyonizasyon reaksiyonunun fragmanları kontrol edilmelidir. Biz, bir Saturn MS 2200 kütle spektrometresine bağlı olan bir variant GC 3, 900 gaz kromatografisi sistemi ve CI reaktifi olarak metanol kullanıyoruz.

Programımızın açıklaması için lütfen yazılı protokolümüze bakınız. Tüm bileşiklerin, ticari olarak mevcut orijinal standartlarla karşılaştırılarak tanımlandığından emin olun. JA SA ve A BA miktar tayini, ayıklanan iyonların pik alanının ilgili iç standardın ayıklanan iyonların pik alanıyla korele edilmesiyle yapılır ve ayrıca kullanılan bitki materyalinin taze ağırlığına dayanır.

GCM S dosyalarından veriler çıkarıldıktan ve bazı hesaplamalar yapıldıktan sonra, etin uygulamalarının, işlem görmemiş kontrollere kıyasla salisilik asit, monik asit ve ayrıca abik asidin önemli ölçüde birikimine yol açtığını tespit ettik. Her bir hormon için elde edilen veriler tek bir çalışmadan alınmıştır ve bu yöntemin multipleks hormon analizi kapasitesini kanıtlamaktadır. Size, önemli bitki hormonlarını ve diğer sinyal bileşiklerini çıkarmak ve miktarını belirlemek için basit ancak etkili bir prosedür göstermiş olduk.

Uygulaması kolaydır ve gördüğünüz araçların çoğu standart laboratuvar malzemeleriyle kolayca hazırlanabilir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.