Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar
16 Mart 2009
Bu prosedür sinaptik potansiyeller, nöromüsküler bileşke (NMJ) ışık darbeleri ile uyandırmak için mavi bir ışık ile aktive alg kanal ve hücre spesifik genetik ifade araçları kullanır Drosophila Larvaları. Bu teknik, bir ucuz ve emme elektrot stimülasyon, araştırma ve eğitim laboratuvarları sinaptik fizyolojisi çalışmaları için alternatif kullanımı kolay.
Bu prosedür büyüyen drosophila ile başlar. Üçüncüsü, tüm trans retinol içeren gıdalar üzerinde uygun genotipe sahip kurtçuklar. Her kurtçuk baş ve kuyruktan sabitlenir.
Sonra FLA düz. Beyin ve arka sinirler daha sonra ritmik motor aktiviteyi durdurmak için kesilir. Ardından, kontrol kutulu mavi LED ışık kaynağı ayarlanır ve hazırlığa odaklanılır.
Son olarak, altıncı kası kazığa oturtmak için keskin bir elektrot kullanın. Ardından bir voltaj kaynağı ile ışık darbeleri verin. Merhaba, ben Brandeis Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Dr.Leslie Griffith'in laboratuvarından Nicholas Marstein.
Merhaba, ben Stefan Pulver, aynı zamanda Griffith Laboratuvarı'ndan. Bugün size göstereceğiz drosophila larvasının nöromüsküler kavşağında iki tane olmayan kanal kökü ile sinaptik potansiyelleri uyandırmak için. Bu prosedürü laboratuvarımızda sinaptik fizyoloji ve drosophila'yı incelemek için kullanıyoruz.
Ayrıca öğrencilere sinaptik fizyoloji ve öğretim laboratuvarlarını öğretmek için de kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokolü kullanmaya başlamak için, standart sinek ortamı içeren ayrı şişelerde UAS kanal redsin iki ve tamam, 3 7, 1 gal dört sinek hattını koruyun.
Tamam, 3 7, 1 gal, dört sinek hattı ve UAS kanalı redsin'den erkekleri toplayın. İki satır. Daha sonra, bir milimolar, tüm trans retinol veya bir TR.To ile karıştırılmış sinek ortamı yapın ve bu normal sinek ortamını bir mikrodalgada yaklaşık bir dakika eritin.
Eridikten sonra, ortamın yaklaşık 30 ila 60 saniye soğumasına izin verin ve ardından her 10 mililitre sinek ortamı için %100 etanol içinde 100 mikrolitre 100 milimolar TR ekleyin. TR besiyeri içeren şişeler hazır olduğunda, toplanan erkek ve dişileri her bir şişeye koyun. Sineklerin çiftleşmesine ve yumurtlamasına izin vermek için şişeleri 22 ila 25 santigrat derecede karanlık bir alana yerleştirin, yıldız larvalarında üçüncü görünene kadar dört ila beş gün bekleyin.
Bu noktada, yetişkin sinekleri atabilirsiniz. Artık elektrofizyoloji teçhizatı kurulumuna devam etmeye hazırız. Herhangi bir diseksiyon dürbünü göz merceğini, soğutuculu mavi bir LED ışık kaynağına takın.
Bir direk ve cl kullanınamp göz merceğine ve LED ışık kaynağına manyetik bir taban takmak için. Manyetik tabanı elektrofizyoloji teçhizatının hava tablasına yerleştirin. Ardından, ışık kaynağını bir kontrol devresine bağlayın ve ardından kontrol devresini harici bir voltaj kaynağına bağlayın.
Reklam cihazları tarafından yapılan güç laboratuvarı elektrofizyoloji veri toplama sisteminden gelen voltaj çıkışını kullanıyoruz. Voltaj kaynağına bağlandıktan sonra, mavi ışığı etkinleştirmek için kontrol devresine bir ila beş volt darbe verin, mavi ışık huzmesi larva diseksiyonunun işgal edeceği alana odaklanana kadar manyetik tabanı ve ışık kaynağını ayarlayın. Uygun ayarlamaları yaptıktan sonra larva diseksiyonuna geçmeye hazırız.
Diseksiyona başlamak için, sogar kaplı bir tabağın tabanına altı adet 0,1 milimetrelik pim yerleştirin. Yıldız larvalarının üçte birini gıda ortamından çıkarın ve herhangi bir plastik Petri kabına yerleştirin. Larvalara bağlı yiyecekleri çıkarmak için larvaları tuzlu suyla durulayın.
Daha sonra larvaları, çekilen pimlerin yanındaki diseksiyon kabına yerleştirin ve tabağı yarısına kadar tuzlu su ile doldurun. Şimdi larvaları, hayvanın sırt yüzeyi boyunca uzanan iki gümüşi tüpü görebilecek şekilde yönlendirin. Bu gümüşi tüpler soluk borusudur.
Trakeal tüpler arasındaki kuyruğa doğrudan büyük bir pim sokun. Larvaları aşağıda tutun ve kafasına ikinci bir büyük pim yerleştirin. Pim takılıyken gövdeyi uzunlamasına gerdiğinizden emin olun.
Kuyruğa yakın küçük bir kesi yapmak için makas kullanın. Kesiye vücudun uzunluğu boyunca devam edin. Ventral sinirleri ve/veya vücut duvarı kaslarını kesmemek için makasın uçlarının kaldırıldığından emin olun.
Hayvanların dört köşesine dört pim yerleştirin. Şimdi orta bölümü açın. Hayvanı fileto yapmak için pimleri diseksiyon kabına yerleştirin.
Ayrıca hazırlığı, forseps ve makas kullanılarak öğretilecek şekilde sabitleyin. Hayvanın, sindirim organlarının, trakeasının ve yağ cisimlerinin vücutlarını çıkarın. Hazırlığı tuzlu su ile durulayın.
Durulamadan sonra, mikro makas kullanarak preparatın ön loblarını ve ventral ganglionunu bulun. Frontal lobların hemen arkasındaki ventral ganglionu dikkatlice kesin. Diseksiyon tamamlandıktan sonra mavi ışık stimülasyonu ve kas kaydı ile devam edin.
Kas kaydını gerçekleştirmek için 10 ila 20 mega ohm'luk bir direnç elektrodu çekin. Bir elektronik elektrot çektirmesi kullanarak, çekilen elektrodu üç molar KCL ile doldurun. Doldurulmuş elektrodu elektrot tutucusuna yerleştirin.
Şimdi larva hazırlığını teçhizat üzerinde bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Mavi ışığı, disseke edilen hazırlık ışık huzmesinde ortalanacak şekilde ayarlayın. Bir mikro manipülatör kullanarak larvanın herhangi bir vücut duvarı segmentindeki kas altı veya M altı'yı tanımlayın, elektrodu dikkatlice M altıya yerleştirin ve hızlı hiperpolarizasyon kasını izleyin.
Dinlenme membran potansiyelleri negatif 30 milivolt ile negatif 70 milivolt arasında herhangi bir yerde olmalıdır. Elektrot düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, kontrol devresine 20 ila 100 milisaniye voltaj darbeleri verin. Kontrol devresine sağlanan voltajı kademeli olarak artırın.
Kas hücresindeki exci bağlantı potansiyellerine dikkat edin. İşte kısa ışık darbeleri tarafından uyandırılan bir exci bağlantı potansiyelini gösteren temsili bir sonuç. Burada gösterilen exci bağlantı potansiyeli genliği, her ikisinin de yemek yediği bilinen iki motor nöronun toplamı genliğidir.
M altı. Daha düşük yoğunluklar veya daha kısa ışık süreleri, tek bir motor nörondan daha küçük genlikli uyarıcı bağlantı potansiyelini ortaya çıkarabilir. Oph nöromüsküler kavşakta sinaptik potansiyellerin iki aracılı stimülasyonu olmadan kanal yolunun nasıl gerçekleştirileceğini az önce gösterdik.
Bu prosedürü yaparken, diseksiyon sırasında preparatın vücut duvarına zarar vermemeyi unutmamak önemlidir. Bir preparatın sadece bir diseksiyondan sonra aşırı heyecanlanabilmesine rağmen, zamanla sakinleşeceğini ve iyi kayıtlara izin vereceğini hatırlamak da önemlidir. Kasları savururken, ilk kas tabakasının altına vücut duvarına girmemeye dikkat edin.
Elektrotunuz vücut duvarına sıkıştığında. Bazen hiperpolarize potansiyeller elde edebilirsiniz, ancak aslında bir kas hücresinde olamazsınız. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu prosedür, Drosophila larvalarında nöromüsküler kavşakta (NMJ) ışık darbelerine yanıt olarak sinaptik potansiyeller uyandırmak için mavi ışıkla aktive edilen bir alkal kanal ve hücreye özgü genetik ekspresyon araçlarını kullanır. Bu teknik, araştırma ve öğretim laboratuvarlarındaki sinaptik fizyoloji çalışmaları için süksiyon elektrot stimülasyonuna ucuz ve kullanımı kolay bir alternatiftir.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Sinaptik Fizyoloji
- Genetik Ekspresyon
Arka Plan
- Drosophila larvalar genellikle sinirbilim araştırmalarında kullanılır.
- Işıkla aktive edilen kanallar, sinaptik aktiviteyi incelemek için invaziv olmayan bir yöntem sağlar.
- Süksiyon elektrot stimülasyonu gibi geleneksel yöntemler karmaşık ve maliyetli olabilir.
- Bu prosedür, sinaptik potansiyelleri uyandırma sürecini basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Işık stimülasyonunu kullanarak sinaptik fizyolojiyi incelemek için bir yöntem geliştirmek.
- Eğitim ve araştırma amaçları için erişilebilir bir alternatif sağlamak.
- NMJ'deki sinaptik mekanizmalar hakkındaki anlamayı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Belirli besinlerde Drosophila larvaları yetiştirmek.
- Stimülasyona hazırlanmak için larvaları sabitlemek.
- Motor aktiviteyi durdurmak için beyin ve posterior sinirleri kesmek.
- Sinaptik potansiyelleri uyandırmak için mavi bir LED ışık kaynağı kullanmak.
Ana Sonuçlar
- Işık darbelerine yanıt olarak sinaptik potansiyelerin başarılı bir şekilde uyandırılması.
- Mavi ışıkla aktive edilen alkal kanalın etkinliğinin gösterilmesi.
- Yöntemin geleneksel tekniklere güvenilir bir alternatif olarak doğrulanması.
- Sinaptik fizyoloji araştırmalarında daha geniş uygulamalar için potansiyel.
Sonuçlar
- Işıkla aktive edilen yöntem, NMJ fizyolojisi çalışmaları için etkilidir.
- Bu yaklaşım, sinirbilimde araştırma ve öğretimi kolaylaştırabilir.
- Gelecekte yapılacak çalışmalar bu tekniğin ek uygulamalarını araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables non-invasive, light-based stimulation of synaptic activity in a genetically tractable model, reducing technical barriers in neurophysiology workflows. It supports reproducible data generation for target validation in early discovery, particularly where manual electrode manipulation limits throughput or training efficiency. The approach enhances predictive confidence by providing a standardized, scalable alternative to suction electrode stimulation in Drosophila neuromuscular junction studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic transmission mechanisms through precise, light-controlled neuronal activation.
- Operational Value: Reduces reliance on technically demanding suction electrode manipulation, improving assay consistency across users.
- Strategic Value: Supports high-fidelity phenotypic screening of genetic or pharmacological modifiers of synaptic function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable excitatory junctional potentials (EJPs) as a direct readout of neuromuscular transmission efficacy.
- Operational Value: Enables standardized stimulation parameters via blue LED pulse control, improving inter-experiment reproducibility.
- Strategic Value: Facilitates assay miniaturization and adaptation for compound screening in Drosophila-based neurotoxicity or neurotherapeutic screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for studying conserved synaptic pathways with genetic accessibility.
- Operational Value: Allows longitudinal tracking of synaptic phenotypes in larval models with minimal preparation variability.
- Strategic Value: Supports mechanistic de-risking of targets involved in neuromuscular transmission or neurotransmitter release.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a stimulation modality for assessing synaptic function prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of neuronal excitability and synaptic vesicle release mechanisms via controlled light pulses.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable EJP amplitudes suitable for evaluating genetic or chemical perturbations.
- Analytics: Produces continuous voltage trace outputs enabling amplitude, rise time, and frequency analysis of synaptic events.
- Translational Research: Connects to conserved synaptic mechanisms relevant to human neuromuscular disorders through genetic orthology.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable stimulation platform adaptable across multiple larval genotypes and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing measurement variability from electrode placement artifacts.
- Operational Value: Improves lab throughput and training efficiency in teaching and research settings through simplified stimulation setup.
- Strategic Value: Lowers technical barriers to synaptic physiology assays, enabling broader team access and cross-functional collaboration.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions in target prioritization by providing reliable, high-fidelity synaptic readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, electrophysiology, and optical stimulation systems.
- Needs blue LED light source, voltage control circuit, and saline-based electrophysiology rig.
- Demands standardization of retinal feeding, larval staging, and dissection protocols across users.
- Limited to superficial muscle targets due to light penetration constraints in intact preparations.
- Dependent on functional ChR2 expression and co-factor (all-trans retinal) availability in motor neurons.
