Name: Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Öğrenin, Drosophila larvalarının nöromüsküler kavşaklarında Channelrhodopsin2 ile sinaptik potansiyelleri nasıl uyarırsınız. Bu optogenetik yöntem, sinir fizyolojisi araştırmaları ve eğitim laboratuvarları için basit ve uygun maliyetli bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Sağlık hibe RO1GM-33205 ve MH-067.284 LC Griffith Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından ve Brandeis Üniversitesi NJ Hornstein yaz lisans araştırma bursu tarafından desteklenmiştir. Woods Hole, MA: 2008 Sinir Sistemleri ve Davranış yaz kursu (R25 MH059472 NIMH hibe) bir parçası olarak bu tekniği için ön deneyler Deniz Biyoloji Laboratuvarı yapıldı.

Bölüm 1: Hayvan bakım ve genetik haçlar <ol><li> UAS-ChR2 ve standart sinek medya içeren 8 ayrı şişelerde OK371-GAL4 sinek hattı koruyun. </li><li> OK371-GAL4 sinek hatları ve UAS-ChR2 hatlar erkekler bakireler toplayın. </li><li> Kadın ve erkeklerde 1 mM all-trans retina (ATR) ile karışık standart sinek medya içeren bir şişe yerleştirin. ATR gıda ~ 1 dakika için mikrodalga ilk erime düzenli sinek medya tarafından yapılmalıdır. Erimiş sonra, bir dakika 30 saniye için serin ve daha sonra 100 mM sinek medya her 10 ml için% 100 ETOH ATR 100 ul eklemek için izin verir. Buz üzerine yerleştirin şişeleri, sonra 4 karanlık bir alanda saklamak ° C </li><li> Let sinekler arkadaşı ve karanlık bir alanda yumurta 22-25 ° C yatıyordu </li><li> 3. instar larva görünür olana kadar 3-4 gün bekleyin, bu noktada, yetişkin sinekler atmayın. </li></ol> Bölüm 2: Rig kurulum <ol><li> Mavi LED herhangi bir 10x diseksiyon kapsamı göz parçası (bizim durumumuzda, Carl Zeiss Inc www.zeiss.com, Thornwood, NY), soğutucu ışık kaynağı (Thor laboratuarları, www.thorlabs.com, Newton, NJ takın .) Mesaj ve kelepçe ile manyetik taban takın. Işık kaynağı tarafından üretilen elektrik gürültüsünü azaltmak için bir elektrik topraklı kalkan soğutucu örtün. </li><li> Elektrofizyoloji teçhizat hava masaya ışık kaynağı ile yer manyetik taban. </li><li> Devre kontrolü ve dış gerilim kaynağı (Powerlab 4 / 30, ADInstruments www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO) kontrol devresi bağlamak için ışık kaynağı bağlayın. </li><li> Mavi ışık etkinleştirmek için devre kontrol etmek için 1-5 V bakliyat verin. </li><li> Manyetik taban ve ışık kaynağı, mavi ışık demeti larva diseksiyon tarafından işgal edilecek alana odaklanmış kadar ayarlayın. </li></ol> Bölüm 3: Diseksiyon <ol><li> Sylgard astarlı çanak zemine yerleştirin altı 0,1 mm böcek pimleri. </li><li> Herhangi bir plastik Petri yemek yiyecek medya ve yerden bir 3. instar larvaları çıkarın. </li><li> Larvaları gıda çıkarmak için tuzlu su ile durulayın. </li><li> Place çekti pimleri yakın çanak diseksiyon larva ve ½ düzeyde tuzlu su ekleyin. </li><li> Orient hayvanın sırt yüzeyi boyunca çalışan iki gümüş tüpleri (trakea), böylece larvaları. </li><li> Trakeal tüpler arasındaki kuyruk doğrudan büyük bir iğne takın. Larvaları basılı tutun ve başını içine ikinci büyük bir piminin vücut boyuna uzatmak için emin olmak. </li><li> Kuyruk yakınlarındaki küçük bir kesi yapmak ve vücut uzunluğu kadar devam edin. Yanlışlıkla ventral sinirler ve / veya vücut duvarı kasları kesmek için makas ipuçları yetiştirilir emin olun. </li><li> Dört iğneli hayvanın dört köşesine yerleştirin artık açık Midsection bulunuyor. Fileto hayvan şekilde diseksiyon çanak içine ayarlayın. Pin hazırlık dışarı öğretti. </li><li> Forseps ve makas kullanılarak, hayvanın bağırsaklar, trakea ve yağ organları çıkarın. </li><li> Hazırlık tuzlu su ile durulayın. </li><li> Frontal loblar (Şekil A&#39;da görüldüğü gibi) ve hazırlık ventral ganglion bulun. </li><li> Mikro-makas kullanarak, dikkatli bir şekilde sadece frontal loblar arkasında ventral ganglion kesti. </li></ol> Bölüm 4: Kas kayıt ve mavi ışık stimülasyonu <ol><li> Elektronik bir elektrot çektirmesi (Sutter Araçlar) kullanarak 10-20 μω elektrot çekin. </li><li> 3 M KCl ile çekilmiş elektrot doldurun. </li><li> Place elektrofizyoloji teçhizat diseksiyon mikroskobu altında larva hazırlık yakın bir mikromanipülatör ile elektrod, elektrot tutucu ve manevra elektrot ucu doldurdu. </li><li> Vücudun herhangi bir duvar parçasının (Şekil A) Kas 6 (M6) belirleyin. </li><li> M6 içine dikkatlice elektrodu takın ve hızlı bir şekilde hiperpolarizasyon izlemek. Kas istirahat membran potansiyelleri -30 mV -70 mV herhangi bir yerde olmalıdır. </li><li> Mavi ışık, ışık demeti disseke hazırlık merkezli şekilde ayarlayın. </li><li> Devre kontrolü için 20-100 ms voltaj darbeleri verin. Adım adım devre kontrolü sağlanan gerilimi artırmak. Kas hücresi (Şekil 1B) eksitatör kavşak potansiyelleri dikkat edin. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1A kayıt kurulum ve fileto hazırlanması şematik gösterir. Şekil 1B kısa ışık darbeleri ile uyarılmış tipik EJP gösterir. Gösterilen EJP genlik innerve M6 hem bilinen iki motor nöronların genlik toplanır. Düşük ışık şiddetlerinde bir motor ünitesi (veriler gösterilmemiştir) sadece aktif. <img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="Şekil 1" width="600" height="373" /> Şekil 1: A) intraselüler bir kayıt teçhizat ve mavi LED ile Genel şematik. Brain (Br), ventral ganglion (VG) ritmik aktivitesini inhibe kaldırılır. ChR2 GAL4 UAS sistemini kullanarak motor nöronların ifade edilir. M6 kas B) Hücre içi kayıt. 40 ms mavi ışık darbeleri (127 μW / mm 2) güvenilir M6 büyük sinaptik potansiyeller (yıldız) çağrıştırıyor.

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek için hiçbir çıkar çatışmaları var.

Kritik adımlar ilk diseksiyon ve kas hücrelerine girişini içerir. Ilk diseksiyon sırasında sinirler kesilir veya kas bozuksa bu deney geri kalanı devam etmek zordur. Diseksiyon sırasında, bir dorsal insizyon sırasında yukarı doğru mümkün olduğunca makas diseksiyon açısını çok dikkatli olmalıdır. Ikinci önemli adım sırasında, bir kas hücreye girerek, bir geçmişte bir hiperpolarizasyon ~ 30 mV için dikkat etmeniz gerekir. -30 MV Yukarıdaki değerler, elektrot, bir kas hücre içinde ya da sağlıksız bir hücreye doğru ya da de...

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Minutens Pinleri</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Diseksiyon Kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neuroprobe Hücre İçi Amplifikatör ve Baş Bölümü</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;Powerlab 4/30 veri toplama sistemi&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Grass stimülatörü</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Masaüstü Bilgisayar</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Işık Kaynağı</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sinek Besiyeri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-Trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;OK-371 Gal4&lt;/em&gt; Sinekleri</td><td>Bloomington Stock center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-ChR2&lt;/em&gt; Sinekleri</td><td>Fiala lab, Griffith lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED kontrol devresi</td><td>Griffith laboratuvarında üretildi</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;İçeriği: &lt;br/&gt;1. 200 mA Buck Puck&lt;br/&gt;2. Mavi LED&lt;br/&gt;3. İzoleli tel&lt;br/&gt;4. Devre breadboardu&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>LED Soğutucu</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Hava Masası</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Faraday Kafesi</td><td>Griffith laboratuvarında üretildi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Leitz M Mikro-Manipülatör</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Elektrot Tutucu</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Borosilikat Cam</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Elektrot Çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>0.8mM Ca2+ içeren HL 3.1 Salin</td><td></td><td></td><td>İçerik (mM):&lt;br/&gt; NaCl:70 KCl:5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;: 0.8&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;:4 Sukroz:115&lt;br/&gt;NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;: 10 Trehaloz: 5 HEPES</td></tr><tr><td>Mikro-Diseksiyon Araçları</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

synaptic potansiyellerinin channelrhodopsin2 aracılığı uyarım drosophila nöromüsküler kavşaklar

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöromüsküler hazırlık sinaptik fizyolojisi eğitimi için yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Şu anda, sadece bu hazırlık eksitatör junctional potansiyelleri (EJPs) uyandırmak için kullanılabilir anlamına gelir emme elektrot kullanımı içerir. Hem de araştırma ve eğitim laboratuvarları, öğrencilerin sık sık bu tür uyarıcı elektrot manevra ve manipüle zorluk var. Bu çalışmada, biz emme elektrot kullanmadan uzaktan larva NMJ sinaptik potansiyeller uyarmak için nasıl göstermektedir. Channelrhodopsin2 (ChR2) ifade<sup&gt; 4,5,6</sup&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor nöronların<em&gt; GAL4-UAS</em&gt; Sistem<sup&gt; 7</sup&gt; Ve temel elektrofizyoloji donatmak için küçük bir değişiklik yaparak, mavi ışık darbeleri ile EJPs güvenilir bir şekilde uyandırmak için başardık. Bu teknik, özellikle öğrenci teçhizat uygulama zamanı ve kaynakları sınırlı nörofizyoloji öğretim laboratuvarlarında kullanımı olabilir.

Bu prosedür sinaptik potansiyeller, nöromüsküler bileşke (NMJ) ışık darbeleri ile uyandırmak için mavi bir ışık ile aktive alg kanal ve hücre spesifik genetik ifade araçları kullanır<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaları. Bu teknik, bir ucuz ve emme elektrot stimülasyon, araştırma ve eğitim laboratuvarları sinaptik fizyolojisi çalışmaları için alternatif kullanımı kolay.

Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar

Drosophila larval nöromüsküler preparatı, sinaptik fizyolojinin incelenmesinde yararlı bir araç olduğunu kanıtlamıştır1,2,3. Mevcut durumda, mevcut olan tek yöntem...

Bu prosedür, all-trans retinol içeren besiyerinde uygun genotipe sahip üçüncü instar drosophila larvalarının yetiştirilmesiyle başlar. Her larva, baş ve kuyruk kısımlarından iğnelenerek sabitlenir.Ardından FLA düzleştirilir. Ritmik motor aktiviteyi durdurmak için beyin ve posterior sinirler kesilir. Sonrasında, kontrol kutulu mavi LED ışık kaynağı ayarlanır ve preparata odaklanır.Son olarak, altıncı kası delmek için keskin bir elektrot kullanın. Ardından bir voltaj kaynağı ile ışık darbeleri uygulayın. Merhaba, ben Dr. Leslie Griffith'in laboratuvarından, Brandeis Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Nicholas Marstein.Merhaba, ben de Griffith Laboratuvarı'ndan Stefan Pulver. Bugün size, drosophila larvasının nöromüsküler ekleminde, channel root absent two ile sinaptik potansiyellerin uyandırılması prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda drosophila sinaptik fizyolojisini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.Ayrıca bunu öğrencilere sinaptik fizyolojiyi öğretmek ve öğretim laboratuvarlarında kullanıyoruz. Hadi başlayalım. Bu protokole başlamak için, UAS channel redsin two ve 3 7, 1 gal four sinek hatlarını standart sinek besiyeri içeren ayrı şişelerde muhafaza edin.3 7, 1 gal, dört sinek hattından bakireleri ve UAS channel redsin iki hattından erkekleri toplayın. Ardından, 1 millimolar all-trans retinol veya ATR ile karıştırılmış sinek besiyeri hazırlayın. Bunun için standart sinek besiyerini mikrodalga fırında yaklaşık bir dakika boyunca eritin.Besiyeri eridikten sonra, yaklaşık 30 ila 60 saniye boyunca soğumaya bırakın ve ardından her 10 mililitre sinek besiyeri için %100 etanol içinde 100 milimolar a TR'den 100 mikrolitre ekleyin. a TR içeren besiyerli tüpler hazır olduğunda, toplanan erkek ve dişileri her tüpe yerleştirin. Sineklerin çiftleşmesi ve yumurta bırakması için tüpleri 22 ila 25 derece santigrat sıcaklıktaki karanlık bir alana yerleştirin ve üçüncü instar larvalar görünene kadar dört ila beş gün bekleyin.Bu noktada, yetişkin sinekleri imha edebilirsiniz. Artık elektrofizyoloji düzeneğinin kurulumuna geçmeye hazırız. Herhangi bir diseksiyon mikroskobu okülerini, ısı emiciye sahip mavi bir LED ışık kaynağına takın.Oküler ve LED ışık kaynağını sabitlemek için bir destek çubuğu ve kıskaç kullanarak manyetik tabanı tutturun. Manyetik tabanı elektrofizyoloji düzeneğinin hava tablası üzerine yerleştirin. Ardından, ışık kaynağını bir kontrol devresine bağlayın ve ardından kontrol devresini harici bir voltaj kaynağına bağlayın.AD Instruments tarafından üretilen power lab elektrofizyoloji veri toplama sisteminden gelen voltaj çıkışını kullanıyoruz. Voltaj kaynağına bağlandıktan sonra, mavi ışığı aktive etmek için kontrol devresine bir ila beş voltluk darbeler verin; mavi ışık demeti larva diseksiyonunun yapılacağı alana odaklanana kadar manyetik tabanı ve ışık kaynağını ayarlayın. Gerekli ayarlamaları yaptıktan sonra, larva diseksiyonuna geçmeye hazırız.Diseksiyona başlamak için, agar kaplı bir kabın tabanına altı adet 0,1 milimetre boyutunda pin yerleştirin. Üçüncü evre yıldız larvalarını besiyerinden çıkarıp herhangi bir plastik Petri kabına koyun. Larvalara yapışmış olan besinleri temizlemek için larvaları salin ile durulayın.Ardından larvaları, çıkarılan pinlerin yanındaki diseksiyon kabına yerleştirin ve kabı yarıya kadar salinle doldurun. Şimdi larvaları, hayvanın dorsal yüzeyi boyunca uzanan iki gümüşi tüpü görebileceğiniz şekilde konumlandırın. Bu gümüşi tüpler trakealardır.Büyük bir iğneyi, trake tüplerinin arasından doğrudan kuyruk kısmına yerleştirin. Larvayı aşağıya doğru bastırın ve ikinci bir büyük iğneyi baş kısmına yerleştirin. İğne yerleştirilirken gövdenin boyuna olarak gerildiğinden emin olun.Kuyruğun yakınına makasla küçük bir insizyon yapın. İnsizyonu gövde boyunca yukarıya doğru sürdürün. Ventral sinirleri ve/veya gövde duvarı kaslarını kesmemek için makas uçlarının yukarıda kaldığından emin olun.Hayvanların dört köşesine dört adet iğne yerleştirin. Şimdi orta kısmı açın. Hayvanı fileto haline getirmek için iğneleri diseksiyon kabına sabitleyin.Hazırlığı, pens ve makas kullanılarak çalışılacak şekilde sabitleyin. Hayvanın sindirim organlarını, trakeasını ve yağ cisimlerini çıkarın. Hazırlığı salin ile durulayın.Durulama işleminden sonra, mikro makas kullanarak preparatın frontal loblarını ve ventral gangliyonunu bulun. Frontal lobların hemen arkasındaki ventral gangliyonu dikkatlice kesin. Diseksiyon tamamlandığında, mavi ışık stimülasyonuna ve kas kaydına geçin.Kas kaydı gerçekleştirmek için, 10 ila 20 mega ohm dirençli bir elektrot çekin. Elektronik bir elektrot çekici kullanarak, çekilen elektrodu üç molar KCL ile doldurun. Doldurulan elektrodu elektrot tutucuya yerleştirin.Şimdi larva hazırlığını düzenek üzerindeki bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Mavi ışığı, diseke edilmiş hazırlık ışık demetinin merkezinde olacak şekilde ayarlayın. Bir mikromanipülatör kullanarak larvanın herhangi bir vücut duvarı segmentindeki altıncı kası veya M6'yı tanımlayın, elektrodu dikkatlice M6'ya yerleştirin ve kasın hızlı hiperpolarizasyonunu gözlemleyin.Dinlenim membran potansiyelleri -30 mV ile -70 mV arasında olmalıdır. Elektrot uygun şekilde yerleştirildikten sonra, kontrol devresine 20 ila 100 ms'lik voltaj darbeleri uygulayın. Kontrol devresine verilen voltajı kademeli olarak artırın.Kas hücresindeki uyarıcı kavşak potansiyellerini izleyin. Burada, kısa ışık darbeleriyle uyarılan bir uyarıcı kavşak potansiyelini gösteren temsili bir sonuç yer almaktadır. Burada gösterilen uyarıcı kavşak potansiyeli genliği, her ikisinin de aktive olduğu bilinen iki motor nöronun toplam genliğidir.M altı. Işığın daha düşük yoğunlukları veya daha kısa süreleri, tek bir motor nörondan kaynaklanan daha düşük amplitüdlü eksitatör bağlantı potansiyelini ortaya çıkarabilir. Az önce size, kurbağa nöromusküler bağlantısındaki sinaptik potansiyellerin kanal rodopsin 2 aracılı stimülasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik.Bu prosedür uygulanırken, diseksiyon sırasında preparatın vücut duvarına zarar vermemeye dikkat etmek önemlidir. Ayrıca, bir preparatın diseksiyonun hemen ardından aşırı uyarılmış olabileceği, ancak zamanla sakinleşerek sağlıklı kayıtlar alınmasına izin vereceği unutulmamalıdır. Kaslara impalasyon yaparken, birinci kas tabakasının altına, vücut duvarına inmemeye dikkat edin.Elektrodunuz vücut duvarına saplandığında, bazen hiperpolarize potansiyeller elde edebilirsiniz ancak aslında bir kas hücresinin içinde olmayabilirsiniz. Durum bundan ibarettir.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

channelrhodopsin2-mediated-stimulation-synaptic-potentials-at

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada Drosophila larva nöromüsküler kavşakta sinaptik iletim ölçmek için elektrofizyolojik yöntemler açıklanmaktadır. Uyarılmış serbest motor nöron aksonları uyararak yapay olarak başlatılan ve iletim yoluyla NMJ kas uyarılmış postsinaptik tepki ölçülebilir.

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

Bu video, Drosophila larvasının nöromüsküler kavşağındaki sinaptik bir bouton'dan sinaptik akımları kaydetme tekniğini göstermektedir. Bu teknik, gelişmiş spontan veya asenkron sinaptik aktiviteye sahip mutant sinek hatlarının incelenmesi için önemli olan tek bir sinaptik bouton aktivitesinin izlenmesini sağlar.

Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşakta Sinaptik Akımların Kaydedilmesi

Yarı sağlam motor çıkış değişiklikleri (kas kasılması) izlerken Burada motoneuronal faaliyet optogenetic manipülasyon için bir protokol...

Yarı sağlam Lazer Aydınlatma ile Sinir Faaliyet optogenetic Pertürbasyon<em&gt; Drosophila</emMotion&gt; Larva

Keskin mikroelektrotlar, canlı Drosophila'da fotoreseptörün ve görsel internöron çıkışının doğru elektrofizyolojik karakterizasyonunu sağlar. Burada, tek tek hücrelerin kontrollü ışık stimülasyonuna yüksek kaliteli voltaj tepkilerini kaydetmek için bu yöntemin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu yöntem, böcek bileşik gözlerinde nöral bilgi işlemeyi incelemek için idealdir.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Sinaptik akımları, Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromüsküler kavşak görüntülenmeyecektir sinaptik boutons üzerinden focally kaydedilebilir. Bu teknik, tek bir sinaptik bouton etkinliğini izleme sağlar.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Bu makalede tarafından istihdam Tetradotoksin ve Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanal, NaChBac arasındaki monosynaptic bağlantıları sınamak için bir yöntem sunar.

Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanallarını kullanarak Drosophila Monosynaptic bağlantıları inceleyerek

Sinaptik vezikül (SV) Bisiklete binme nöronal sinapslarda, hücreler arası iletişim çekirdek mekanizması vardır. FM boya alımı ve yayın kantitatif SV endo - ve ekzositozu raporlaması birincil yoludur. Burada, biz FM1-43 Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) modeli sinaps Bisiklet sürmeyi tüm uyarım yöntemleri karşılaştırın.

FM sinaps Bisiklete binme boya: yüksek potasyum depolarizasyon, elektrik ve Channelrhodopsin stimülasyon karşılaştırma

Channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM) anatomik ve / veya genetik olarak tanımlanan nöron grupları arasında uzun menzilli nöronal projeksiyonlar fonksiyonel haritalama için hassas bir tekniktir. Burada, işitsel beyin sapı bağlantılarını haritalamak için CRACM'nin nasıl kullanılacağını anlatıyoruz, buna kırmızı-shifted opsin, ChrimsonR'ın kullanımı da dahil.

Mavi ve Kırmızı-shifted Channelrhodopsins ile Inferior Colliculus Nöronların Uzun menzilli Channelrhodopsin destekli Devre Haritalama

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde tanımlanmış nöronal partnerler arasındaki fonksiyonel sinaptik aktiviteyi in vivo olarak değerlendirir; genetik olarak kodlanmış araçlar kullanılır. Presinaptik cIVda duyusal nöronların CsChrimson aracılı optogenetik uyarısı, postsinaptik Basin-4 internörlerinde CaMPARI'nin kalsiyuma bağlı fotodönüşümünü indükler.

CaMPARI kullanılarak Drosophila larva merkezi sinir sisteminde bireysel pre- ve postsinaptik partnerlerin fonksiyonel karakterizasyonu

Öğrenin, Drosophila larvalarının nöromüsküler kavşaklarında Channelrhodopsin2 ile sinaptik potansiyelleri nasıl uyarırsınız. Bu optogenetik yöntem, sinir fizyolojisi araştırmaları ve eğitim laboratuvarları için basit ve uygun maliyetli bir alternatif sunar.

Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar

Daha fazla video keşfet