MİYOJEN Engineered Doku oluşturur imalatı

Bu prosedür, Neonatal Lewis Wraths'tan iskelet kası dokusunun hasadı ile başlar. Bu dokudan miyoblast hücrelerini izole ederiz. Bu miyoblastlar, doku kültürü kaplarında iki gün boyunca kültüre edilir, ardından hasat edilerek kolajen tabanlı bir doku konstrükt karışımına eklenir.

Bu karışım, kültür ortamına batırılmış bir kalıba dikkatlice pipetlenir ve 37 °C'de inkübe edilir. Merhaba, ben Boston Çocuk Hastanesi ve Harvard Tıp Fakültesi Anesteziyoloji Bölümü'ndeki Douglas Cowan laboratuvarından Christina Pesach. Bugün size miyojenik mühendislik dokusu oluşturma prosedürünü göstereceğiz.

Kalbe yerleştirmek üzere mühendislik ürünü bir doku üretmek için bu prosedürü kullanıyoruz. Amacımız, tam kalp bloğu olan çocuklarda kalp pili implantasyonuna alternatif bir tedavi olarak, kalbin üst ve alt odacıkları arasında elektriksel bir bağlantı oluşturmaktır. Öyleyse başlayalım.

Yapıda, cerrahi olarak implante edilebilir kolajen bazlı doku konstrüktüne form vermek için döküm kalıbı kullanılır. Bu videoda, iskelet miyoblastları içeren mühendislik ürünü doku konstrüktlerinin oluşturulma süreci ek bir videoda açıklanmaktadır. Bu protokolde hazırlanan hücreleştirilmiş dokunun kardiyak implantasyonu gösterilmektedir.

Bir doku kalıbı, dokunun tasarlandığı her türlü kalbin fizyolojik gereksinimlerini karşılamak için neredeyse her şekil veya boyutta yapılabilir. Bu gösterimde kalıp, yetişkin bir sıçan kalbinin AV oluğuna sığacak şekilde dilimlenebilen bir doku parçası oluşturacaktır. Silikon tüplerini jilet kullanarak üç santimetre uzunluğunda parçalar halinde kesip ardından her parçayı boylamasına ikiye bölerek kalıbı oluşturmaya başlayın.

Küçük bir parça polyester ağ kesin. Ardından, tüpün en uç kısmının iç tarafına bir damla implant sınıfı RTV silikon yapıştırıcı yerleştirin. Yapıştırıcı kültüre edilmiş hücreler için bir miktar toksik olduğundan, uygulanan yapıştırıcı miktarını minimumda tutmaya çalışın.

Küçük bir polyester ağ parçasını silikon yapıştırıcı damlasının üzerine hızla yerleştirin ve tüpün ucuyla hizalayın. Bu, konstrükt tutunması için hafifçe yükseltilmiş ve düz bir yüzey sağlayacaktır. İşlemi tüpün diğer ucu için tekrarlayın.

Kalıpların oda sıcaklığında üç gün boyunca kurumasına izin verin. Bu kalıplar esasen tek kullanımlık olduğu için bir seferde 20 ila 30 adet kalıp hazırlamak faydalıdır. Yapıştırıcı tamamen kuruduktan sonra, kalıpları sterilize etmeye yardımcı olmak amacıyla, hazır olan kalıpları ihtiyaç duyulana kadar %70 ethanol ile dolu bir kapta saklayın.

Ardından, hücre izolasyonuna hazırlanmak için gerekli tüm çözeltilerin kullanıma hazır olup olmadığını belirleyin. Antibiyotik ve bir fungusit içeren 250 mL 0,2 mikron filtre steril PBS içinde 1 mg laminin ile seyreltilmiş bir laminin çözeltisi hazırlayın.

Ardından, 150 milimetrelik doku kültürü plakalarını dört mililitre seyreltilmiş laminin çözeltisi ile kaplayın ve kullanmadan önce 37 °C'de en az dört saat inkübe edin. Ayrıca iki başka çözelti daha hazırlanmalıdır: miyoblast medyumu ve iskelet kası sindirim çözeltisi.

Formülasyonları için protokolün metin kısmına bakınız. Sindirim tamponunu, 10 mililitrelik bir şırıngaya takılmış 0.2 mikronluk bir filtre disk kullanarak sterilize edin. Sindirim tamponu alikotları eksi 20 derece Celsius'ta saklanabilir.

Lewis sıçan batini başına beş mililitre sindirim tamponuna ihtiyaç duyacağınızı öngörün. Gerekli miktardaki doku sindirim tamponunu ve 10 mililitre miyoblast ortamını 37 °C'de inkübe edin. Ardından sıçan yavrularının disseksiyon işlemine geçin.

Öncelikle, forseps ve küçük makas kullanarak sakrifiye edilmiş neonatal Lewis sıçanlarından en az bir batın temin edin. Ölü neonatal Lewis sıçanlarının sırt kısmını omurilik boyunca boylu boyunca keserek, deri ve fasya tabakalarını geriye doğru soyup ardından kasları çıkararak paraspinal kasları ayırın. Çıkarılan kasları, buz üzerinde 40 mL 1X HBSS ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

Kas şeritlerinin tüpün dibine çökmesine izin verin ve bir kültür ortamında, steril bir pastör pipeti ile vakum aspirasyonu yaparak sıvının ve kan kalıntılarının çoğunu dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, hasat edilen kas parçalarını 150 milimetrelik bir kültür kabına boşaltın ve kalan sıvıyı mümkün olduğunca aspire edin. İki adet tek kenarlı jilet kullanarak, dokuyu koyu bir macun kıvamına gelene kadar ince ince kıyın.

Kas pastası, önceden ısıtılmış sindirim solüsyonu içerisinde sindirilecektir. Sindirim solüsyonunun bir kısmını kas pastasının üzerine dökün ve solüsyon ile kas pastası karışımını yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Üç litrelik Lewis sıçanlarından alınan kasların verimli bir şekilde sindirimi için genellikle 10 mililitrelik pipet kullanarak 10 ila 15 mililitre solüsyon kullanırız.

Tüpü sallantılı bir platforma yerleştirin ve 37 °C'de yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe ederek sindirin. Enzimatik sindirim sırasında, doku kabarcık oluşturmadan ara ara triteler. Kablosuz bir pipete takılı 10 mL pipet kullanın.

Kas dokusu sıvı hale getirildikten sonra, solüsyonu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Ardından, filtrelenmiş hücreleri oda sıcaklığında, 600 G hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin; bir pastör pipeti ve vakum yardımıyla sıvının mümkün olduğunca tamamını aspire edin ve pelleti 10 mililitre ılık miyoblast besiyeri ile yeniden süspande edin. Fibroblastlar miyoblastlardan daha hızlı yapıştığı için, herhangi bir fibroblastın uzaklaştırılmasına yardımcı olmak amacıyla hücreleri kaplanmamış 150 milimetrelik bir doku kültürü plağında 15 dakika ön ekimleyin.

Plakayı, 37 °C'ye ve %5 karbondioksite ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Plakayı inkübatörden çıkarın ve Lamin kaplı kültüre henüz yapışmamış olan hücreleri transfer edin. Bunları, her bir veya iki sıçan yavrusu için bir plak olacak şekilde miyoblast ortamında seyreltin.

Hücreler çok yoğun ekilirse, miyotüplere farklılaşırlar. Son olarak, hücrelerin %5 karbondioksit içeren, 37 °C'ye ayarlanmış nemlendirilmiş bir ortamda büyümelerini sağlayın. Bir ila iki günlük inkübasyonun ardından hücreler, doku konstrüktleri şeklinde döküme hazır hale gelecektir.

Bir ila iki günlük inkübasyonun ardından, 150 milimetrelik miyoblast doku kültürü plakalarının dördünü inkübatörden çıkarın. Fibroblastların miyoblast popülasyonuna baskın gelmemesi için 48 saatten fazla beklemeyin. Hücrelerdeki besiyerini aspire edin.

Ardından, miyoblastları plakadan ayırmak için hücreleri 37 °C'ye ısıtılmış XPBS ile iki kez durulayın; her plakaya dört mililitre ısıtılmış %0,05 trypsine EDTA çözeltisi ekleyin ve plakaları beş dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Miyoblastları kültür kabininde hasat edin ve sıvıyı 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Tüm plakaları durulamak için 10 mililitre miyoblast medyumu kullanın ve bunu santrifüj tüpündeki hücrelerle birleştirin.

Hücreleri oda sıcaklığında 600 G'de 10 dakika boyunca pelletleyin ve fazla sıvının mümkün olduğunca fazlasını aspire ederek uzaklaştırın. Ardından miyoblastları 1,4 milliliters miyoblast medyumu içinde yeniden süspanse edin ve buz üzerine yerleştirin. Bir pens yardımıyla, bir konstrükt kalıbını dikkatlice etanol banyosundan çıkarın ve XPBS içine daldırarak iki kez durulayın; kalıbı altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasının boş bir kuyucuğuna yerleştirmeden önce tüm PBS kalıntılarını bir pastör pipeti ile aspire edin.

Bu aşamada bir solüsyon hazırlanmalıdır. Aşağıdaki reaktifleri buz üzerinde toplayın. 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.

Tip bir kolajen hücreleri; miyoblast ortamı, sodyum bikarbonat ve jel içerisinde yeniden süspande edilir. Reaktifleri yazılı protokole uygun olarak birleştirin. Karışımı 20 saniye boyunca vorteksleyin; karışım pembe renge dönecektir.

Ticari olarak mevcut olan tip bir kolajen çeşitlerinin; karışım, katılaşma ve kıvam üzerinde değişken etkileri olduğununa dikkat edin. Nihai üründe. Çözeltideki kabarcıkları gidermek için tüpü birkaç dakika boyunca buz kovasına geri koyun.

Tip bir kolajen ışınlanmamıştır, aksi takdirde jelatinleşmeyecektir. Burada, yumurta derisinden türetilmiş bir ürün kullanıyoruz. Karışım katılaşmadan önce, karışımı kültür plakasındaki kalıba dikkatlice dökün.

Her bir kalıba yaklaşık bir mililitre viskoz sıvı konulacaktır. Bu işlem sırasında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Konstrükt kalıplarını içeren plakayı dikkatlice 37 °C inkübatöre aktarın.

Karışım katılaştıkça, rengi koyu pembeden açık pembeye dönecektir; kalıp katılaşırken bir miktar miyoblast medyumunu 37 degrees Celsius'ye kadar ısıtın. Yaklaşık yarım saatlik inkübasyonun ardından, her bir doku yapılandırmasını dikkatlice ısıtılmış miyoblast medyumuna daldırın ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Bu protokol düzgün bir şekilde uygulandığında, miyoblast içeren doku yapılandırması in vivo implantasyon veya ileri analizler için hazır hale gelir.

İki günlük inkübasyonun ardından, miyojenik bir doku mühendisliği konstrüktünün nasıl üretileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, erken katılaşmayı önlemek için konstrükt çözeltisi için gerekli tüm reaktiflerin buz üzerinde tutulmasının önemli olduğunu unutmayın. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.