Name: MİYOJEN Engineered Doku oluşturur imalatı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Öğrenin, iskelet kası myoblastları içeren kollajen bazlı doku yapılarının üretimini ve kalp bloğu onarımı için elektriksel iletken olarak kullanımını. Bu yöntem rejeneratif tıpta uygulama potansiyeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yeni Teşvik Ödülü, Thrasher Araştırma Fonu ve Boston Çocuk Hastanesi&#39;nden Kalp İletim Fonu katkı; Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü&#39;nün araştırma hibeleri (HL088206 HL068915) tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1: döküm kalıpları inşa birleştirin. <ol><li> Yarıya silikon tüp (VWR) ve 3 cm uzunluğunda parçalar halinde kesmek için jilet kullanın. </li><li> Hortumun her iki ucundaki iç implant dereceli RTV silikon yapıştırıcı (Rhodia) bir damla yerleştirin. </li><li> Silikon yapıştırıcı açılan küçük bir parça polyester örgü (1 cm x 1 cm) (McMaster-Carr) hızlı bir şekilde yerleştirin ve hortumun ucu ile aynı hizaya getirin. Bu yapı eki için biraz yükseltilmiş ve düz bir yüzey sağlayacaktır. Diğer ucu için tekrarlayın. </li><li> Kalıp, 3 gün boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Bu aslında tek olarak, bir defada 20 ila 30 kalıp yapmak için yararlı olur. </li><li> Yapıştırıcı tamamen kuruduktan sonra ihtiyaç duydukları kadar,% 70 etanol ile dolu bir beher bu kalıpları saklamak. Bu adım kalıpları sterilize yardımcı olacak ve bitmiş ürün Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. </li></ol> Bölüm 2: myoblast hücre izolasyonu için Hazırlık <ol><li> 250 1 mg Laminin (Sigma) sulandırınız ml 0.22 mikron filtre ile sterilize edilmiş fosfat tamponlu salin (PBS) ve% 1 penisilin / Streptomisin (Invitrogen) ve% 1 Fungizone (Invitrogen) içeren. </li><li> Coat 150 mm 4 seyreltilmiş Laminin çözüm adımı 1.1 mL ve birincil iskelet matür kaplama önce en az 4 saat süreyle 37 º C&#39;de inkübe doku kültürü levhalar (BD Falcon). </li><li> (% 20 FBS (Atlanta Biyolojik), 5 ng / L temel Fibroblast Büyüme Faktörü (Promega), 1% Penisilin / Streptomisin (Invitrogen), ve% 1 Fungizone Ham F-10 Besin Karışım (Sigma) karıştırma myoblast orta olun Invitrogen). </li><li> 1 g, 100 mL 2.4 U / ml Dispase-2 (Roche) ~ 295 U / mg kollajenaz 2 (Worthington) eriterek iskelet kas sindirim çözüm hazırlayın. 0.037 g CaCl 2 ekleyin ve iyice karıştırın. -20 ° C&#39;de 10 ml şırınga ve mağaza alikotları takılan bir 0,2 mikron filtre disk kullanarak sindirim tampon sterilize filtreleme 37 ° C myoblast medya ile birlikte doku sindirim için gerekli olan miktar koyun. </li></ol> Bölüm 3: iskelet kas Myoblast izolasyonu <ol><li> Forseps ve küçük bir makas kullanarak, omurilik boyunca arka dilimleme cilt ve fasya tabakaları geri soyma ve sonra kasların eksize ölü yenidoğan Lewis sıçan paraspinal kaslar çıkarın. </li><li> Bir doku kültürü kaputu, buz üzerinde 1X Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi 40 ml (HBSS) (Invitrogen) ile dolu bir 50 ml konik tüp (BD Falcon) eksize kasları yerleştirin. Kas şeritleri tüp altına yerleşmek ve dikkatli bir kültür kapağı (Baker), steril bir Pasteur pipet yardımıyla vakum emme sıvı ve kan kalıntılarının en çıkarmak için izin verin. </li><li> Hasat kas adet 150 mm kültür çanak üzerine dökün ve mümkün olduğunca emme ile kalan sıvı kadar kaldırın. 2 tek kenarlı Jilet kullanmak kalın bir macun doku kıyma. Hamurun üzerine dökün ve önceden ısıtılmış sindirim çözüm karışımı 10 ml pipet kullanarak yeni bir 50 ml tüp transferi. Enzimatik sindirim sırasında, doku bazen telsiz Pipet-Aid (Drummond) takılan 10 ml pipetle (köpüren olmadan) triturated konumundadır. Yine, aşırı sıvı doku yerleşmek ve kaldırmak için izin verir. </li><li> Sallanan bir platform üzerinde tüp yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika süreyle 37 º C&#39;de sindirimi. </li><li> Kas sıvılaştırılmış sonra, 600 xg (Beckman GP) 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 70 mikron hücre süzgecinden (BD Falcon) ve santrifüj yoluyla çözüm geçmek. Pasteur, pipet ve emme ile sıvı kadar mümkün olduğunca kaldırın ve tekrar süspansiyon, 10 ml sıcak myoblast orta pelet. </li><li> Ön plakası 15 dakika boyunca bir kaplanmamış 150 mm doku kültürü plaka hücreleri fibroblastlar kaldırmanıza yardımcı olmak için. </li><li> Henüz laminin kaplı Kültür varlıkları bağlı ve her 1 ila 2 sıçan yavrular için bir tabak olacak şekilde seyreltik hücreleri aktarın. 37 ° C ile% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir inkübatör seti plaka koyun. </li></ol> Bölüm 4: Döküm mühendislik doku yapıları (5 ml) <ol><li> 1 ila 2 gün sonra, 10 inkübatör 150 mm myoblast doku kültürü tabak kaldırmak için, 37 ° C 1X PBS ile iki kez yıkayın ve sıcak,% 0.05 tripsin-EDTA 4 mL her plaka ekleyin. 5 dakika süreyle inkübatör plakaları geri dön. </li><li> Kültür kaputun içindeki plakalar müstakil matür Hasat ve 50 ml tüp içinde sıvı (BD Falcon) toplayabilir. 10 ml myoblast orta plakaların yıkayın ve santrifüj tüpüne hücreleri birleştirmek için kullanın. Pelet 600 xg (Beckman GP) 10 dakika oda sıcaklığında hücreleri ve adım 3.5 &#39;te açıklandığı gibi aşırı sıvı kaldırmak. </li><li> Buz üzerinde myoblast orta ve yerin 1.6 mL myoblast hücreleri tekrar </li><li> Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde adım 1,5 &#39;dan 4 yapı kalıpları kaldırmak ve onları 1X PBS ile iki kez yıkayın. 6-iyi bir doku cu her kalıp yerleştirmeden önce Pasteur pipeti ile PBS tüm izlerini kapalı vakum emmelture plaka (BD Falcon). </li><li> Buz üzerinde yapı hazırlanması için gerekli diğer reaktifler (10X Ham F10, antibiyotikler, tip 1 kollajen [3,9 mg / ml] [6] ve Matrigel ™) toplayın ve 37 º C&#39;de myoblast medya tutmak 500 mcL 10X Ham F10, 100 mcL Penisilin / Streptomisin, 100 mcL Fungizone, 1.6 ml kollajen, ve 15 ml konik tüp içinde 750 mcL Matrigel ™ birleştirdik. 10 sn buz üzerinde 10 Mini-Vortexer (VWR) ve yeri için çözüm karıştırın. </li><li> Sonra, adım 3.5 80 NaHCO 3 mcL ve 3.3 adım myoblast süspansiyon karışıma ekleyin. 10 sn vorteksleyin tüm karışım ve baloncuklar çözüm temizlemek için birkaç dakika süreyle buz kovası tüp. </li><li> 10 ml pipet kullanarak katılaşmaya başlamadan önce kalıplar içine karışımı dikkatlice döküm. Her kalıp viskoz sıvı yaklaşık 1 ml yapacak. Bu işlem sırasında hava kabarcıkları tanıtan önlemek için deneyin. </li><li> Inkübatör dökme yapıları içeren plaka dikkatlice aktarın. ~ 30 dakika sonra, inkübatör katılaşmış yapıları kaldırmak ve doku inşa kapsayacak şekilde dikkatle, her bir kuyunun myoblast orta eklemek. Inkübatör (Şekil 2) plaka dönün. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci sonuçları Bu protokol düzgün çalıştırıldığında, myoblast içeren doku inşa in vivo implantasyon için hazırdır (küf kaldırılır gibi) ya da 2 gün sonra in vitro analizler Daha fazla bilgi için . <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure1.jpg" alt="" /> Şekil 1. tamamlanan yapı kalıp örnekleri (Adım 1.5 &#39;e bakınız). <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure2.jpg" alt="" width="400" height="321" /> Şekil 2 katılaşmış myoblast içeren doku [1] inşa. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure3.jpg" alt="" /> Şekil 3: H &amp; E myoblast içeren doku lekeli bölümleri oluşturun . &quot;A&quot; uzunlamasına bir bölümü gösteriyor ve &quot;B&quot; bir kesit göstermektedir.

<ol><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Blau, H. M., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human muscle cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).</li>
<li>Powell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+human+bioartificial+muscles+expressing+a+foreign+recombinant+protein+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).</li>
<li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Gallop, P. M., Seifter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Properties+of+Soluble+Collagens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Properties of Soluble Collagens.</a> Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).</li>
</ol>

Boston Çocuk Hastanesi&#39;nden Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Olacağı doku inşa döküm kalıpları, herhangi bir şekil ve boyut olarak yapılabilir, ancak, ek, en az iki puan olması gerekir. Aksi takdirde, matriks ve hücrelerin küresel bir yapı oluştururlar ve hücreleri ölür. Bu protokolde, polyester mesh kullanımı bu amaç için bir tarif, ama biz de başarıyla kullanılan paslanmaz çelik hasır. Açıkçası, büyük kalıplar daha fazla hücre ve diğer malzemelerle daha büyük bir hacim gerektirir. Kalıpları yaparken, kullanılan silikon yapıştırıcı miktarını en aza indirmek ve boru çok uçlarında...

<table><tbody><tr><td>Silikon boru</td><td>VWR international</td><td>60985-724</td><td></td></tr><tr><td>Silikon yapıştırıcı</td><td>Rhodia Silicones</td><td>MED ADH 4300 RTV</td><td></td></tr><tr><td>Polyester ağ</td><td>McMaster-Carr</td><td>93185T17</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Besin Karışımı F-10 HAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6908</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Dispase-2</td><td>Roche Group</td><td>10295825001</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaz 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>46H8863</td><td></td></tr><tr><td>Temel Fibroblast Büyüme Faktörü</td><td>Promega Corp.</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>150 mm doku kültürü kapları</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>0.05% (1X) Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>1X Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>7.5% NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyucuklu plakalar</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik Tüp</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik Tüp</td><td>BD Biosciences</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m filtre</td><td>Nalge Nunc international</td><td>194-2520</td><td></td></tr></tbody></table>

mİyojen engineered doku oluşturur imalatı

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Elektronik kalp pili olduğu gerçeğine rağmen yaşam tasarruf tıbbi cihazlar, pediatrik hastalarda uzun süreli performans bir çocuğun, küçük boyutları ve onların kaçınılmaz büyüme dayattığı kısıtlamaları sorunlu nedeniyle olabilir. Sonuç olarak, kalp ritmi bozuklukları olan pediatrik hastalar için özel olarak tasarlanmış yenilikçi tedaviler için gerçek bir ihtiyaç vardır. Önerdiğimiz içeren bir kolajen bazlı matris oluşan iletken bir biyolojik alternatif hücreler daha iyi, daha büyümeye uyum tekrarlayan ameliyatlar için ihtiyacını azaltır ve büyük ölçüde bu hastalar için yaşam kalitesini artırmak autologously-türetilmiştir. Bu çalışmada, biz moda hidrojel bir matriks içinde kalbin üst ve alt odacıkları arasındaki bir elektrik iletkeni olarak hizmet verecek bir cerrahi implant doku birincil iskelet myoblast hücre kültürleri birleştiren bir yapı için bir prosedür açıklanmaktadır. Sonuçta, biz, tam kalp bloğu olan çocuklar atriyoventriküler elektrik iletim geri yüklemek için bu tür mühendislik doku kullanarak tahmin ediyoruz. Bunun görünümünde matür, yenidoğan Lewis sıçan ve plaka kurulan protokolleri değiştirilmiş bir sürümünü kullanarak laminin kaplı doku kültürü yemekleri üzerine iskelet kasları izole<sup&gt; [2, 3]</sup&gt;. 1-2 gün sonra, kültür hücreleri, antibiyotik ile tip 1 kollajen, Matrigel ™, ve NaHCO toplanır ve karıştırılır<sub&gt; 3</sub&gt;. Sonucu hemen hemen her şekil ve büyüklükte bir kalıp içine dökme edilebilir bir viskoz, düzgün bir çözüm<sup&gt; [1, 4, 5]</sup&gt;. Doku yapıları, tip 1 kollajen standart prosedürler kullanarak fetal kuzu derisi izole istihdam<sup&gt; [6]</sup&gt;. Sonra doku, 37 katılaşmış ° C, yapı suya kadar kültür ortamı dikkatle plaka eklenir. Mühendislik doku daha sonra bunun için hazır olduğunu ve bu noktada, 2 gün daha dehidratasyon ile daha fazla yoğunlaşmaya izin verilir<em&gt; In vitro</em&gt; Değerlendirme veya cerrahi implantasyon.

Burada, kolajen doku, iskelet matür içeren yapıları imalatı göstermektedir. Bu 3-D mühendislik yapıları dokuların değiştirmek veya onarmak için kullanılan olabilir<em&gt; In vivo</em&gt;. Bizim amaçlarımız için, atriyoventriküler tam kalp bloğu tamiri için bir elektrik iletkeni olarak tasarladık<sup&gt; [1]</sup&gt;.

MİYOJEN Engineered Doku oluşturur imalatı

Elektronik kalp pillerinin hayat kurtaran tıbbi cihazlar olmasına rağmen, pediyatrik hastalarda uzun süreli performansları ... nedeniyle sorunlu olabilmektedir.

Bu prosedür, Neonatal Lewis Wraths'tan iskelet kası dokusunun hasadı ile başlar. Bu dokudan miyoblast hücrelerini izole ederiz. Bu miyoblastlar, doku kültürü kaplarında iki gün boyunca kültüre edilir, ardından hasat edilerek kolajen tabanlı bir doku konstrükt karışımına eklenir.Bu karışım, kültür ortamına batırılmış bir kalıba dikkatlice pipetlenir ve 37 °C'de inkübe edilir. Merhaba, ben Boston Çocuk Hastanesi ve Harvard Tıp Fakültesi Anesteziyoloji Bölümü'ndeki Douglas Cowan laboratuvarından Christina Pesach. Bugün size miyojenik mühendislik dokusu oluşturma prosedürünü göstereceğiz.Kalbe yerleştirmek üzere mühendislik ürünü bir doku üretmek için bu prosedürü kullanıyoruz. Amacımız, tam kalp bloğu olan çocuklarda kalp pili implantasyonuna alternatif bir tedavi olarak, kalbin üst ve alt odacıkları arasında elektriksel bir bağlantı oluşturmaktır. Öyleyse başlayalım.Yapıda, cerrahi olarak implante edilebilir kolajen bazlı doku konstrüktüne form vermek için döküm kalıbı kullanılır. Bu videoda, iskelet miyoblastları içeren mühendislik ürünü doku konstrüktlerinin oluşturulma süreci ek bir videoda açıklanmaktadır. Bu protokolde hazırlanan hücreleştirilmiş dokunun kardiyak implantasyonu gösterilmektedir.Bir doku kalıbı, dokunun tasarlandığı her türlü kalbin fizyolojik gereksinimlerini karşılamak için neredeyse her şekil veya boyutta yapılabilir. Bu gösterimde kalıp, yetişkin bir sıçan kalbinin AV oluğuna sığacak şekilde dilimlenebilen bir doku parçası oluşturacaktır. Silikon tüplerini jilet kullanarak üç santimetre uzunluğunda parçalar halinde kesip ardından her parçayı boylamasına ikiye bölerek kalıbı oluşturmaya başlayın.Küçük bir parça polyester ağ kesin. Ardından, tüpün en uç kısmının iç tarafına bir damla implant sınıfı RTV silikon yapıştırıcı yerleştirin. Yapıştırıcı kültüre edilmiş hücreler için bir miktar toksik olduğundan, uygulanan yapıştırıcı miktarını minimumda tutmaya çalışın.Küçük bir polyester ağ parçasını silikon yapıştırıcı damlasının üzerine hızla yerleştirin ve tüpün ucuyla hizalayın. Bu, konstrükt tutunması için hafifçe yükseltilmiş ve düz bir yüzey sağlayacaktır. İşlemi tüpün diğer ucu için tekrarlayın.Kalıpların oda sıcaklığında üç gün boyunca kurumasına izin verin. Bu kalıplar esasen tek kullanımlık olduğu için bir seferde 20 ila 30 adet kalıp hazırlamak faydalıdır. Yapıştırıcı tamamen kuruduktan sonra, kalıpları sterilize etmeye yardımcı olmak amacıyla, hazır olan kalıpları ihtiyaç duyulana kadar %70 ethanol ile dolu bir kapta saklayın.Ardından, hücre izolasyonuna hazırlanmak için gerekli tüm çözeltilerin kullanıma hazır olup olmadığını belirleyin. Antibiyotik ve bir fungusit içeren 250 mL 0,2 mikron filtre steril PBS içinde 1 mg laminin ile seyreltilmiş bir laminin çözeltisi hazırlayın.Ardından, 150 milimetrelik doku kültürü plakalarını dört mililitre seyreltilmiş laminin çözeltisi ile kaplayın ve kullanmadan önce 37 °C'de en az dört saat inkübe edin. Ayrıca iki başka çözelti daha hazırlanmalıdır: miyoblast medyumu ve iskelet kası sindirim çözeltisi.Formülasyonları için protokolün metin kısmına bakınız. Sindirim tamponunu, 10 mililitrelik bir şırıngaya takılmış 0.2 mikronluk bir filtre disk kullanarak sterilize edin. Sindirim tamponu alikotları eksi 20 derece Celsius'ta saklanabilir.Lewis sıçan batini başına beş mililitre sindirim tamponuna ihtiyaç duyacağınızı öngörün. Gerekli miktardaki doku sindirim tamponunu ve 10 mililitre miyoblast ortamını 37 °C'de inkübe edin. Ardından sıçan yavrularının disseksiyon işlemine geçin.Öncelikle, forseps ve küçük makas kullanarak sakrifiye edilmiş neonatal Lewis sıçanlarından en az bir batın temin edin. Ölü neonatal Lewis sıçanlarının sırt kısmını omurilik boyunca boylu boyunca keserek, deri ve fasya tabakalarını geriye doğru soyup ardından kasları çıkararak paraspinal kasları ayırın. Çıkarılan kasları, buz üzerinde 40 mL 1X HBSS ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.Kas şeritlerinin tüpün dibine çökmesine izin verin ve bir kültür ortamında, steril bir pastör pipeti ile vakum aspirasyonu yaparak sıvının ve kan kalıntılarının çoğunu dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, hasat edilen kas parçalarını 150 milimetrelik bir kültür kabına boşaltın ve kalan sıvıyı mümkün olduğunca aspire edin. İki adet tek kenarlı jilet kullanarak, dokuyu koyu bir macun kıvamına gelene kadar ince ince kıyın.Kas pastası, önceden ısıtılmış sindirim solüsyonu içerisinde sindirilecektir. Sindirim solüsyonunun bir kısmını kas pastasının üzerine dökün ve solüsyon ile kas pastası karışımını yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Üç litrelik Lewis sıçanlarından alınan kasların verimli bir şekilde sindirimi için genellikle 10 mililitrelik pipet kullanarak 10 ila 15 mililitre solüsyon kullanırız.Tüpü sallantılı bir platforma yerleştirin ve 37 °C'de yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe ederek sindirin. Enzimatik sindirim sırasında, doku kabarcık oluşturmadan ara ara triteler. Kablosuz bir pipete takılı 10 mL pipet kullanın.Kas dokusu sıvı hale getirildikten sonra, solüsyonu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Ardından, filtrelenmiş hücreleri oda sıcaklığında, 600 G hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin; bir pastör pipeti ve vakum yardımıyla sıvının mümkün olduğunca tamamını aspire edin ve pelleti 10 mililitre ılık miyoblast besiyeri ile yeniden süspande edin. Fibroblastlar miyoblastlardan daha hızlı yapıştığı için, herhangi bir fibroblastın uzaklaştırılmasına yardımcı olmak amacıyla hücreleri kaplanmamış 150 milimetrelik bir doku kültürü plağında 15 dakika ön ekimleyin.Plakayı, 37 °C'ye ve %5 karbondioksite ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Plakayı inkübatörden çıkarın ve Lamin kaplı kültüre henüz yapışmamış olan hücreleri transfer edin. Bunları, her bir veya iki sıçan yavrusu için bir plak olacak şekilde miyoblast ortamında seyreltin.Hücreler çok yoğun ekilirse, miyotüplere farklılaşırlar. Son olarak, hücrelerin %5 karbondioksit içeren, 37 °C'ye ayarlanmış nemlendirilmiş bir ortamda büyümelerini sağlayın. Bir ila iki günlük inkübasyonun ardından hücreler, doku konstrüktleri şeklinde döküme hazır hale gelecektir.Bir ila iki günlük inkübasyonun ardından, 150 milimetrelik miyoblast doku kültürü plakalarının dördünü inkübatörden çıkarın. Fibroblastların miyoblast popülasyonuna baskın gelmemesi için 48 saatten fazla beklemeyin. Hücrelerdeki besiyerini aspire edin.Ardından, miyoblastları plakadan ayırmak için hücreleri 37 °C'ye ısıtılmış XPBS ile iki kez durulayın; her plakaya dört mililitre ısıtılmış %0,05 trypsine EDTA çözeltisi ekleyin ve plakaları beş dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Miyoblastları kültür kabininde hasat edin ve sıvıyı 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Tüm plakaları durulamak için 10 mililitre miyoblast medyumu kullanın ve bunu santrifüj tüpündeki hücrelerle birleştirin.Hücreleri oda sıcaklığında 600 G'de 10 dakika boyunca pelletleyin ve fazla sıvının mümkün olduğunca fazlasını aspire ederek uzaklaştırın. Ardından miyoblastları 1,4 milliliters miyoblast medyumu içinde yeniden süspanse edin ve buz üzerine yerleştirin. Bir pens yardımıyla, bir konstrükt kalıbını dikkatlice etanol banyosundan çıkarın ve XPBS içine daldırarak iki kez durulayın; kalıbı altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasının boş bir kuyucuğuna yerleştirmeden önce tüm PBS kalıntılarını bir pastör pipeti ile aspire edin.Bu aşamada bir solüsyon hazırlanmalıdır. Aşağıdaki reaktifleri buz üzerinde toplayın. 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.Tip bir kolajen hücreleri; miyoblast ortamı, sodyum bikarbonat ve jel içerisinde yeniden süspande edilir. Reaktifleri yazılı protokole uygun olarak birleştirin. Karışımı 20 saniye boyunca vorteksleyin; karışım pembe renge dönecektir.Ticari olarak mevcut olan tip bir kolajen çeşitlerinin; karışım, katılaşma ve kıvam üzerinde değişken etkileri olduğununa dikkat edin. Nihai üründe. Çözeltideki kabarcıkları gidermek için tüpü birkaç dakika boyunca buz kovasına geri koyun.Tip bir kolajen ışınlanmamıştır, aksi takdirde jelatinleşmeyecektir. Burada, yumurta derisinden türetilmiş bir ürün kullanıyoruz. Karışım katılaşmadan önce, karışımı kültür plakasındaki kalıba dikkatlice dökün.Her bir kalıba yaklaşık bir mililitre viskoz sıvı konulacaktır. Bu işlem sırasında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Konstrükt kalıplarını içeren plakayı dikkatlice 37 °C inkübatöre aktarın.Karışım katılaştıkça, rengi koyu pembeden açık pembeye dönecektir; kalıp katılaşırken bir miktar miyoblast medyumunu 37 degrees Celsius'ye kadar ısıtın. Yaklaşık yarım saatlik inkübasyonun ardından, her bir doku yapılandırmasını dikkatlice ısıtılmış miyoblast medyumuna daldırın ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Bu protokol düzgün bir şekilde uygulandığında, miyoblast içeren doku yapılandırması in vivo implantasyon veya ileri analizler için hazır hale gelir.İki günlük inkübasyonun ardından, miyojenik bir doku mühendisliği konstrüktünün nasıl üretileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, erken katılaşmayı önlemek için konstrükt çözeltisi için gerekli tüm reaktiflerin buz üzerinde tutulmasının önemli olduğunu unutmayın. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

fabrication-of-myogenic-engineered-tissue-constructs

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Enjektabl bir matris jel decellularized doku hazırlanması ve sıçan miyokardın içine enjekte...

Miyokard Doku Mühendisliği Biyolojik Türetilmiş Enjektabl Malzeme imalatı

Üretimli kas dokusu hastalığı modeli olarak hem de eti için alternatif bir kaynak olarak, rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahiptir. Burada fare miyoblast projenitör hücreleri ve elektrik sinyalleri tarafından uyarılması, bu durumda, bir kas yapısının mühendislik açıklanmaktadır.

Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Hizalanmış miyokard doku nesil klinik açıdan yararlı amaçlar için kök hücre biyolojisi ile ilgili güncel gelişmeleri adapte için önemli bir gerekliliktir. Bu yazıda hücre şekli ve fonksiyonu hassas kontrolü için mikrokontak baskı yaklaşımı açıklar. Kardiyak progenitörler türetilmiş embriyonik kök hücre son derece saf popülasyonlarının kullanarak, biz sonra anizotropik fonksiyonel miyokard doku oluşturur.

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Bu model sistem bir tahribatsız şekilde endojen kolajen (yeniden) organizasyonu gerçek zamanlı çalışma için kullanılabilecek bir miyofibroblast nüfuslu fibrin jel başlar. Bu model sistemi, farklı hücre kaynakları, orta katkı maddeleri ile birlikte kullanılabilir gibi çok ayarlanabilir, ve özel ihtiyaçlarına göre kolay bir şekilde adapte edilebilir.

Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün

Karmaşık dokunun son derece organize yapılarının oluşturulması için, birden fazla materyal ve hücre tipini entegre bir kompozitte bir araya getirmek gerekir.  Bu kombinatoryal tasarım, güçlü bir fibröz matris tabanı içeren iki farklı biyolojik olarak türetilmiş materyal ve yeni damar oluşumunu arttırmak için endotel hücreleri ile organa özgü katmanlı hücre tabakalarını içerir.

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Bu çalışmada, kollajen, düz kas hücreleri ve endotel hücrelerinin doğrudan kültürlenmesi yoluyla canlı vasküler dokuların hızlı bir şekilde üretilmesi için bir teknik sunuyoruz. Ek olarak, tasarlanmış vasküler dokuların mekanik karakterizasyonu için yeni bir protokol tanımlanmıştır.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Bugüne kadar, kalın doku defektleri tipik olarak otolog doku flepleri veya mühendislik dokuları uygulanarak yeniden yapılandırılır. Bu protokolde, otolog fleplerin yerine geçecek şekilde otolog pediküllü vaskülarize doku flebi mühendisliği için yeni bir yöntem sunuyoruz.

Engineered Vaskülarize Muscle Flap

Bu iletişim kuralı kendi kendine monte doku yüzük değişken boyutları kullanarak özelleştirilmiş bir 3D Baskılı Plastik kalıp imalatı için bir platform açıklar. PDMS negatifleri 3D baskılı kalıp içinde tedavi; o zaman özel içinde tedavi PDMS negatif atıldı. Hücreleri nerede doku yüzük içine toplamak elde edilen özel kuyu içine numaralı seribaşı.

Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Bu makalede, 3D insan iskelet kas mikrotleri dizileri ve kas gücü ve kalsiyum elleçleme analizleri de dahil olmak üzere minimal invaziv aşağı akış in situ fonksiyon tahlilleri üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan İskelet Kas Mikrotissularında İskelet Kas Sağlığının Fonksiyonel Ölçümlerinin Değerlendirilmesi

İnsan mühendisliği iskelet kası dokusu ve optogenetik motonöronlar kullanarak nöromüsküler kavşak fonksiyonunu karakterize etmek için tekrarlanabilir, otomatik ve tarafsız bir görüntüleme sistemi tanımladık. Bu sistem, zaman içinde nöromüsküler bağlantının fonksiyonel olarak ölçülmesine izin verir ve nörotoksinlerin ve myastenia gravis hasta serumunun neden olduğu azalmış nöromüsküler fonksiyonu tespit eder.

İnsan Nöromüsküler Kavşağının Optogenetik Modelinin Mühendisliği ve Karakterizasyonu

Bu protokol, 3D mühendislik ürünü kalp ve iskelet kası dokularının oluşturulması için yöntemler sağlar ve klinik öncesi ilaç tarama modalitelerinde kullanımlarını açıklar. Açıklanan yöntemler, 24 dokunun paralel olarak eşzamanlı olarak değerlendirilmesini kolaylaştırmak için manyetik bir algılama sistemi kullanır.

Ölçeklenebilir 3D Mühendislik Kas Dokularında Preklinik İlaç Testi

Öğrenin, iskelet kası myoblastları içeren kollajen bazlı doku yapılarının üretimini ve kalp bloğu onarımı için elektriksel iletken olarak kullanımını. Bu yöntem rejeneratif tıpta uygulama potansiyeli sunar.

MİYOJEN Engineered Doku oluşturur imalatı

Daha fazla video keşfet