Name: Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Öğrenin, Langendorff perfüze sıçan kalplerde optik haritalama yöntemiyle yüksek çözünürlüklü aksiyon potansiyeli görüntülemeyi. Bu teknik, kardiyak yüzeydeki elektriksel aktivite yayılımını detaylı incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ve Boston Çocuk Hastanesi&#39;nden Kalp İletim Fonu katkılar; Bu çalışma, araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (HL088206 HL068915) tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1: hazırlayın çözümleri ve izole perfüze kalp sistemi <ol><li> [5, 6] açıklandığı gibi deney sabahı, Krebs-Henseleit çözüm 4.0 L hazırlanmıştır. </li><li> 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (DGM) 1.0 L adım 1.1 'de hazırlanan perfüzat dekante Krebs-Henseleit çözüm çözülür. </li><li> Krebs-Henseleit ek bir 150 ml, adım 1.1 'de hazırlanan perfüzat kaldırılır ve 5 Mol / L di-8-ANEPPS (dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözünmüş 10 mmol / L stok seyreltilmiş) ile karıştırılır. </li><li> % 5 CO 2 gaz Bu 3 çözümler su-ceketli cam rezervuarlar (Radnoti) 41,0 ° C önceden ısınmış ve% 95 O 2 mikron filtreden 0.2 kullanarak bir batık bubbler (Radnoti) ile oksijenli aktarılır. 3 stok rezervuarları Çözümleri MASTERFLEX ™ L / S peristaltik pompalar ve düşük emme silikon tüp (Cole-Parmer) ile duvara monte Langendorff sistemine pompalanır. </li><li> Montaj öncesinde Langendorff sistem cam (Radnoti) titizlikle E-TOXA TEMİZ reaktif (Sigma-Aldrich) ile yıkanmış ve 0.1 M / L HCl,% 100 etanol ve saf su ile iyice durulanmalıdır. </li><li> Sirkülasyon olmayan Langendorff aparat, 3 ayrı su ceketli ısıtma bobinleri ve kabarcık tuzakları ile kalp ayrılır oksijenli depoları, 70 mmHg sabit basınç sağlamak için inşa edilmiştir (Radnoti) [7] . 3 bağımsız perfüzyon hatları 1.1 - 1.3 için adımları hazırlanan çözümler teslim bize tam kontrol etmeye izin veren, 3-yollu iki stopcocks kalp üzerinde birleşir. Su ceketli cam MASTERFLEX PharMed BPT boru (Cole-Parmer) ile seri olarak bağlı ve 39 ısındı ° C distile su kullanarak iki E100 sirkülatörler (Lauda). Isıtma bobinleri ve kabarcık tuzakları basınç baş rezervuarları bağlayan platin kurutulmuş silikon tüp (Cole-Parmer) yoluyla ısı kaybı, 37 ° C perfüzat kalp ulaşan sonuçlandı. </li></ol> Bölüm 2: Hasat sıçan kalp ve set-up Langendorff perfüzyon <ol><li> 200-250 g Lewis sıçanlarda derin genel anestezi uygulamak için, 100 mg / kg Ketamin ve 10 mg / kg Xylazine intraperitoneal boşluğuna enjekte edilir. Bu karışımı, biz eksplantasyonu işlemi sırasında kan pıhtılaşması ve miyokard iskemisi önlemek için 500 U / kg Heparin ekleyin. </li><li> Kalp ve büyük damarların kolay erişim için, göğüs ön duvarı kaldırılır. Bundan sonra, çevredeki doku dikkatlice disseke ve perikardiyal çuval açıldı. </li><li> Inferior vena kava belirlenmesini takiben, bu gemi, 5-0 ipek (Ethicon) ve tüm kalp-akciğer bloğu eksplante ile bağlandı. Doku hemen buz 50 ml beher bulunan buz Krebs-Henseleit çözüm yerleştirilir. </li><li> Asendan aorta hızla tespit ve çevresindeki doku disseke edilir. Uygun ölçekli bir kanül (Harvard Apparatus), çok ileri aort kökü içine kanül takarak, koroner arter zorunlu perfüzyon kesilmesini önlemek için özen, aort içine yerleştirilir. Kanül 5-0 ipek (Ethicon) ile çıkan aortun güvence altına alınmıştır. </li><li> Sıçan kalp sonra kanül içine hava kabarcıklarının tanıtan Langendorff aparat yerleştirilir. Retrograd koroner arter perfüzyon şimdi adım 1.6 'da açıklanan basınç kafa sıcak, oksijenli Krebs-Henseleit çözümü ile kurulmuştur. </li><li> Ekstra doku, akciğerler dahil olmak üzere şimdi kaldırılır ve kalp fonksiyonu kurtarma izni ve ritmini istikrara kavuşturmak için 20 dakika boyunca perfüze. Bu süre zarfında, çok ince bir termokupl sıcaklık probu (Cole-Parmer) sol ventrikül boşluğuna tanıtıldı ve 5-0 Prolen sütür (Ethicon) ile de sütüre. Prob kalbin sıcaklığını sağlamak için bir termo-denetleyici (Digi-Sense) bağlı 37 muhafaza ° C su dolaşım pompalarının ayarlarını. Kalp ucundan damlayan perfüzat Hareket atık priz bir gazlı bez parçası koyarak en aza indirilmiştir. </li></ol> Bölüm 3: potansiyometrik boya ile Yük kalp ve elektrografik ve optik sinyalleri elde <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) içeren Krebs-Henseleit karışık bir stopcock kullanarak floresan boya ile perfüzyon hattına geçiş yaparak kalp yüklenir. Buna ek olarak, 18G kanül yeterince koroner arterler yoluyla getirilen boya ile perfüze değildir çünkü yavaş yavaş bu odaların her birine uygulanan boya çözüm sol ve / veya sağ atrium ve ek 50 ml yerleştirilir. </li><li> Yükleme işlemi sırasında, 3 EKG yol açar (Harvard Apparatus) haritalama için kullanılan optik karşı karşıya değiliz kalbin yüzeyine hafifçe yerleştirilir. Elektrot N o 1, arka sol ventrikül apikal kısmının, K sol atrium o 2 ve N tarafta konumlandırılmış <su> (Şekil 1) aort kökü bir referans elektrot olarak p&gt; o 3. Atriyal ve ventriküler elektrografik sinyaller, daha sonra amplifiye sayısallaştırılmış ve yazılım (RedShirt Görüntüleme) (Şekil 2) kullanarak optik sinyallerin yanında görüntülenir. Bir osiloskop (Tektronix modeli TDS 1002), aynı zamanda gerçek zamanlı olarak yüzey EKG s görselleştirmek için ve yeterli pacemaker sağlamak için kullanılır. </su></li><li> EKG amplifikatör (Hugo Sachs Elektronik) ayarları: High Pass Filtre: 0.1 Hz Alçak Geçiren Filtre: 150 Hz </li><li> CMOS kamera (RedShirt Görüntüleme) ve Makroskop'ta kalbin yüzeyine odak ve satın çerçeve merkezli böylece XYZ ayarlamalarını kullanarak konumlandırılmış. Rezonans frekansları en aza indirmek için bir titreşim izolasyonu tablosu (Eksi K Teknolojisi) kamera ve optik üzerine monte edilir. Aynı zamanda, bir koaksiyel pacing elektrod (Harvard Apparatus), izole, S48 elektrik stimülasyon birimi (Çim) ile kontrol sağ atriyuma yerleştirilen ve kalp dakikada 300 vuruş (Şekil 1) tempolu. </li><li> Elektrik stimülasyon (Çim) ayarları: Hızı: saniyede 5 bakliyat Gecikme: 0,2 ms Süresi: 2 ms Volt: 6-12 V Modu: Tekrarla Nabız: Tek </li><li> Daralma hareket eserler eksikliği optik kayıtları, kalp elektromekanik Kuplajsız gerekir. Biz yine 11 mmol / L BDM içeren Krebs-Henseleit çözüm perfüzyon hatları geçiş yaparak bunu. Satın almalar arasında, kalp hazırlık canlılığı korumaya yardımcı olmak için katkısız Krebs-Henseleit ile perfüze. </li><li> Aşağıdaki satın alma ayarları ile yazılım (RedShirt Imaging) kullanarak kayıt parametreleri ayarlanır: Yapılandırma: 2.000 Hz, 128x128 piksel Kare Aralığı: 0.5 ms Kamera Amplifikatör Kazanç: 5x On-Chip Kazanç: 8x-12Me-kuyu Perde Hızı: 500 ms gecikme Çerçeveler sayısı: 4000 Süre: 2000 ms </li><li> Tüm oda ve ekipman ışıkları kapalı ya da kayıt sırasında arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için korumalı. LED ışık fotoğraf ağartma ve boya toksisite azaltmak için optik kayıt sırasında sadece kalp yanar. Işık kaynağı, perde, kontrol paneli üzerinden bilgisayara D-A kurulu (RedShirt Görüntüleme) yolu ile teslim bir 5 V darbesi ile kontrol edilir. </li></ol> Bölüm 4: RedShirt Görüntüleme Yazılımı kullanarak satın alma bilgileri analiz <ol><li> Satın alınmasının ardından, veri, farklı filtre ayarları kullanarak işlenir. Biz genellikle Band / Durdur, 44.0 sol sınır ve sağ sınır 98,0 az filtre, pas ayarlarken dışında varsayılan ayarları kullanabilirsiniz. Daha sonra kaydedilen bilgiler işlenir ve bir film (RedShirt Görüntüleme) oluşturulur. </li><li> Bir satın alma elde edilen veriler, 2 saniyelik bir süre içinde kalp yüzeyinde 16.384 siteleri yerel elektrik aktivasyonu için karşılık gelir. Yazılım, bu yerel sinyaller doğrudan birbirleri ile ve atriyal ve ventriküler elektrografik kayıtları ile karşılaştırılmasına olanak tanır. Veri sonra renk yerel elektrik aktivasyon haritalama ve kalp yüzeyinde uzaysal elektrik aktivasyonu gösteren bir animasyon olarak bu bilgileri işleme ile görünür. Böyle bir animasyon oluşturmak için, biz için yazılım kullanabilirsiniz: <ul><li> zamansal ve / veya mekansal verilere filtre </li><li> animasyon için bir başlangıç ​​ve bitiş zamanı seçin </li><li> her pikselin dinlenme ışık yoğunluğuna göre renk haritası optik sinyalleri </li><li> kalp resmi ile ortaya çıkan renk veri bindirme </li><li> animasyon oluşturmak </li></ul></li></ol> Bölüm 5: Temsilci sonuçları Perfüze kalp hazırlanması kayıt sırasında hareketsiz ise, optik sinyalleri di-8-ANEPPS emisyon yoğunluğu değişikliği dahil her piksel için ayrı zirve göstermektedir. Ilgili filmleri (Şekil 3 ve 4), kalp gibi aynı anda alınan elektrografik kayıtları (Şekil 2) epikardiyal yüzeyi boyunca yayılan bir eksitasyon dalga ön göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Kardiyak pacing çalışması için Langendorff kalp kurulum şeması, numaralandırılmış bileşenleri vurgulayarak." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Langendorff-perfüze kalp hazırlık bir fotoğraf, sağ atrium pacing elektrot pozisyonları resmeden ve EKG adım 3.2 'de açıklandığı gibi açar . <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Sinyalli biyolojik süreç diyagramı; Floresan mikroskobu sonuçlarının veri analizi." border="0" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2, perfüze Lewis sıçan kalbinde Temsilcisi optik sinyalleri ve elektrografik kayıtları . Panel A epikardiyal yüzeyi optik görüntüleme için kullanılan bir görüntü gösterir. B Paneli zamanla floresans emisyon değişiklik göstermek üzere seçilen piksel konumunu renkli oklarla gösterilir. Panel C Elektrografik sinyalleri belirten atriyal aktivasyon ve ventriküler sinyale karşılık gelen açık mavi çizgi kırmızı çizgi ile gösterilmiştir. Lütfenve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "&gt;, bu rakamın büyük bir halini görmek için buraya tıklayın .

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

Boston Çocuk Hastanesi&#39;nden Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Miyokard iskemisi önlemek için anestezi uygulanmış sıçanlarda kalp kaldırılması hızla yapılmalıdır. Iskemi veya yetersiz koroner perfüzyon oluşursa, kalp büyük olasılıkla aritmiler geliştirmek ve enfarkte olabilir. Ayrıca, bu kalpleri bilgilendirici kayıtları ve daha sonraki analizler için yeterli floresan emisyon gösterecektir. Boya yüklemeden önce, miyokard hücrelerinin elektriksel impulsları istikrar için bir fizyolojik elektrolit ortam kurmak ve sürdürmek için yeterli Krebs-Henseleit solüsyonu ile perfüze gerekir. P...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>Ekipman</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CardioPlex Yazılımı</td><td>Ekipman</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUXEON LED Işık Kaynağı 460-490 nm </td><td>Ekipman</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>ECG Amplifikatörü Tip 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>Ekipman</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>Dikroik Ayna 505 nm</td><td>Ekipman</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emisyon Filtresi 605 nm Uzun Geçişli</td><td>Ekipman</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT Yan</td><td>Ekipman</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>Mini Küresel Mafsal Tutucu</td><td>Ekipman</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>Küçük Stimülasyon Elektrot Seti</td><td>Ekipman</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>BM-6 Masaüstü Titreşim İzole Platformu</td><td>Ekipman</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>Monopolar ECG Elektrodu</td><td>Ekipman</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>Roller Pompa SCI 400</td><td>Ekipman</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>Roller Pompa MasterFlex Easy Load II</td><td>Ekipman</td><td>Cole-Parmer</td><td>Model 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>Marprene Hortum #14</td><td>Ekipman</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Hortum</td><td>Ekipman</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>S48 Kare Dalga Stimülatörü</td><td>Ekipman</td><td>Grass Technologies</td><td>Model S48</td><td></td></tr><tr><td>SIU5 RF TRANSFORMATÖR İZOLASYON ÜNİTESİ</td><td>Ekipman</td><td>Grass Technologies</td><td>Model SIU5</td><td></td></tr><tr><td>5 Litre Su Ceketli Rezervuar</td><td>Ekipman</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>2 Litre Su Ceketli Rezervuar</td><td>Ekipman</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>0,5 Litre Su Ceketli Rezervuar</td><td>Ekipman</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>0,25 Litre Su Ceketli Rezervuar</td><td>Ekipman</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Isıtma Spirali</td><td>Ekipman</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Kompilans Hava Kabarcığı Tuzağı</td><td>Ekipman</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Luer Bağlantısız Kanül</td><td>Ekipman</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>3 Yollu musluk, FLL'den MLT'ye, Port Kapaksız</td><td>Ekipman</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>Termokupl Termometre</td><td>Ekipman</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultra İnce IT-Serisi Esnek Mikroprob </td><td>Ekipman</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>Osiloskop Tektronix TDS 1002</td><td>Ekipman</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butandion monoksim</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin HCl</td><td>Reaktif</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Reaktif</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

langendorff perfüze sıçan kalpler optik haritalama

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Voltaj duyarlı floresan boya ile kalp yüzey Optik haritalama deneysel modellerde elektrik uyarım araştırmak için önemli bir araç haline geldiğini hücre kültürleri bütün organları ölçek aralığı<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Normal kalp ritmi sırasında veya aritmi başlaması ve bakım boyunca state-of-the-art optik görüntüleme sistemleri, üretim ve aksiyon potansiyelleri yayılmasını neredeyse anında görüntülenmiştir.<sup&gt; [1]</sup&gt;. Piyasada bulunan en son sistemleri, son derece yüksek uzaysal çözünürlüklerde bilgi sağlayabilir ve daha geleneksel elektrofizyolojik yöntemler dayattığı engelleri aşmak için başlangıçta geliştirilmiş özel tasarlanmis ekipmanlar dayalı<sup&gt; [1]</sup&gt;. Yüksek çözünürlüklü ve yüksek hızda tamamlayıcı metal oksit yarı iletkeni (CMOS) kameralar ve yoğun bir şekilde parlak ışık yayan diyot (LED) yanı sıra voltaj duyarlı boyalar, optik, ve filtreler Gelişmeleri elektrik sinyal alımı yapmaya başladı mikroskopları ile çalışmak için daha alışkın kardiyovasküler hücre biyologlar için pratik. CMOS kameraların en yeni nesil numune hazırlama türüne bağlı olarak 16.384 piksel saniyede 10.000 kare, edinebilirler rağmen, fotodiyot diziler, lazer tarama sistemleri ve soğutmalı olarak köklü floresan satın alma teknolojileri şarj çiftli aygıt (CCD dinamik aralık saygı, sinyal-gürültü oranı) kameralar hala bazı belirgin avantajları vardır ve kuantum verimliliği<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. Bu çalışmada, Lewis sıçan kalpleri perfüze edildi<em&gt; Ex vivo</em&gt; 37 kristalloid perfüzat (Krebs-Henseleit çözüm) ° C değiştirilmiş bir Langendorff aparat. 20 dakikalık bir istikrar döneminden sonra, kalpler aralıklı görüntü alımı sırasında kasılması ile ilişkili hareket ortadan kaldırmak için 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime ile perfüze edildi. Optik haritalama için, hızlı tepki potansiyometrik prob di-8-ANEPPS kalpleri yüklenir<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) ve kısa bir süre 475 ± 15 nm uyarma ışığı ile hazırlık aydınlattı. &gt; Kalp hazırlık yayılan 605 nm ışık, aydınlatma tipik bir 2 ikinci dönemde yatay bir Makroskop&#39;ta bağlı bir yüksek hızda CMOS kamera ile görüntülendi. Bu gösteri için, kupa, izole edilmiş bir elektrik stimülasyonu ünitesine bağlı bir koaksiyel elektrot ile dakikada 300 atım tempolu. Eşzamanlı bipolar elektrografik kayıtları kolay kullanılabilen yazılım kullanarak gerilim sinyalleri ile birlikte satın alındı ​​ve analiz edildi. Bu şekilde, Langendorff perfüze sıçan kalpleri yüzeyinde aksiyon potansiyelleri görüntülenebilmekte ve elektrografik sinyalleri ile kayıtlı olabilir.

Bu makale, potansiyometrik boya kullanarak (di-8-ANEPPS) Langendorff perfüze sıçan kalpleri yüzeyinde optik görüntü aksiyon potansiyeli hareketi yüksek bir zamansal ve mekansal çözünürlükte tekniği açıklar.

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Voltaj duyarlı floresan boyalarla kalp yüzeyinin optik haritalaması, ... içindeki elektriksel uyarılmayı incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir.

Merhaba, ben Çocuk Hastanesi ve Howard Tıp Fakültesi Anesteziyoloji Bölümü'ndeki Dr. Cohen'in laboratuvarından Yon Ziv. Bugün, Lal perfüze kırmızı kalplerde optik haritalama prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, kalp yüzeyindeki elektriksel aktivitenin yayılımını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Deney sabahında, dört litre Krebs Hensel light solüsyonu hazırlayın. Solüsyonu karıştırdıktan sonra, vakum filtrasyonu kullanarak çözünmemiş partikülleri 200 mikronluk bir filtre ile temizleyin.İlk olarak, 11 milimol BDM'yi çözmek için hazırlanan bir litre Krebs Henzel lite çözeltisini kullanın. İkinci olarak, 100 mililitre daha Krebs Henzel lite alın ve çözeltide beş µM D eight annex nihai konsantrasyonu elde edecek şekilde DMSO içinde 10 milimolar D eight NFS karıştırın. Burada kullanılan su ceketli cam rezervuarlar, köpürtücü ve cam malzemelerin tamamı red.Naughty markadır.İki solüsyonu 41 °C'ye önceden ısıtılmış rezervuarlara aktarın. Solüsyonları, daldırma tipi bir kabarcık pompası kullanarak 0,2 µm filtrelenmiş gazla oksijenleyin; solüsyonları üç stok rezervuarından, peristaltik pompalar ve düşük absorbsiyonlu silikon tüpler aracılığıyla duvara monte Ling Endorf sistemi üzerinden geçirerek sıçan kalbini hasat edin. İlk olarak, derin genel anesteziyi sağlamak için 200 ila 250 gram ağırlığındaki bir Lewis sıçanına intraperitonal olarak ketamin ve ksilazin, açıklama sırasında kan koagülasyonunu ve miyokardiyal iskemiyle önlemek için ise heparin enjekte edin.Sıçan tamamen anestezi altındayken ve ayak parmağı sıkıştırmasına yanıt vermediğinde, kalbi çıkarma işlemine geçin. Kalbe ve büyük damarlara kolayca erişebilmek için öncelikle ön göğüs duvarını kaldırarak cerrahiye başlayın. Ardından çevredeki dokuları dikkatlice diseke edin ve perikardiyal keseyi açın.Vena cava inferior tanımlandıktan sonra, bu damarı beş adet O Proline sütür ile bağlayın ve kalp-akciğer bloğunun tamamını çıkarın. Dokuyu derhal buz üzerinde, 50 mililitrelik bir beher içindeki buz soğukluğundaki Krebs Henzel light çözeltisine yerleştirin; asendens aortu hızla belirleyin ve çevredeki dokulardan ayırın. Aorta uygun boyutta bir kanül yerleştirin.Kanülün aort köküne çok derin yerleştirilmemesine ve koroner arterlerin zorunlu perfüzyonunun kesilmemesine dikkat edin. Kanülü asendan aortaya sabitleyin. Ardından, kanüle hava kabarcığı girmemesine özen göstererek sıçan kalbini Ling Endorf aparatına yerleştirin.Sıcak oksijenlendirilmiş Krebs Hensel lite solüsyonu ile retrograd koroner vasküler perfüzyon kurulmuştur. Ling Endorf düzeneğinin basınç başlığından, temizleme işleminden sonra akciğerler dahil olmak üzere fazla dokuları uzaklaştırın; fonksiyonların geri kazanılmasına izin vermek için kalbi 20 dakika boyunca perfüze edin ve perfüzyon sırasında ritmi stabilize edin. Sol ventrikül boşluğuna çok ince bir termokupl sıcaklık probu yerleştirin.Probu beş adet 5-0 prolene sütür ile yerine dikin ve kalbin sıcaklığını korumak için su dolaşım pompalarının ayarlarını düzenleyin. 37 °C'de, kalp apeksinden damlayan Perfuse eight kaynaklı hareketi minimize edin. Efllüen haznesine bir parça gazlı bez yerleştirerek kalp, elektrografik ve optik sinyaller elde etmek amacıyla potansiyometrik boya ile yüklenmeye hazır hale getirilir; potansiyometrik boya dye eight NEP'leri kalbe yükleyin.Krebs çözeltisi, dolayısıyla floresan boya ile karıştırılmış ışık içeren perfüzyon hattına geçiş yapın. Atriyumlar, koroner arterler yoluyla verilen boya ile yeterince perfüze edilmediği için, sol ve/veya sağ atriyuma 18 gauge bir kanül yerleştirilir. Ardından, bu odacıkların her birine yavaşça ek 50 mililitre boya çözeltisi uygulanır.Yükleme prosedürü sırasında, kalbin yüzeyine üç ECG lead'ini nazikçe yerleştirin. Bunlar, haritalama için kullanılan optiklere bakmamalıdır. İlk elektrot, sol ventrikülün posterior apikal kısmına yerleştirilir.İkincisi sol atriyuma yerleştirilir ve üçüncüsü aort kökünde referans elektrot olarak görev yapar. Atriyal ve ventriküler elektrografik sinyaller daha sonra yükseltilir, dijitalleştirilir ve yazılım kullanılarak optik sinyaller şeklinde görüntülenir. Yüzey ECG'lerini gerçek zamanlı olarak görselleştirmek ve yeterli pacing'i sağlamak için bir osiloskop da kullanılır.EKG amplifikatörünü yüksek geçiren filtre için 0,1 hertz ve alçak geçiren filtre için 150 hertz değerine ayarlayın; CMOS kamerayı X, Y, Z ayarlarını kullanarak konumlandırın. Kameranın odak düzleminde yer alan bir cam parçası, ilgilenilen alan odakta ve görüntüleme çerçevesinin merkezinde olacak şekilde kalbin yüzeyine yerleştirilir. Rezonans frekanslarını minimize etmek için kamera ve optikler bir titreşim izolasyon masasına monte edilmiştir.Aynı anda sağ atrium üzerine, izole bir S 48 elektriksel stimülasyon ünitesi ile kontrol edilen koaksiyel bir pacing elektrodu yerleştirin. Bu, kalbin dakikada 300 atım hızında pacing yapmasını sağlayacaktır; elektriksel stimülasyonu aşağıdaki şekilde ayarlayın.Hız saniyede beş pals, gecikme 0.2 milisaniye, stimülasyon süresi iki milisaniye, şiddet 6 ila 12 volt olmalı ve mod "repeat" (tekrar) ile "single pulse" (tek pals) olarak ayarlanmalıdır. Kasılmadan kaynaklanan hareket artefaktlarının olmadığı optik kayıtlar için kalbin elektromekanik olarak ayrıştırılması gerekir. Bunu, perfüzyon hatlarını tekrar 11 milimolar BDM içeren Krebs Hensel çözeltisine geçirerek gerçekleştirin.Kayıtlar arasında, preparasyonun canlılığını korumaya yardımcı olmak için kalbi saflaştırılmış Krebs HENSEL solüsyonu ile perfüze edin. Yazılım kayıt parametrelerini 2000 hertz ve 1 28 x 1 28 piksellik bir dizi şeklinde yapılandırın.Kare aralığı 0,5 milisaniyeye, kazançlar ise kamera amplifikatörü için beş x ve on-chip kazanç için sekiz x olarak ayarlanmalıdır. On-chip kazanç ayrıca 12'ye ayarlanmalıdır. Yazılımın kamera kontrolünü 500 milisaniyelik bir perde gecikmesine ayarlayın ve 2000 milisaniye süresince 4.000 kare kaydedin.Kayıt sırasında arka plan gürültüsünü önlemek için tüm oda ve ekipman ışıklarını kapatın veya perdeleyin; LED ışığı kalbi yalnızca optik kayıt sırasında aydınlatır. Fotoblancıng'i (fotobeyazlamayı) ve boya toksisitesini azaltmak için, ışık kaynağı panjurunu, bilgisayardaki bir D iki A kartı aracılığıyla kontrol paneli üzerinden gönderilen beş voltluk bir darbe ile kontrol edin. Verileri farklı filtre ayarları kullanarak işleyin.Band stop geçirme filtresinin ayarlanması dışında genellikle varsayılan ayarlar kullanılır; bu filtre için sol sınır 44.0 ve sağ sınır 98.0 olarak ayarlanır. Ardından, kaydedilen bilgiler işlenir ve bir film oluşturmak için kullanılır. Tek bir veri toplama işlemi, iki saniyelik bir süre boyunca kalp yüzeyindeki 16.384 noktadaki yerel elektriksel aktivasyona karşılık gelir.Yazılım, yerel elektriksel aktivasyonu renklere eşleyerek bu yerel sinyallerin birbirleriyle vele atrial ile ventriküler elektrografik kayıt verileriyle doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır ve bu bilgileri, kalp yüzeyindeki spasyotemporal elektriksel aktivasyonu gösteren bir animasyon olarak sunar. Böyle bir animasyon oluşturmak için önce, verileri zamansal ve/veya mekansal olarak filtrelemek üzere yazılımı kullanın. Ardından, animasyon için bir başlangıç ve bitiş zamanı seçin.Üçüncü olarak, her pikselin dinlenme ışık yoğunluğuna göre optik sinyalleri renklere eşleyin. Dördüncü olarak, sonuçlanan renk verilerini kalbin bir fotoğrafı üzerine bindirin ve son olarak, perfüze kalp preparatı kayıt sırasında hareketsizse animasyonu oluşturun. Kayıt sırasında optik sinyaller, D eight anep emisyon yoğunluğundaki değişime dahil olan her piksel için belirgin bir pik gösterir. Bu gerçek zamanlı görüntüleme videoları, kalbin epikardiyal yüzeyi boyunca yayılan bir eksitasyon dalga cephesini ve aynı anda elde edilen elektrografik kayıtları göstermektedir.Alanor Perfuse Kırmızı Kalp yüzeyindeki aksiyon potansiyeli hareketini optik olarak görüntülemek için yüksek çözünürlüklü bir tekniği az önce gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, kalbin anestezi altındaki kırmızı hayvandan hızlıca çıkarılması önemlidir. Miyokardiyal iskemiyi önlemek için, miyokard hücrelerinin yeterince perfüze edilmesi ve kalbin suye duyarlı boya ile tamamen yüklenmiş olması gerekir.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu rapor, streç bağlı atriyal fibrilasyon sırasında Langendorff perfüze koyun kalp bozulmamış sol atrium elektriksel uyarım eşzamanlı endokardiyal ve epikardiyal optik haritalama metodolojisi ve sonuçları ayrıntılı bir açıklamasını sağlar.

Stretch Bağlı Atriyal Fibrilasyon Koyun Modelinde Yüksek Çözünürlüklü Endokardial ve Epikardiyal Optik Haritalama

Bu makale, panoramik görüntüleme sistemi kullanılarak Langendorff perfüze tavşan kalbinde, optik haritalama deneylerini için temel prosedürleri ve ikili (voltaj ve kalsiyum) görüntüleme yöntemidir.

Çok parametreli Langendorff perfüze Tavşan Kalp Optik Haritalama

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Bu videoda, izole edilmiş bir fare kalbinin Langendorff retrograd perfüzyonunu gerçekleştiriyoruz. İşlem sırasında, kalbin kardiyak aktivitesi, çıkan aorta yerleştirilen bir kanül kullanılarak koroner arterler yoluyla bir perfüzyon solüsyonu ile retrograd olarak perfüze edilerek korunur. Model, kalbin kardiyak patofizyolojisini incelemek için kullanılır.

Langendorff Retrograd Kalp Perfüzyonu: İzole Fare Kalbini Perfüze Etmek İçin Ex Vivo Bir Teknik

İzole sıçan kalbi, iskemi reperfüzyon hasarı için kalıcı bir modeldir. Burada, yerinde aort kanülasyonu, kalbin Langendorff perfüzyonu, simüle edilmiş iskemi-reperfüzyon hasarı ve iskemik hakaretin derecesini doğrulamak için enfarktüs boyama yoluyla bir sıçandan atan kalbin çıkarılması sürecini açıklıyoruz.

Langendorff-perfüze sıçan Hearts indüksiyon ve İskemi-reperfüzyon Hasarı Değerlendirilmesi

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Burada, bir yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte, farenin sağ atrium ve özellikle Çin-atriyal düğümden elektriksel aktivitenin optik haritalama için bir protokol mevcut.

Fare Çin-atriyal düğüm yüksek çözünürlüklü optik Haritalama

Bu iletişim kuralı ile yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü, membran gerilim çift kayıtları da dahil olmak üzere bir optik haritalama sistemi kullanan fare Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar ve Ca2 + geçici altında programlanmış stimülasyon özel elektrot kateter aracılığıyla.

Yüksek çözünürlüklü optik eşleştirmenin fare Atria Elektrofizyolojik değerlendirme

Bu çalışmanın amacı, kardiyak dinamiği n çevirisel bir hayvan modeli kullanarak araştırmak için bir yöntem oluşturmaktır. Açıklanan deneysel yaklaşım, izole, bozulmamış bir domuz kalp modelindeki elektriksel aktiviteyi değerlendirmek için elektrofizyolojik bir çalışma ile birlikte çift emisyonlu optokardiografi içerir.

Ex Vivo Langendorff perfüzyonlu Kalplerin Optokardiyografi ve Elektrofizyoloji Çalışmaları

Bu protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip transmembran voltajının ve hücre içi Ca2+ geçici akımlarının elektrofizyolojik ölçümleri de dahil olmak üzere, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardiden etkilenen vahşi tip ve knock-in hayvanlardan elde edilen fare kalplerinin çift boyutlu optik haritalamasını sunar.

Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması

Öğrenin, Langendorff perfüze sıçan kalplerde optik haritalama yöntemiyle yüksek çözünürlüklü aksiyon potansiyeli görüntülemeyi. Bu teknik, kardiyak yüzeydeki elektriksel aktivite yayılımını detaylı incelemek için kullanılır.

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Daha fazla video keşfet