İlköğretim Kültür Hipokampal Nöronlar Yoğun çekirdekli veziküller Canlı Görüntüleme

Canlı hücre görüntüleme, organel trafiğinin dinamikleri incelenirken özellikle yararlıdır. Bu video, kültürlenmiş hipokampal nöronlarda yoğun çekirdekli veziküllerin görüntülenmesinde kullanılan bir prosedürü vurgulayacaktır. Transfeksiyon kompleksleri, ilk olarak D-N-A-M-E-M besiyeri ve lipectomy transfeksiyon reajeninin karıştırılmasıyla elde edilir.

Hipokampal nöronlar, glial bir monotabakaya bakan ters çevrilmiş lameller üzerinde kültüre edildiğinden, bu lamellerin transfeksiyon reaktifiyle temas etmesi için ters çevrilmeleri gerekir. GFP etiketli yoğun çekirdekli veziküler proteinlerin ekspresyonu için yeterli süre beklendikten sonra, bir görüntüleme odası oluşturulur. Kültürlenmiş nöronlardaki yoğun çekirdekli ICAL'ların görüntülemesi, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Bu protokol esnektir ve mitokondri, endozom ve peroksizom gibi diğer organellerin görüntülenmesi için uyarlanabilir. Merhaba, ben Michael Silverman; Simon Fraser Üniversitesi'ndeki hücresel nörobilim laboratuvarıma hoş geldiniz. Bizler, sinir hücrelerinde organellerin nasıl hareket ettiğiyle ilgileniyoruz.

Bu soruyu ele almak için, kültürlenmiş hipokampal nöronlardaki membranlı organelleri, özellikle de yoğun çekirdekli vezikülleri işaretliyoruz. Bunu nasıl yaptığımızı göstermesi için sözü David'e bırakıyorum. Merhaba, ben Silverman laboratuvarından David.

Bugün size geniş alanlı western mikroskobisi kullanarak, yoğun çekirdekli veziküllerin ve kültür nöronlarının canlı hücre görüntülemesi için uygulanan bir prosedürü göstereceğim. Başlayalım. Çoğu deney için, her bir transfeksiyon başına altı santimetrelik kaplarda 250.000 hücre yoğunluğunda kültüre edilmiş sıçan hipokampal nöron kapları kullanıyoruz; biri plazmid DNA için, diğeri ise transfeksiyon reajanı için olmak üzere iki adet 1,5 mililitrelik tüp etiketleyin.

Laminer akışlı kabinde, oda sıcaklığında tek bir tüp içerisinde bir mikrogram plazmit DNA'yı yüz mikrolitre MEM ile birleştirmek için, MEM'in herhangi bir takviye içermediğinden emin olun. Diğer tüpte altı mikrolitre lip'i yüz mikrolitre MEM ile birleştirin. Çift transfeksiyon için de aynı miktar kullanılabilir, ancak bu durumlarda lip DNA oranı yarıya inecektir.

Lipit reaktifinin raf ömrünü korumak için, reaktifleri her zaman buzdolabında veya bir masaüstü soğutucuda saklayın, tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. MEM içindeki DNA karışımını lipit tüpüne aktarın ve APE ile nazikçe karıştırıp oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. 25 dakika sonra, kültüre edilmiş nöronlardaki sitotoksik hasarı minimize etmek için 60 µL 50 mM K neuronic acid ekleyin.

Nöronları, bir GL monotabakasının üzerine asılı duran lamel camların alt yüzeyinde kültüre ettiğimiz için, lamel camları ters çevirmek ve nöronları transfeksiyon solüsyonuna maruz bırakmak gereklidir. Steril pensler kullanarak lamel camları dikkatlice, alt yüzeyleri yukarı gelecek şekilde ters çevirin. Üst üste gelmeyecek şekilde düzenleyin.

Lamelin nöron kaplı yüzeyini veya kabın ggl kaplı yüzeyini kazımamaya dikkat edin. 30 dakikalık inkübasyonun sonunda, altı santimetrelik kaptan yaklaşık 0,5 ml besiyeri alın ve tüpteki DNA ile nazikçe karıştırın. DNA çözeltisini, besiyerinin yüzeyine eşit şekilde damlatarak tekrar kaba aktarın.

Kabı tek bir yönde nazikçe ileri geri kaydırın, ancak besiyerinin şişmediğinden emin olun. Tek bir yönde karıştırdıktan sonra durun ve DNA lipektomi komplekslerinin kap boyunca eşit şekilde dağılması için dik yönde işlemi tekrarlayın. Doku kültürü inkübatöründe 37 °C ve %5 karbon dioksit altında 90 dakika inkübe edin.

İnkübasyon sonrası, lamel setlerini ayak kısımları aşağı gelecek şekilde ters çevirin ve üst üste binmeyecek şekilde düzenleyin. Son olarak, DNA ekspresyonunun istenen süre boyunca (genellikle inkübatörde geceden sabaha kadar veya 48 saat boyunca) gerçekleşmesini sağlayın. Kültürlenmiş hipokampal nöronlardaki GFP etiketli yoğun çekirdekli veziküllerin canlı görüntülemesi, CCD kamera donanımlı bir floresan mikroskobu gerektirir.

Sıcaklık kontrol cihazı ve objektif ısıtıcısına sahip bir görüntüleme odasına ihtiyaç duyulacaktır. Oda, sipariş sırasında talep edilebilen bir modifikasyonla, açık port içermeyecek şekilde yapılandırılmalıdır. Ardından, mikroskop kamerasını, floresan lambayı ve görüntüleme yazılımını çalıştırın.

Hazne platformunun ve objektif ısıtıcılarının gücünü açın. Bu aşama, objektiflere bir damla yağ uygulamak için de uygun bir zamandır. Şimdi ısıtmalı platformu ve görüntüleme haznesini hazırlayın.

Manipülasyon kolaylığı için, hazne kapağının bir yanını kalıcı bir markörle işaretleyin. Hazne kapağını, ideal bir hazne tutucu olan 50 mililitrelik bir tüpün kapağına, üst tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin.

Üst olarak etiketlenen oda yanındaki deliği çevreleyen yuvaya bir halka şeklinde gres sürün. Gresin oda içine girip gözlemlenebilir alanı azaltmaması için aşırı kullanımdan kaçının. Bir penset kullanarak.

Temiz ve kullanılmamış 18 santimetrelik bir lameli odacığın üst tarafına takın. Odacığın girintili kanalında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için lamelin kenarlarına hafifçe bastırın. Odacığı ters çevirin ve odacığın karşı tarafındaki veya alt kısmındaki kanala benzer bir gres halkası uygulayın.

Kamaraya 750 µL görüntüleme medyumu aktarın. Bu miktar fazladır, ancak gres yağı medyumun taşmasını önlemeli ve fazla miktar, hücreli lameller kapatıldığında kabarcıkların hapsolmasını engelleyecektir. Hazırlanan kamarayı ihtiyaç duyulana kadar doku kültürü inkübatöründe tutun.

Görüntüleme ortamı buharlaşacağı ve kompozisyonu değişeceği için bir saat veya daha uzun süren uzun inkübasyonlardan kaçınılmalıdır. Yaşam tarzı görüntüleme için nihai hazne kurulumunda, hazırlanan hazneyi ve transfekte edilmiş lamel içeren kabı inkübatörden doku kültürü kabinine taşıyın. Steril pensler kullanarak, transfekte edilen kap içerisinden bir lameli dikkatlice çıkarın.

Ardından, büyüme ortamını çekmek için lamın kenarını bir kim wipe'a değdirin. Sonra, lamı nöron tarafı aşağı gelecek şekilde hazırlanmış haznenin üzerine yerleştirin. Lamın bir kenarını önce gres yağına değdirin ve hava kabarcığı kalmadan lamın düzleşmesini sağlamak için kenarlarına baskı uygulayın.

Fazla görüntüleme ortamının dışarı taşması beklenir; fazla görüntüleme ortamını silin, ancak kapatma lamını yerinden kaydırmamaya dikkat edin. Hazneyi önceden ısıtılmış platform ısıtıcısına taşıyın ve hazneyi yerine sabitleyin. Ardından, fotoblöşing ve fototoksisiteyi azaltmak için hazneyi sahneye aktarın.

Lambayı, transfekte hücreleri bulmak için gerekli olan minimum yoğunluk seviyesine ayarlayın. Şimdi incelenecek bir hücre bulun. 40 x gibi düşük büyütmeli bir yağlı objektif kullanırken, lam üzerindeki kapsama alanını maksimize etmek ve mükerrer görüntü alımını önlemek için planlı bir tarama düzenine sadık kalmak faydalıdır.

İstenen alan bulunduğunda, ilgilenilen floresan işaretli proteinin kanalına geçiş yapın. 60 ila 100x gibi yüksek büyütmeli bir yağ daldırma objektife geçin ve lamba yoğunluğunu tekrar yüksek bir ayara getirin; hızlı hareket eden organellerin floresan işaretli protein dinamiklerini kaydetmek için akışlı görüntüleme (stream acquisition) veya görüntüleme yazılımınızın benzer bir fonksiyonunu kullanın. Yüksek kare hızında kayıtlar elde etmek için pozlama süresi ve pozlamalar arasındaki gecikme süresi minimize edilmelidir.

Ekran önizlemesinde gözlemlenen odak kayması, manuel odak ayarı ile gerçek zamanlı olarak düzeltilebilir. Faz görüntüsü ve sonraki analizler ile sunumlar için gerekli olan diğer tüm eşlik eden görüntülerin alındığından emin olun. Lamel üzerinde daha fazla inceleme yapmadan ve bir sonraki kaydı gerçekleştirmeden önce tüm görüntüleri kaydedin.

Genellikle tek bir lamelden üç ila beş kayıt alınması başarılı kabul edilir ve her bir lamel 30 ila 60 dakika boyunca görüntülenir; hasarlı hücrelerde taşıyıcıların azaldığı göz önünde bulundurulduğunda, genel hücre sağlığı üzerindeki fototoksisite dikkate alınmalıdır. Canlı hücre görüntüleme gözlemleri, genellikle görüş alanı içindeki floresan işaretli organellerin hareketini gösteren ve görüntü yığınları olarak da bilinen kayıtlardan oluşur. Burada, yoğun çekirdekli iCal taşınımına ait temsili bir video yer almaktadır.

Gözlemi kolaylaştırmak için renkler tersine çevrilmiştir. Hareket eden partiküllere dikkat edin. CH grafikleri, her bir zaman noktasının grafikte bir sütunla temsil edildiği çizgi taramalarını yan yana getirerek partikül hareketini gösteren görüntülerdir.

Bu şekil, zıt yönlerde hareket eden iki parçacığın bir CH grafiğinde nasıl temsil edildiğini göstermektedir. Kronografların daha detaylı analizi; parçacık akış hızı, yürüyüş uzunluğu tersinmeleri ve durağan parçacıklar hakkında bilgi sağlayabilir. Merhaba, size dsco vezikül taşımasının ve kültürlenmiş hipokampal nöronların yüksek hızlı kayıtlarının nasıl alınacağını gösterdik.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücrelerin inkübatörden sahneye geçişi sırasında oluşabilecek stresi azaltmak için görüntüleme odasının ve platformun tüm bileşenlerini önceden ısıtmayı hatırlamak önemlidir. Hızlı ancak dikkatli çalışmalısınız. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.