Canlı görselleştirme Drosophila Glial nöromüsküler Kavşağı

Bu prosedür, presinaptik nöron terminallerinin floresan boyanması, glial ve postsinaptik kas hücresi membranlarını hedefleyen GFP ve DS red'in endojen ekspresyonu ve parasinaptik boşluğun görselleştirilmesini birleştirerek; vücut duvarı kas hücresi yüzeyiyle ilişkili motor nöronları ve glia hücrelerini açığa çıkarmak amacıyla bir drosophila larvasının tersyüz edilmesiyle başlar. Floresan boyalar kullanılarak, canlı bir preparatta glial nöromüsküler kavşakta meydana gelen yapısal değişikliklerin net bir resmi gözlemlenebilir. Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi zooloji bölümündeki Vanessa'nın ALS laboratuvarından D Brink. Bugün size, konfokal mikroskopi için canlı larva dokusunun görüntülenmesine yönelik bir doku preparasyonu ve iki hücre etiketleme tekniği göstereceğim.

Laboratuvarda bu prosedürü sinir-kas sinapsındaki glial hücreleri incelemek için kullanıyoruz. Şimdi ise tamamen farklı bir yönteme geçiyoruz; tersyüz edilmiş doku hazırlığı, larvaların evrelendirilmesi ile başlar. Bu prosedür, büyük ve diseke edilmeleri kolay oldukları için gezgin üçüncü evre larvalar üzerinde gösterilecektir; sadece aktif olarak sürünen W3 larvaları kullanın.

Ardından, larvaların yüzeyini çift distile su içeren bir Petri kabı içerisinde çok yumuşak bir boya fırçasıyla temizleyin. Larvaların temizlenmesi, daha iyi optik sonuçlar sağladığı ve aynı zamanda bakterileri azalttığı için önemlidir. Larva temizlendikten sonra, onu beş milimolar glutamat içeren üç mililitre buz soğukluğunda HL altı bulunan küçük bir Petri kabına aktarın.

Hayvan hareket etmeyi bırakana ve gevşeyene kadar kabı buz üzerinde bekletin; bu işlem genellikle yaklaşık iki dakika sürer. Larva hareket etmeyi bıraktığında, baskın elinizde yaylı makas ve diğer elinizde çok ince uçlu pensle, bir diseksiyon mikroskobu kullanarak doku diseksiyonuna başlayabilirsiniz. Hayvanı nazikçe kabın tabanına sabitlerken, gövde duvarı boyunca basıncı dengelemek için makasla gövde duvarında küçük bir delik açın.

Forseps ile posterior iki segmenti kesin ve visseral organları diseke ederek ayırın. Bazı yağ cisimlerinin insizyon aracılığıyla vücut boşluğundan dışarı çıkması muhtemeldir. Bu dokuyu da kesin.

Larvaları ince pens ile çanak tabanına karşı nazikçe tutmaya devam edin. Diğer elinizle, küt uçlu sıfır numara bir entomolojik iğne tutun ve bunu larvaların ağız parçalarına doğru itin. Ağız parçalarını, bir çorabı yumruğunuzun üzerine ters çeviriyormuşsunuz gibi vücut boşluğundan dışarı doğru itin.

Ters çevrilmiş doku bu şekilde görünmelidir. Ultra ince diseksiyon yaylı makas kullanarak, yağ cismini ve trakeaları vücut duvarından ayırın. Mümkün olduğunca fazla yağ cismini uzaklaştırın.

Trakeaları çekmemeye veya sinir sistemini ayırmamaya çok dikkat edin. Trakeaların kopması, gövde duvarı kasında yırtılmalara neden olacaktır. Diseksiyon bittiğinde, kas opak veya kasılmış değil, yarı saydam ve gevşemiş olmalıdır.

Kası, oda sıcaklığında glutamat içermeyen HL 6'ya yerleştirirseniz, muhtemelen ritmik olarak kasılacaktır. MSS'deki motor patern jeneratörleri aktif olduğu için, bozulmamış içe dönük vücut duvarı dorsal ve ventral orta hatlar boyunca ikiye katlanma eğilimindedir. Bu nedenle preparat, görselleştirme için sol veya sağ hemi hayvan görünümü sunar.

Son olarak, dokuyu köprülü lamel düzenlemesiyle bir mikroskop lamına monte edin. Dokunun montaj prosedürleri daha sonra gösterilecektir. Nöronal batonların işaretlemesine başlamak için, HL altısında bulunan 30 µL floresan işaretli primer anti HRP antikor çözeltisini pipetleyin ve bir Petri kabına bir damla damlatın.

Ardından, tersyüz edilmiş gövde duvarı preparatını boya banyosuna daldırın. Yaklaşık beş dakika sonra nöron terminal etiketlemesini görebilirsiniz, ancak tam ve parlak bir etiketleme için 10 ila 20 dakika boyunca inkübe edin.

Fazla HRP etiketini durulamak için dokuyu, oda sıcaklığında 10 ila 30 saniye boyunca yarım mililitre HL six içine yerleştirin. Bağlanmamış boya hızla durulandığı için durulama döngüsünün uzun veya şiddetli olmasına gerek yoktur. Etiketlenmiş doku artık lam üzerine yerleştirilmeye ve mikroskopi ile görüntülenmeye hazırdır.

Az önce gösterilen canlı antikor işaretleme protokolünün bir varyasyonu, sıvıyla dolu hücre dışı boşlukları belirginleştirmek için floresan konjuge dekstrin kullanmaktır. Bu prosedüre başlamak için, floresan konjuge dekstrin boyasını HL six içinde 0.001 mg/mL konsantrasyonda seyreltin. Eğer dekstrinin hücre dışı boşluğa difüzyonunun kesin zamanlamasıyla ilgilenmiyorsanız, dekstrin konsantrasyonunu değiştirmeniz gerekebilir.

Köprülü bir lamelle karşı örtü camı üzerine 20 µL boya damlatın ve doku preparatını boya banyosuna aktarın. Eğer dışa döndürülmüş (inside-out) dokunun perfüze edilmesine gerek yoksa veya HL six hacminin düşük tutulması gerekiyorsa, doku çift köprülü bir lam üzerine monte edilebilir. İşe, iki adet 18 mm'lik kare örtü camını çok temiz bir mikroskop lamı üzerine hızlı yapıştırıcı ile yapıştırarak başlayın.

Lamel kenarları arasında iki milimetrelik bir boşluk bırakın ve bu boşluğu slaytın yaklaşık ortasına gelecek şekilde merkezleyin. Yapıştırıcının tamamen kurumasını bekleyin, aksi takdirde doku hazırlığınızın etrafındaki sulu ortam üzerinde bir film tabakası oluşacaktır.

Ardından, lam örtüleri arasındaki boşluğa 30 µL HL six damlatın. Tersyüz edilmiş dokuyu HL six damlasının içine yerleştirin. Eğer larva büyükse ve görüntüleme sisteminizin piksel dizini sınırlıysa, dokuyu çapraz bir şekilde konumlandırmanız gerekebilir.

Üçüncü bir 18 milimetrelik lamellenin kenarlarına az miktarda Vazelin sürün ve gresli tarafı aşağı gelecek şekilde doku üzerindeki yapıştırılmış iki lamelin üzerine yerleştirip nazikçe bastırın. Burada, döner disk konfokal mikroskobu ile elde edilen, larva preparatının ters çevrilmiş içeriğinin akut floresan işaretlemesine yönelik iki yöntemimizin sonuçları yer almaktadır. Birincisi, canlı anti HRP işaretli Buton terminallerine sahip bir glial sinir kas sinapsının optik yığın görüntüsüdür.

Kas hücresinin yüzeyinde, maviye yalancı renklendirilmiş, parlak şekilde işaretlenmiş nöron buton tipi terminaller görebiliriz. Görüntü yığınının ortasında, yeşil renkte gösterilen GFP işaretli glial uzantıların yanı sıra mavi HRP işaretli batonlar bulunur. Batonların etrafında, yığının ortasında ve derinliğinde kırmızı renkte olan, cep benzeri SSR (sinaptik retikül) yapıların kesitleri görülmektedir; bunlar ayrıca DS red ile işaretlenmiş SSR'lerdir.

SSR'ler, kas hücresinin özelleşmiş sinaptik bölgeleridir. BNS'ler, yeşil glial uzantıların bazı kısımlarının da yaptığı gibi, kas hücrelerindeki ceplerin içine yerleşir. Glial hücre uzantıları BNS ve SSR çevresine girer, ancak yığının en derin katmanlarında olduğu gibi sinaps yüzeyini bir battaniye gibi örtmezler.

Yeşil glial uzantıları ve kırmızı SSR'yi görüyoruz ancak buton terminallerinden bu kadar çok görmüyoruz. Ayrıca kası innerve eden motor sinirin kesitlerini de bulabiliriz. Glial hücreler motor siniri sardığı için o da yeşildir.

Larva preparasyonunun içeriden dışarıya doğru akut floresan işaretlemesinin ikinci sonucu, floresan dekstrin ile işaretlenmiş sinapstır. Burada, parasinaptik boşluktaki veya sinaptik yarıkta bulunan sıvı kırmızıya işaretlenmiştir. Optik yığın görüntüsünün yüzey katmanlarında, kırmızı dekstrin boyasından oluşan bir sıvı tabakası vardır ve bunun kas plazma membranındaki dalgalı çöküntülerde nerede biriktiğini görebilirsiniz.

Yığının daha derin katmanlarında, floresan dekstrin boyası sinaptik yarıklara sızmıştır; nöron terminalleri ile mavi etiketli SSR cepleri arasında küçük donut şeklinde boya halkaları oluşur. Burası, boya ile belirginleştirilmiş sinaptik yarıktır. Yeşil glial lamella, görüntü yığınının derin katmanlarında boyanın yarığa nüfuz etmesini engellemez.

En belirgin özellikler, mavi ile işaretlenmiş olan kasın SSR veya sinaptik bölgesi ve yeşil renkteki düz glial uzantılardır. Benzer şekilde, derin tabakalarda görülen sinirsiz aksonların etrafındaki glial kılıf yeşildir. Glial kılıf, dekstrin boyasını dışlıyor gibi görünmektedir.

Drosophila larvalarının ters-yüz edilmiş (inside-out) doku preparasyonunda glial sinir kas sinapsını görselleştirmek için yeni bir yöntem gösterdim. Dokuyu hazırlarken, dokuyu nazikçe işlemeye dikkat etmek, kasın gevşemiş olduğundan ve periferik sinirlerin hasar görmediğinden emin olmak önemlidir. Marx'tan bir alıntıyla sözlerimi tamamlamak istiyorum.

Zaman bir ok gibi uçar. Korku bir muz gibi uçar.