C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Cam üzerine bir damla sogar sürülerek hazırlanan ve gece boyu kürlenen segar kaplı bir lamel, önceden hazırlanmış kayıt odasının dairesel boşluğuna yerleştirilir ve kayıt solüsyonu ile kaplanır. Merkeze yerleştirilen bir solucan, bir gluk pipeti kullanılarak solucanın dorsal tarafına yapıştırıcı uygulanıp baş veya kuyruktan başlanarak eşik koruyucu yüzeye yapıştırılır. Yapıştırma işlemi tamamlandığında, kütikül ile yapıştırıcı arasındaki arayüzde vulvaya komşu bir bölgeye cam iğne ile bir insizyon yapılır ve vücut boşluğundaki viseral organlar ile yumurtalar çıkarıldıktan sonra bu insizyon başa doğru genişletilir.

İnsizyonun kesik kenarı, ventral siniri ve vücut duvarı kaslarını açığa çıkaracak şekilde yapıştırıcı ile sogara nokta kaynağıyla sabitlenir. Vulvanın ön tarafındaki ventral medial kas patch clamp yöntemiyle sabitlenir ve uyarıcı elektrot sinir kordonu üzerinde, akış yönünün yukarısına yerleştirilir. Merhaba, ben Janet Richmond, Illinois Chicago Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nde doçentim.

Bugün size, elektrofizyolojik kayıtlar için deniz sülüğünün nöromüsküler bileşkelerini açığa çıkarmamıza olanak tanıyan bir diseksiyon tekniğini göstereceğim. Sinaptik iletimi incelemek için bu preparatı kullanıyoruz.

Tamam, başlayalım. Nematodlarla çalışmaya başlamadan önce, işlemden en az bir gün önce bazı donanımlar hazırlanmalıdır: bir diseksiyon kayıt haznesi, S koruyucu kaplı lameller, eski pipetler, bir yapıştırıcı aplikatörü ve bir ekstraksiyon pipeti.

İşleme hazneyi oluşturarak başlayın. 1/16 inç kalınlığındaki bir pleksiglas tabakasını mikroskop tablasına uygun olacak şekilde kesin. Kayıtlar, pleksiglasın merkezinde gerçekleştirilmelidir.

22 milimetre çapındaki dairesel bir lamel tutkalını yerleştirecek kadar büyük dairesel bir delik açın. Delik altındaki haznenin alt tarafına, lamelin her köşesine birer adet düşük erime noktalı paraplak doku gömme mumu yerleştirerek 48 x 60 milimetrelik bir lamel sabitleyin. Mum, sıcak plakada hızla eritilir ve soğuma sonrası pleksiglas ile lamel arasında ince bir mum tabakası kalır; fazla mumu bir bıçakla temizleyin.

Hazneye uygun olan lamılele, 22 milimetrelik S guard kaplı bir lameldir. SARD'ın çalışması için üretici talimatlarına göre taze olarak hazırlanması gerekir. Hazırlandığında, her lamelin üzerine küçük bir damla SARD damlatılır ve düz bir yüzey oluşturmak için bir bıçak yardımıyla yayılır.

Kaplanmış lameller daha sonra kapalı kaplara yerleştirilir ve kürlenmesi için gece boyunca 65 °C'lik bir fırında bekletilir. Yarın, protokol boyunca yapılacak diseksiyon işlemi için hazır hale geleceklerdir. Yaklaşık dört megaohm dirence sahip bir uca kadar çekilmiş, bir milimetre dış çaplı silikat cam pipetler gerektiğinden, bir kavanozda hazır bulundurulmaları faydalıdır.

Miriam Goodman tarafından hazırlanan, programlanabilir polar ile yama, pipet ve keskin elektrotların yapımıyla ilgili Joe Yayınını inceleyin. Elektrofizyoloji uygulamalarını gerçekleştirmek için gereken teknik detaylar kapsamında, nematod sabitlenmek üzere yapıştırılmalıdır. Bunun için bir tutkal aplikatörü gereklidir.

Tutkal aplikatörü, basitçe bir milimetre iç çapa sahip iki milimetrelik plastik bir tüptür. Tüpün bir ucu ağızda tutulacaktır. Bu uç bir ağızlık ile donatılabilir ve tüpün diğer ucu, tutkal ile doldurulmuş bir milimetrelik bir pipeti tutacaktır.

Diseksiyon sırasında uzmanlaşmış bir ekstraksiyon pipeti de kullanılır. Bu, yapıştırıcı aplikatörü gibi bir tüp ve pipetten oluşur; ancak pipet, yumurtaları ve viseral organları yerleştirebilmek için hafifçe geriye doğru kırılmıştır. Oda çevresi boyunca bir balmumu çizgisi çizerek başlayın.

Şimdi, Sylgard kaplı bir lamı Sylgard kısmı yukarı bakacak şekilde bastırarak yerleştirin. Balmumu çizgisi, lami sabitler ve diseksiyon ile kayıt sırasında kayıt solüsyonunun altına sızıp lami yerinden oynatmasını engeller. Ardından hazne, hücre dışı kayıt solüsyonu ile doldurulur. Hazne hazır olduğunda, formülasyon için beraberindeki metni okuyun.

Çözeltinin içine birkaç nematod yerleştirmek için bir nematod toplama iğnesi (nematode pick) kullanın. Pratikle, yüzen nematodlar, hareketi önlemek için ek prosedürlere gerek kalmadan doğrudan yapıştırılabilir. Yapıştırıcıyla çalışmak için, balmumu veya modelleme kiliyle sabitlenmiş bir PCR kapağından yapılmış yapıştırıcı kabını, Sano akrilik yapıştırıcı çalışma stoğu ile doldurun.

Kayıt pipetini yapıştırıcı aplikatörünün ucuna takarak aplikatörü tamamlayın. Ardından, diseksiyon mikroskobu altında, yapıştırıcı aplikatörünü ağız yoluyla vakumlama yaparak doldurun. Yapıştırıcı, hücre dışı kayıt solüsyonuyla temas ettiğinde polimerize olduğu için, yapıştırıcının bir nematoda uygulanması zordur ve pratik gerektirir.

Bunu gidermek için, yapıştırıcının sabit bir dış akışını sağlayın, aksi takdirde yapıştırıcı sertleşerek pipeti tıkayacaktır. Pipet tıkanırsa, uç kısmını lamel üzerine hafifçe vurarak bazen tıkanıklık açılabilir. Yapıştırıcı ile çalışma pratiği yapın.

Sil koruyucu üzerine tutkal ile isminizi yazabildiğinizde, muhtemelen bir nematodun kütikülünü yapıştırmaya hazırsınız demektir. İlk olarak, çalışma alanı olan oda merkezine yakın bir tane seçin. İkinci olarak, nematodun başına veya kuyruğuna küçük bir miktar tutkal sürün ve nematodu hızla sil koruyucu yüzeye doğru çekerek yapıştırın.

Ardından, nematod kütikülünün dorsal kenarı boyunca bir hat şeklinde yapıştırıcı uygulayın. Bu işlem, nematodu vulvası içe bakacak şekilde C pozisyonuna zorlar. Nematodun syl guard'a maksimum düzeyde yapışması için bu yapıştırıcı hattındaki tüm boşluklar doldurulmalıdır.

Bu zorlu bir işlemdir ve hipomotil mutantlar üzerinde pratik yapmak faydalı olabilir. 31'de olduğu gibi, hemen sağda bir ampul var. Şimdi bu preparatı döndüreceğim ve ardından cam iğneyi getirip insizyon yapmaya başlayacağım. Kütikül insizyonunu yapmak için el tipi bir diseksiyon pipetine geçiş yapın.

Bu pipetin, yapıştırma kayıt pipetlerinden daha keskin olması ve en yüksek büyütme kullanıldığında kısa, sağlam bir şafta sahip olması gerekir. Diseksiyon mikroskobunda, pipeti nematodun boylamsal eksenine paralel olarak hizalayın ve ucu vulva yakınındaki kütikül yapıştırıcı ara yüzeyine yerleştirin. Bu insizyon, nematodun hidrostatik basıncını serbest bırakarak yumurtaların ve bağırsakların insizyon noktasından dışarı çıkmasını sağlar.

Faringse ulaşana kadar, bir mektup açma hareketine benzer şekilde, kütikülü nematodun baş kısmına doğru kesmeye devam edin. Şimdi, nematodun iç organlarını vakumla çekmek için ekstraksiyon pipetine geçin. Kesi temizlendikten sonra, açılmış kütikül silindirik şeklini koruyacaktır.

Ardından, temiz bir yapıştırma pipeti alın. Bunu, insizyon kenarındaki kütikülün syl guard yüzeyine nokta kaynağıyla sabitlenmesi için kullanın. njs'nin zarar görmesini veya kapanmasını önlemek için bu aşamada minimum miktarda yapıştırıcı noktası kullanmak önemlidir.

Ventral sinir kordonu ve vücut duvarı kasları şu an açığa çıkmış durumdadır, ancak NMJ'yi örten bazal membranın hala uzaklaştırılması gerekir. Bunu yapmak için, odadaki hücre dışı kayıt çözeltisini çekip vakumla alın ve 0,4 mg/mL konsantrasyonda bir hücre dışı kayıt çözeltisi uygulayın. 10 ila 20 saniye sonra kollajenazı uzaklaştırın ve preparasyonu taze kayıt çözeltisi ile birkaç kez yıkayın.

Nematod artık elektrofizyolojik kayıtlar için hazırdır. NMJ konumunda, dik bir mikroskop tablası üzerindeki kayıt hücresinde, nematodu merkezlemek için 10 kat objektif kullanın; ardından DIC optik sistemine sahip 40 kat su daldırma objektife geçerek gövde duvarı kaslarının ve sinir kordonunun sağlam olduğunu kontrol edin. Elektrotların hem sol hem de sağ taraftan yerleştirilebilmesi için nematodu yatay olarak konumlandırın.

Genellikle, vulvaya içte kalan kaslar varken ventral medial gövdeye yama yapılır, ancak solucanın hem dorsal hem de ventral tarafındaki kaslara kolaylıkla yama uygulanabilir. Kasla bitişik, yarım daire şeklinde görünen birkaç nörona odaklanın. Şimdi, bir giga mühür elde etmek için standart yamaleme (patch clamping) tekniklerini kullanarak kasa yama yapın. Deneyimlerimize göre, bütün hücre voltaj klemp kayıt modu için yaklaşık 4 mega dirençteki kayıt elektrotları iyi sonuç vermektedir.

Gigo sızdırmazlığı bozulana kadar daha fazla vakum uygulayın ve membrana şok verin. Böylece dört mega dirençten bahsetmiştik. Oradan baktığınızda, evet, orada 4,9 megas yazıyor.

Daha büyük, normal. Kullandığımız aralıklarda. Tamam. Evet. Şimdi "peki ne olmuş?" kısmında daha kapsamlı ilerlemeye çalışacağız.

Ne? Bunun tamamen aşağıya inmesini istiyoruz. Evet. Anladım. Yaşasın.

İyi bir kayıtta, vahşi tip yetişkin nematodların vücut duvarı kasları tipik olarak yaklaşık 70 picofarad hücre membranı kapasitesine sahiptir ve yaklaşık 50 pico amps gibi minimal tutma akımlarıyla, negatif 60 millivolts tutma potansiyelinde en az 10 dakika boyunca stabil bir şekilde kaydedilebilir. Bir kas hücresi patch yapıldıktan sonra, ikinci bir elektrottan gelen stimülasyon, ışıkla aktive olan kanal, Rodin veya hiperozmotik solüsyon eklenmesi ölçülebilir yanıtlar oluşturacaktır. Elektriksel olarak uyarılmış bir yanıt elde etmek için, genellikle patch yapılan kasın iç kısmındaki ventral sinir kordonu üzerine hücre dışı solüsyon içeren bir stimülasyon elektrodu yerleştiririz.

Bu gevşek yama (loose patch) konfigürasyonu, 10 ile 40 volt arasında bir akımın bir ila iki milisaniyelik darbelerle uygulanmasını gerektirir. Ne yazık ki, birkaç uyarılmış yanıttan sonra sinir kordonu geri döndürülemez şekilde hasar görür ve bilinmeyen bir nedenle, bu konfigürasyon kullanılarak yalnızca kolinerjik uyarılmış yanıtlar elde edilebilmektedir. Alternatif olarak, farklı nöronal popülasyonlarda dosin transgeni içeren ve ışıkla aktive edilen bir kanala sahip olan nematodlar, salınımı uyarmak için kullanılabilir.

Bu yöntemin hazırlığında, bu uygulama için kullanılan nematodların retinol ile zenginleştirilmiş bakteriler üzerinde büyütülmesi gerektiğiten haberdar olun. Bu hazırlıkta, 450 ila 490 nanometre arası bir GFP eksitasyon filtresinden geçirilen, yüksek güçlü 470 nanometrelik bir LED, kanalı aktive eden opsini tekrar tekrar tetiklemek için kullanılır ve bu da kanalı eksprese eden hücre tiplerine bağlı olarak farklı nörotransmitterlerin salınımını uyarır. Gözden geçirilecek son teknik, kaydedilen kas üzerindeki birkaç nörondan gelen sinaptik veziküllerin hızla salınabilir havuzunun boyutunu ölçmek için kullanılabilir.

Bu işlem, yamalı kas üzerine bir ila üç saniye boyunca hiperozmotik bir hücre dışı çözeltinin basınç darbeleriyle uygulanmasıyla gerçekleştirilir. Sonuç, bir dizi asenkron post-sinaptik olay olacaktır. Yukarıda açıklanan üç stimülasyon protokolünün her biri için (elektriksel olarak uyarılan, ışıkla uyarılan ve hiperozmotik yanıtlar) tüm hücre voltajı kenetlemeli vücut duvarı kası kayıtları gösterilmiştir.

Tüm durumlarda, ventral medial gövde duvarı kası negatif 60 milivolt seviyesinde sabitlenir. Yabani tip kas hücreleri tipik olarak yüksek oranlarda endojen içe doğru minyatür sinaptik akımlar sergiler. Standart kayıt solüsyonlarımızda, anterior ventral sinir kordonunun iki milisaniyelik depolarizasyonu, birkaç sinapsdan senkronize salınıma neden olarak yaklaşık iki ila 2,5 nano amper civarında büyük bir uyarılmış yanıt oluşturur.

Yaban tip solucanlarda, A ve B'deki yaban tip izlerinin sağındaki temsili izler, 18'deki ağır koordinasyon bozukluğu olan bir mutanttaki sinaptik salınımı göstermektedir; C paneli, channel red dosin eksprese eden yaban tip bir solucanın nöromüsküler bileşkesinden gelen ışıkla uyarılan yanıtı göstermektedir. Kolinerjik nöronlarda, iki milisaniyelik bir ışık darbesi tipik olarak 1.5 ile 1.8 nano amp arasında bir yanıt oluşturur. Kas üzerine bir saniye boyunca 850 Milli osmo hiperozmotik salinin basınçlı püskürtülmesi, veziküllerin hızla salınabilir havuzunu temsil eden asenkron minyatür sinaptik akım dizileri oluşturur.

Size, deniz zambağının nöromusküler kavşaklarını açığa çıkarmak ve elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirmek için kullandığımız disseksiyon tekniğini gösterdim. Bu tekniğin zorlayıcı olduğunu ve mükemmelleştirmenizin muhtemelen aylar süreceğini unutmamak önemlidir. Ancak, bir kez kazanıldığında, bisiklet sürmek gibidir.

Teknikler sizinle kalacak ve bunu ne kadar çok yaparsanız, hazırlık süreci o kadar hızlı ve güvenilir hale gelecektir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.