Name: Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: Öğrenin antijen spesifik CD4+ T hücrelerini MHC Sınıf II tetramerler kullanarak görselleştirme yöntemini. Bu teknik, akış sitometrisi ile bağışıklık yanıtlarını hassas şekilde incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dick Foley ve Leigh Kimball, film çekimi ve video prodüksiyon anahtar roller için teşekkür ederiz.

1. Periferik kan mononükleer hücre (hücre) izolasyonu <ol><li> Kan örneği al kan, şırınga ve kan tüpleri toplanan pıhtılaşmasını önlemek için heparin (1:50 oranı) ile anti-pıhtılaşmış olmalıdır. Yaklaşık 1 × 6 mL kan başına 10 PBMC bir verim bekleyin - CD4 pozitif (CD4 +) T hücreleri yaklaşık% 40 olacaktır. </li><li> Içine kısım 50 ml konik tüpler, tüp başına 25 ml kan. Kan ayrılmış varsa, plazma dağıtmak aliquoting önce hafifçe karıştırın </li><li> Toplam hacmi, 40 ml ve 11 ml Ficoll, çizerek altında yatan getirerek, kan tüpü takmadan ve dikkatle pipet pipetlemeyin Yardım çıkarmadan, PBS ekleyin. Ficoll yavaş tüpün dibine drenaj olacaktır. Seviyesi eşitledi sonra, yavaş yavaş kan tüpü pipet çıkarın ve atın. </li><li> Kan tüpleri kap ve Aerosolve kutu içine hareket. Herhangi bir fren 900 kutu ve santrifüj × g 20 dakika - sıkıca kapatın. Bu frenleme kuvvetini hücre katmanı zarar verecek herhangi bir fren, bu spin sonunda uygulanır kritik öneme sahiptir. </li><li> Spin sonra PBMC'ler sarı plazma (üstte) ve şeffaf Ficoll (aşağıda) arasındaki belirgin bir beyaz tabaka oluşturur. Beyaz kan hücre tabakasının bir transfer pipeti ve yeni tüp transfer kullanarak hafifçe sıyırmak. Bazı plazma ve Ficoll PBMC'ler ile hazırlanan, ancak herhangi bir kırmızı hücre tabakasının hazırlanması önlemek olabilir. Genellikle iki kan tüpü pelet boyutunu artırmak için bu aşamada bir hücre tüp içine kombine edilebilir. </li><li> Aerosolve kutu düşük fren - 500 toplam hacmi 50 ml ve santrifüj getirerek × PBS, g 15 dakika boyunca. </li><li> Pelet rahatsız etmemek için özen Pasteur pipeti kullanarak sıvı aspire </li><li> Her tüpe 5-6 ml ekleyerek ve öbekler kaldırmak için yavaşça karıştırarak hemolitik tamponu ile şımartın. En fazla 5 dakika inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca toplam hacmi 230 ml ve 50 santrifüj getirerek × PBS, g - düşük fren. Aerosolve bidonlarda bu yavaş spin için artık ihtiyaç vardır. </li><li> Iki kez yıkayın: aspire sıvı Pasteur pipeti kullanarak, 10 dakika için 230 × g PBS ve santrifüj tüp doldurmak. </li><li> Son yıkama adım önce, bir kısım tekrar askıya hücrelerinin kaldırmak tripan mavi ile seyreltilmiş ve bir hemasitometre kullanarak saymak. Bu hücre sayımı T hücre ayırma adımda kullanılan reaktif hacimlerini belirleyecektir. </li></ol> 2. CD4 + T hücre ayrımı * <ol><li> Sıvı aspire ve toplam hacmi 10 milyon hücre başına 40 uL getirmek için çalışan tampon eklemek. Genellikle bu tampon uL 30 artı kalan pelet hacmi gerektirir. </li><li> Bu hacim, 15 ml konik tüp aktarın. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde 10 milyon hücre başına 10 uL, kap tüp, yer ve CD4 izolasyon kiti antikor kokteyli ekle </li><li> , Buz tüpünü çıkarın, kapağı çıkarın ve 10 milyon hücre başına tampon çalışan 30 uL eklemek </li><li> CD4 izolasyon kiti manyetik boncuk - 10 milyon hücre başına 20 uL, kap tüp ve 15 dakika boyunca buz üzerinde yer </li><li> 230 × g 'de 10 dakika boyunca yıkayın ve santrifüj tampon çalışan on hacimleri ekleyin. </li><li> Spin sırasında, çalışma alanında mıknatıs ve 5 ml polipropilen tüp kurmak </li><li> , Hücre pelletini sıvı aspire 2 mL çalışan tampon ve bir transfer pipet kullanarak kümeleri kaldırmak </li><li> Aynı transferi pipet kullanarak, 15 dakika boyunca mıknatıs 5 ml tüp ve inkübe hücrelerinin transferi </li><li> Tersine mıknatıs tarafından dikkatlice belirgin bir 15 ml tüpe + CD4 hücre fraksiyonu süzün ve tüm ama son damlasına boşalma </li><li> 2 ml 5 ml tüp tampon çalışan başka bir ekle ve mıknatıs kaldırmak </li><li> Yavaşça akmasına ve belirgin bir 15 ml tüp transfer kapalı CD4 hücrelerinin durulama </li><li> Her tüpe 2 mL T hücre orta ekleyin, 10 dakika boyunca 230 × g hücre sayımı ve santrifüj hacimde çıkarın. </li><li> Tripan mavisi ile hücre alikotları seyreltilir ve bir hemasitometre kullanarak saymak. Bu hücre sayımı genişleme kültür adım için kullanılan kuyuların sayısını belirleyecektir. </li></ol> 2.11 - * Alternatif olarak, sütun ve boncuk MACS (Miltenyi Biotec), AutoMACS hücre ayırıcı (Miltenyi Biotec), ya da Robosep hücre ayırıcı (Kök Hücre Teknolojileri) adımları 2.2 yerine talimatları üretmektedir göre olabilir. 3. In vitro Genişleme kültüründe <ol><li> Sıvı aspire CD4 + ve CD4 hücre hücre sayımı dayalı pelet, kültür ortamı (genellikle 3 milyon CD4 + mL başına hücreleri ve kültür kurmak için 10 milyon mL başına CD4 hücrelerinin iyi çalışıyor). Genişleme kültürü 3-5 milyon CD4 hücrelerinin ortalama 2-3 milyon CD4 + 48 kuyu kültür plaka 1 ml kültür ortamı toplam hacmi de başına hücre gerektirir. Tipik olarak, CD4 + hücreler sınırlayıcı nüfus </li><li> İsterseniz, CD4 hücrelerinin (5000 Rad ışın tedavisi s). 48 plaka her biri için 300-500 mcL ekleyerek uygun sayıda kuyu içine kısım CD4 hücreleri. 1 saat süreyle 37 ° C inkübatör tabak koyun. Yapışık CD4 hücrelerinin genişlemesi kültürü, antijen sunan hücreler olarak hizmet verecek. </li><li> Inkübatör plaka çıkarın. </li><li> 500 uL taze medya ekleyerek ve yavaşça aşağı yukarı 12-20 kez pipetleme ve bir transfer pipetlemeyin kullanarak ve sıvı kaldırarak kuyu yıkayın. Bu yıkama yapışık antijen sunan hücrelerin bir tabaka geride bırakmak. </li><li> Yıkama işlemi tamamlandığında, her bir kuyunun altındaki ıslak (yaklaşık 100 uL) yeterli medya eklemek aksi takdirde yapışık hücrelere kurumasına </li><li> 2-3 milyon CD4 + hücreler, her bir kuyunun ekleyin. Gerekirse, her bir kuyunun 1 ml kadar toplam hacmi getirmek için ek medya ekleyin. </li><li> Her bir kuyu için istenen peptid ekleyin. Uyarılması için tipik derişim 10 ug / son ml. </li><li> 7 gün boyunca 37 ° C'lik inkübatöre yerleştirin plakası. </li><li> 7 gün sonra, 50 uL Hemogen eklemek IL-2 (ya da rekombinant IL-2, 10 IU / ml olarak, eşdeğer) her bir kuyunun. </li><li> Her bir sonraki gün, bir mikroskop kullanılarak hücre büyümesini izlemek. Taze medya ve IL-2 50 uL ekleyerek, ama medyanın yarısı kaldırarak konfluent değildir kuyu besleyin. , Hücreler resuspending hücrelerin yarısı boş bir kuyu, hareketli taze medya ve IL-2 50 uL ekleyerek konfluent kuyu Böl. Hücreleri inkübatör dönün. </li><li> Genişleyen hücreleri 13-15 gün sonra kültür tetramer için hazır olacak. </li></ol> 4. Tetramer boyama T hücreleri görselleştirme <ol><li> Satın alma veya uyarılmış CD4 + T hücreleri (tetramer reaktifleri kaynakları için tartışmaya bakınız) maç peptid / MHC kombinasyonları maç tetramers monte. Tetramers ~ 0.5 mg / ml olmalıdır. </li><li> Inkübatör gelen plaka çıkarın. </li><li> Her iyi medya yarısı dikkatlice çekişi </li><li> 5 ml polistiren FACS tüp içine genellikle 75 mcL veya yaklaşık 50.000 hücreleri her iyi hücreleri bir kısım transfer </li><li> , Genellikle 50 mcL toplam hacim başına mcL 1 - ve 1-2 saat yer 37 ° C inkübatör tetramer ekleyin. Negatif kontrol olarak uyumsuz tetramer her kuyudan hücrelerin ikinci bir kısım leke de tavsiye edilir. </li><li> Her antikor 3-10 mcL ekleyerek anti-CD3, anti-CD4 ve anti-CD25 antikorları ile etiketleyin hücreleri. Ek veya alternatif antikor belirteçler kullanılabilir. Bu kanal tetramers için ayrılmalıdır Ancak, PE etiketli antikorlar kullanmayın. Şu anda ekstra hücreleri kullanarak, aynı zamanda etiket tek renk veya izotip kontrolleri. </li><li> 15-30 dakika buz üzerinde veya 4 inkübe antikor etiketli hücreleri ° C </li><li> 0,5-2 ml, 230 × g 'de 10 dakika boyunca tampon ve santrifüj çalışan her tüp yıkayın. </li><li> FACS tüpleri dikkatlice süzün sıvı. , Daha sonraki FACS analiz için bir kapalı konteyner buz üzerinde (tercihen) tüm tüpler saklayın. </li></ol> 5. Flow Sitometri Toplama ve Analizi <ol><li> Flow Sitometri referans boncuklar kullanarak kalibre edin. </li><li> Cihaz ayarlarını kontrol edin: <ol><li> Lekesiz kontrol hücreleri veya izotip kontrolleri kullanarak, canlı lenfosit kapısı (FSC vs. SSC) konumunu ayarlamak. Her eksen ilk on altındaki nüfus (kazancı ayarlarını değiştirerek) merkezleme tüm kanallar otomatik floresan çıkarın. </li><li> , Tek renk kontrolü tüpleri, tek tek her bir renk için doğru kadran içinde merkezi olayları (tazminat ayarlarını değiştirerek) kullanma. </li><li> Ilgisiz bir tetramer ile boyanmış bir tüp kullanarak, cihaz ayarları bir ince ayar yapın. Tetramers genellikle antikor kontrolü daha parlak leke, çünkü özellikle PE kanal ayarları ayarlanması gerekebilir. Ilgisiz tetramer &lt;0.5% CD4 + hücreler leke gerekir. </li></ol></li><li> Her tüp için veri elde <ol><li> Toplamak için olayları her numune tüpü ve negatif kontrol tüpü </li><li> Analysys için en az 20.000 etkinlik kazanmak ve tasarruf </li></ol></li><li> Verileri analiz <ol><li> Veri alma dosyaları FACS analiz yazılımı (örneğin CellQuest yazılım, WinMDI veya FlowJo). Ilgisiz bir tetramer kullanarak bir tüp boyanmış kullanarak analiz başlayın. </li><li> Arsa FSC vs SSC ve canlı lenfositleri (Şekil 1, sol üst panel) etrafında bir kapı çizin. </li><li> CD4 Arsa vs CD3 ve CD3 + ve CD4 çevresinde geçitler çizerek (sadece canlı lenfositleri göstermeye kapılı) + nüfus (Şekil 1 sağ üst panel). </li><li> Arsa CD4 vs tetramer (CD3 + lenfositlerin sadece göstermek için kapılı) ve kadran sınırlar koymak ve böylece CD4 + tetramer + nüfusun% 0.5 'den az (Şekil 1 sol alt panel). </li><li> Arsa CD25 vs tetramer ve CD25 + tetramer + nüfusun% 0.5 'den az (Şekil 1 sağ alt panel), böylece kadran sınırlar koymak (kapılı, CD4 + lenfositlerin sadece göstermek için). </li><li> Tüm kapıları değiştirmeden numune tüpleri analiz edin. </li></ol></li></ol>1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png "alt =" Şekil 1 "width =" 600 "height =" 342 "/&gt; Şekil 1 Temsilcisi negatif kontrol tetramer boyama sonuçları. Sol üst panel ileri dağılım ayetleri yan dağılım ve lenfosit boyut kapısı (R1) gösterir. R1 için sağ üst panel kapı ve anti-CD3 ve CD3 + (R2) ve CD4 + (R3) kapıları karşı karınca CD4 gösterir. Alt sol panelinde R2 kapılı ve tetramer karşı anti-CD4 gösterir. Sağ alt R3 için kapı ve anti-CD25 karşı tetramer gösterir. Hem tetramer araziler için kadran,% 0.5 'kuruldu. 6. Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> Tetramer pozitif hücreler arasında ayrı bir nüfus genişletilmiş CD4 + hücreler (Şekil 2) olmalıdır. </li><li> Tetramer pozitif hücreler genellikle CD25 + ve genellikle CD4 yüksek. </li><li> Bazı durumlarda, bir MHC / peptid kombinasyonu arka plan boyama (genellikle çözünür yoksul bir peptid neden) verebilir. Böyle bir arka plan boyama "yanlış pozitif" hücre tetramer veya CD25 tetramer araziler (Şekil 3) vs vs ya CD4 tek bir farklı nüfus değil, çünkü gerçek bir pozitif ayırt edilebilirler. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362"> Şekil 2 Temsilcisi pozitif tetramer boyama sonuçları. Panel düzeni ve yolluk strateji Şekil 1 aynıdır. Tetramer pozitif hücrelerin farklı bir anti-CD25 karşı tetramer paneli tetramer paneli ve ayrı bir CD25 + nüfus karşı anti-CD4 CD4 yüksek nüfus olarak görünür. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="Şekil 3" width="600" height="336"> Şekil 3 Temsilcisi "yanlış pozitif" tetramer boyama sonuçları. Panel düzeni ve yolluk strateji Şekil 1 aynıdır. Tetramer paneli karşısında anti-CD4 belirsiz bir "Gömülü" boyanma gösterir. Anti-CD25 karşı tetramer da CD25 + doğru açık bir eğilim ile "Gömülü" boyama, gösterir.

<ol><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4%2B+T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer-guided+epitope+mapping%3A+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4%2B+T+cell+epitopes+from+complex+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li>
</ol>

Bağışıklık CD4 + T hücrelerinin rolünü anlamak temelde önemli. Ancak, antijen spesifik CD4 + T hücreleri tespit ve geleneksel yöntemler kullanılarak izole etmek zor olabilir. Buna karşılık, CD4 + T hücreleri MHC sınıf II tetramers istenen antijen özgüllüğü ile doğrudan görselleştirme izin verir. Bu video, izolasyon, saflaştırma ve CD4 + T hücreleri ve sonraki görselleştirme kullanarak tetramers in vitro amplifikasyon göstermektedir. Sınıf II Tetramers çözünür biotinlenmiş sınıf II α / β floresan etiketli streptavidin çe...

<table><tbody><tr><td>Sınıf 2 Laminer akışlı biyogüvenlik kabini</td><td>ekipman</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1200</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>ekipman</td><td>VWR international</td><td>47747-182</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>1X PBS (Ca/Mg içermeyen)</td><td>reaktif</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>Ficoll-paque PLUS</td><td>reaktif</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>ışıktan korumak için folyoya sarılı</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP</td><td>ekipman</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>10 mL pipet</td><td>ekipman</td><td>Corning</td><td>CLS4492</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>Aerosolve Kanisterleri</td><td>ekipman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>359481</td><td>50 mL insertler ile</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>ekipman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>GS-6R</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>ekipman</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>202-20S</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td>ekipman</td><td>VWR international</td><td>14672-200</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>Hemolitik Tampon</td><td>reaktif</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodyum EDTA</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>PBS içinde %0.2</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>ekipman</td><td>VWR international</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>ekipman</td><td>VWR international</td><td>05-527-90</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>Çalışma Tamponu</td><td>reaktif</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td></tr><tr><td>MACS CD4+ T Hücre İzolasyon Kiti II</td><td>reaktif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-155</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>EasySep&amp;#174; Mıknatısı</td><td>ekipman</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polipropilen tüp</td><td>ekipman</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>22400-089</td><td>25 mM HEPES ile</td></tr><tr><td>Havuzlanmış insan serumu</td><td>reaktif</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>sağlıklı donörlerden alınmış, ısı ile inaktive edilmiş ve filtrelenmiş</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>1570-063</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>500mL 0.22 mikron şişe üstü filtre</td><td>ekipman</td><td>Nalge Nunc international</td><td>595-3320</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>48 kuyucuklu plaka</td><td>ekipman</td><td>Costar</td><td>3548</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; inkübatörü</td><td>ekipman</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>20 mg/mL sentetik peptit</td><td>reaktif</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Herhangi bir peptit sağlayıcısından özel sentez</td></tr><tr><td>5 mL FACS tüpü</td><td>ekipman</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>Polistiren</td></tr><tr><td>Peptit yüklü sınıf II tetramer (açıklandığı gibi)</td><td>reaktif</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>BRI tetramer çekirdeği tarafından hazırlanmış</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>reaktif</td><td>BD Biosciences</td><td>347344</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>reaktif</td><td>eBioscience</td><td>17-0049-73</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>Anti-CD25</td><td>reaktif</td><td>eBioscience</td><td>11-0259-73</td><td>Veya muadili</td></tr><tr><td>Facs Calibur Akış Sitometresi</td><td>ekipman</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Veya muadili</td></tr></tbody></table>

görselleştirme antijen spesifik cd4 + t hücreleri mhc sınıf ii tetramers kullanarak

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf II tetramers antijen spesifik CD4 + T hücrelerinin flow sitometri tarafından doğrudan görselleştirme izin verir. Bu yöntem son derece özel bir peptit yüklü MHC ve ilgili T-hücre reseptör arasındaki etkileşimi dayanıyor. MHC / peptid tek bir molekülün yakınlığı düşük olmasına rağmen, çapraz bağlama streptavidin ile MHC / peptid kompleksleri reaktifler boyama olarak kullanımını sağlamak, avidite etkileşimi artırır. CD4 + T hücreleri (~ 1 tek bir özgüllüğü 300.000) nispeten düşük frekanslarda bu testte in vitro amplifikasyon adımda bir algılama eşiğini artırmak için kullanır. Ficoll altında yatan periferik kan mononükleer hücreler temizlenir. CD4 + hücreler, daha sonra biotinlenmiş antikor kokteyli ve anti-biotin etiketli manyetik boncuklar kullanarak negatif seçimi ile ayrılır. CD4 hücre fraksiyonu yapışık hücrelere antijen hücreleri, CD4 + T hücrelerinin antijenik peptid ve IL-2 ekleyerek medya genişletilmiş biçimde sergileyen bir belge olarak kullanılması. Genişletilmiş hücreleri, bir saat 37 C&#39;de inkübe ve daha sonra lekeli, anti-CD4, anti-CD3 ve anti-CD25 gibi yüzey antikorları kullanarak ilgili sınıf II tetramer ile boyandı. Etiketleme sonra, hücreler flow sitometri ile analiz edilebilir. Tetramer pozitif hücreler genellikle genişletilmiş CD4 + hücreler arasında ayrı bir nüfus oluşturmaktadır. Tetramer pozitif hücreler genellikle CD25 + ve genellikle CD4 yüksek. Arka plan tetramer boyanma seviyesi farklılık gösterebilir, çünkü pozitif boyanma sonuçları her zaman ilgisiz bir tetramer aynı hücrelerin boyanması göre olmalıdır. Bu temel testinin Çoklu değişiklikler olabilir. Tetramer pozitif hücrelerin daha fazla fenotipik analiz, ELISPOT veya çoğalması testleri dahil, ya da diğer ikincil testleri için sıralanır olabilir. Bazı gruplar aynı zamanda co-boyama tetramers ve anti-sitokin veya anti-FoxP3 antikorları kullanarak göstermiştir.

Bu prosedür, arıtma gösteriyor ve in vitro antijen spesifik CD4 + T hücreleri, tüm periferik kan ve MHC sınıf II tetramers kullanarak görselleştirme genişleme. Tetramers tek bir antijen özgüllüğü ve tanımlanan MHC sınıf II kısıtlama ile T hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verir.

Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf II tetramerleri, antijen spesifik CD4+ T hücrelerinin akış sitometrisi ile doğrudan görüntülenmesine olanak tanır. Bu yöntem...

Teer analizinin gerçekten benzersiz olan yanı, antijen spesifik T hücrelerini doğrudan görselleştirmenize olanak tanımasıdır. Teer, analizimizin temel benzersiz özelliğidir. Bu durum, gerçekleştirdiğimiz bir amplifikasyon adımıyla birleştirilmiştir.Biliyorsunuz, T hücrelerini izole ediyoruz ve ardından onları, örneği ilgilendiğimiz T hücreleri açısından zenginleştiren bir ortamda büyütüyoruz. Böylece, sadece bu hücreleri spesifik olarak işaretleyebiliyor ve onları bir akış sitometresinde görselleştirebiliyoruz. Dolayısıyla, onlarca yıldır kullanılan CFSE veya proliferasyon analizleri gibi önceki yöntemlerle elde ettiğiniz şey, tüm T hücresi popülasyonunda neler olup bittiğine dair genel bir toplu ölçümdür.Ancak vücutta milyonlarca T hücresi bulunur ve bunlar oldukça çeşitli bir desen kümesi görürler. Şanslıysanız, örnekteki hücrelerin belki her 200.000 ila 300.000'de bir tanesi aradığınız hücre olacaktır. Bu analizde zenginleştirme adımlarının uygulanmasının nedeni de budur.Ardından bir test numarasıyla ve doğrudan boyama yaptığınız için, toplam hücre sayısının %1'inden daha az olan bir popülasyonu arka plandan ayrılarak görselleştirebilirsiniz. Böylece çok çok küçük farkları göreb

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma...

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

Bu videoda, peptit majör histouyumluluk kompleksi sınıf I (pMHC-I) tetramerleri kullanılarak simian immün yetmezlik virüsüne (SIV) özgü CD8+ bellek T hücrelerinin karakterize edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Bir pMHC-I tetrameri, SIV'e özgü peptitlere bağlı ve bir florofora konjuge edilmiş dört MHC-I molekülünden oluşan bir komplekstir. Bu tetramerler, SIV'e özgü CD8 + T hücreleri üzerindeki T hücresi reseptörlerine (TCR'ler) seçici olarak bağlanır ve bu hücrelerin karakterizasyonunu...

SIV'e Özgü CD8+ Bellek T Hücrelerini Analiz Etmek için Bir Peptit-MHC-I Tetramer Boyama Tekniği

MHC kompleksi sınıf II dextramers ile direkt boyama ile beyin ve kalp kendinden reaktif CD4 T hücreleri algılamak için protokol bu raporda tarif edilmiştir. Kapsamlı bir analiz için in situ antijene özgü CD4 + T hücrelerinin frekansları numaralandırmak için güvenilir bir yöntem de planlanmaktadır.

Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti

Bir murin aşılama modelinde nanopartiküllerle bağışıklamaya yanıt olarak antijene özgü CD8+ T hücrelerinin genişlemesini izlemek için tüm hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi tabanlı teknikleri açıklıyoruz.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Burada, AIDS virüsü karşısında Rhesus macaque CD8 + T hücreleri, numaralandırma ve karakterize etmek için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bu makale, HIV immünoloji alanında değil, aynı zamanda CD8 + T hücre yanıtları hastalık sonucunu etkileyebilecek bilinen biyomedikal araştırmanın diğer bölgelerine sadece yararlıdır.

Maymun bağışıklık eksikliği virüsüne özgü CD8 analizi + Peptid MHC-I tetramer boyama ile Rhesus macaque maymunlarının T-hücrelerinin

Burada, situ MHC-tetramer boyama immünhistokimya yerelleştirme, fenotip ve dokularda antijen spesifik T hücrelerinin miktarını belirlemek ile bir araya getiren bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı diğer hücre tipi ve dokularda yapıları göreli antijen spesifik CD8 T hücrelerinin kayma ve fenotipik özellikleri belirlemek için kullanılır.

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

Burada, eski için bir iletişim kuralı mevcut antijen spesifik CD8 vivo nitel tespiti+ T hücreleri. Analiz tek hücre süspansiyonlar organları veya küçük miktarda kan ile mümkündür. Çok çeşitli çalışmalar sitotoksik T hücre yanıt (aşı ve kanser immünoterapi çalışmaları) analizini gerektirir.

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Bu iletişim kuralı açıklar tek zinciri MHC sınıf ı insan CD8 + T hücre aktivasyonu moleküler etkileşimlerde araştırmaya kompleksleri: mühendislik antijen sunan tek zincir ifade hücreleri nesil oluşturur, kültür insan CD8 + T hücre klonu ve T hücre aktivasyonu deneyler.

Tek zincir MHC Co-agonism insan CD8 + T hücre aktivasyonu içinde araştırmak için teknoloji kullanımı

Bu makalede, in vitro ve in vivo kullanılmak üzere fonksiyonel T hücrelerinin yüksek sayıda verim amacı ile, antijene özgü CD8 T hücrelerinin üretimi ve bunların in vitro genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Manyetik boncuk bazlı T hücresi zenginleştirmesi ve peptit: majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri aracılığıyla fare akciğerlerindeki nadir antijene özgü T hücresi popülasyonlarını izole etmek ve tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri

Öğrenin antijen spesifik CD4+ T hücrelerini MHC Sınıf II tetramerler kullanarak görselleştirme yöntemini. Bu teknik, akış sitometrisi ile bağışıklık yanıtlarını hassas şekilde incelemeyi sağlar.

Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Daha fazla video keşfet