Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Teer testinin gerçekten benzersiz yanı, antijenspesifik T hücrelerini doğrudan görselleştirmenize olanak sağlamasıdır. Te, teer, testimizin ana benzersiz yönüdür. Bu, yaptığımız bir amplifikasyon adımıyla birleşiyor.

Biliyorsunuz, T hücrelerini izole ediyoruz ve sonra ilgilendiğimiz T hücreleri için örneği zenginleştiren bir ortamda yetiştiriyoruz. Sonra, sadece bu hücreleri özel olarak etiketleyip akış sitometresinde görselleştirebiliyoruz. Ve önceki testlerde, CSFE veya proliferasyon testleri gibi onlarca yıldır var, elde ettiğiniz şey tüm T hücresi popülasyonunda neler olup bittiğine dair genel bir toplu ölçüm.

Ama vücutta milyonlarca T hücresi var ve onlar çok çeşitli desenler görüyor. Şanslıysanız, örnekteki hücrelerin iki ila 300.000 hücresinden biri baktığınız hücre olur. İşte bu yüzden bu test, zenginleştirme adımlarını yapıyor.

Ve sonra bir test numarasıyla, doğrudan boyama yaptığınız için, arka plandan uzakta toplam hücre sayısının %1'inden az bir popülasyonu görselleştirebilirsiniz. Yani çok küçük farklar görebilirsiniz ve o kan örneğindeki T hücrelerinin sayısının oldukça kesin bir sayını elde edebilirsiniz; yani o kişide sizin ilgi deseninizi tanıyan. Ama burada bitmiyor çünkü teterler sadece T hücrelerini etiketlemekle kalmayıp, onları daha fazla analiz için izole etmenizi de sağlıyor.

Ve kullandığınız teterler aslında BRI'de yapılıyor, doğru mu? Evet. Ülkede ikinci sınıf teter yapan çok az sayıda laboratuvardan biriyiz. Amacımız, bu reaktifleri, bu teknolojiyi ithal etmekle ilgilenen laboratuvarlara maliyetleriyle dağıtmaktır.

Bu testin diğer laboratuvarlarda tekrarlanması söz konusu olduğunda en zor veya zorlayıcı yönleri nelerdir? Düşündüğümde, aslında iki tane var, T hücrelerinin büyümesi. Gerçekten biraz sanat gibi bir şey.

Hücrelerin ek besinlere veya büyümek için ekstra alana ihtiyacı olup olmadığı konusunda neredeyse günlük kararlarınız var. Ve bence deneyimsiz bir operatör için muhtemelen en zor olan ikinci kısım ise aslında veri analizi. Sinyalin hangi kısmının gerçekten olumlu yanıt olduğunu, hangisinin ise sadece fizik ve çekimin doğasında olduğunu anlamak.

Ve her şeyin bir dereceye kadar yapışkan olması da çok fazla deneyim gerektiriyor, özellikle genel tepkinin biraz zayıf olacağı bir ortamda. Bu testle üreteceğiniz bilgilerin hastalara şu anda fayda sağlama potansiyeli nedir? Herhangi bir otoimmün hastada ortaya çıkan ilk işaretlerden biri, o hastalığa özgü bir antikor takımyıldızıdır.

İmmünolojinin temel temellerinden biliyoruz ki, her antikor yanıtı varsa, önce her zaman bir T-hücresi yanıtı vardır. Risk altındaki bireylere bakıp antikor oluşumundan önce T hücresi aktivitesindeki sıçramayı görebilsek, bu bize yeni bir risk seviyesini tanımlamamıza yardımcı olur ya da bireylerin otoantikorlara doğru ilerlediğini belirtir, bu da umarız enterventif tedaviler için bir pencere açar. Bu prosedür, antijene özgül CD dört pozitif T hücrelerini arıtacak ve genişletecek ve teter reaktifleri ile ekipman sınıf iki laminar akış biyogüvenlik dolapları kullanılarak görselleştirecektir.

Burası işlemin ana çalışma alanı olacaktır. 50 mililitrelik konik tüpler, PBMC izolasyonu için birincil tüp, bir XPBS. Bu, kalsiyum ve magnezyum içermeyen foli paketi ve hafif davullu pipet yardımından koruma amacıyla folga sarılmış CoStar 10 mil pipet aerosol kutuları olmalı, santrifüjde kan kontaminasyonunu önlemek için 50 mil insertler kullanılmıştır.

GS altı R santrifüj transfer pipetleri, Pasteur pipetleri hemolitik tampon ile litrede 8,3 gram. Amonyum klorür litrede 1.0 gram. Sodyum bikarbonat litrede 0,04 gram, DI sodyum EDTA trian mavisi 0,2% çözelti PBS hemo SITOMETRE 15 mililitre konik tüp koşma tamponu PBS içerir ve iki milimolar EDTA ile takviye edilir ve litrede beş gram bulunur.

BSA max CD dört izolasyon kiti iki, Milin biotech EP mıknatıs bloğu kök hücre teknolojileri'nden satın alındı. Diğer manyetik hücre zenginleştirme platformları da aynı etkinlikle kullanılabilir. Beş mililitrelik polipropilen tüp, RPMI 1640, T-hücreli ortam havuzlu insan serumu yapmak için kullanılan 25 milimoler hippilerle desteklenmiş, T-hücre ortamını desteklemek için kullanılan kalem şeridi, 500 mililitre, 0,22 mikron şişe kapaklı filtre, steril 48 kuyu plaka, in vitro genleşme kültürü için kullanılan, step 37 CO2 kuluçka makinesi, ilgilenilen epitopu içeren sentetik peptit çözeltisi için mililitrede 20 miligram.

Beş mililitrelik polistiren faks tüpü peptit yüklü sınıf iki teer, antijen özgül T hücrelerini, anti-CD üç, anti CD dört ve anti-CD 25 antikorları görselleştirmek için kullanılmıştır. İşleme başlamadan önce faks kalibresi akış sitometresi veya benzeri bir cihaz gönderin. Tüm malzemeleri ve ekipmanları çalışma alanınızda bir kenara toplayın.

Aşağıdaki gösterim aşağıdaki adımları kapsayacaktır. PBMC izolasyonu, CD dört pozitif T-hücre ayrımı in vitro genişleme kültürü, T hücrelerini teem veya boyama yoluyla görselleştirir. Birinci adım PBMC izolasyonu.

Kan örneği alın. Kan, pıhtılaşmayı önlemek için enjektör veya tüplerde veya şırıngalarda toplanmalı ve pıhtılaşmanı önlemek için bir'e 50 oranında heparinle antikoagülasyon yapılmalıdır; mililitre başına yaklaşık 1 milyon PBMC verimi beklenmelidir. Bunun yaklaşık %40'ı CD dört pozitif T hücresi olacaktır.

Kanı 50 mililitrelik konik tüplere koy. Tüp başına 25 mililitre kan. ALI pıhtılaşmasından önce kanı nazikçe karıştırarak plazmayı dağıtın.

PBS ekleyin, toplam hacmi 40 mililitre çıkarır ve 11 mililitre fial kurutularak kan tüpüne yerleştirilir ve pipetten pipetten dikkatlice çıkarılır. Fial yavaşça tüpün dibine akar. Seviye eşitlendikten sonra, pipeti yavaşça kan tüpünden çıkarın ve kan tüplerini atıp kutuların aerosolosuna geçin.

Kutuları ve santrifüjü 900 kat G hızında 20 dakika boyunca kesintisiz sıkıca kapatın. Bu spinin sonunda kırılma kuvveti hücre tabakasını rahatsız edeceği için bu spinin sonunda herhangi bir kırma uygulanmaması kritik öneme sahiptir. PBMC, yukarıdaki sarı plazma ile altındaki şeffaf fial arasında belirgin bir beyaz tabaka oluşturmalıdır.

Transfer pipetiyle beyaz kan hücresi tabakasını nazikçe çıkarıp yeni tüpe aktarın. Bir miktar plazma ve fial pbmc ile çekilebilir, ancak kırmızı hücre tabakasının herhangi bir kısmını çizmekten kaçının. Genellikle bu aşamada iki kan tüpü tek bir hücre tüpüne birleştirilebilir.

Pellet boyutunu artırmak için PBS eklenerek toplam hacmi 15 mililitre çıkarır ve düşük break'te 15 dakika boyunca 500 kat G ile santrifüj yapar ve kutuların aerosolun, peleti rahatsız etmemeye özen göstererek sıvıyı bir pipet ile aspire edilir. Her tüpe beş ila altı mililitre ekleyerek hemolitik tampon ile tedavi edin ve kümeleri nazikçe karıştırarak temizleyin. Beş dakikadan fazla inkubasyon yapman.

PBS ekleyin toplam hacmi 50 mililitre çıkarır ve 230 kat G ile 10 dakika boyunca santrifüj yaparsınız. Düşük kırıntılarda bu yavaş dönüşler için aerosol kutularına artık ihtiyaç yoktur. Son yıkama aşamasından önce 230 kat G ile 230 kez G ile iki kez aspirasyon sıvısını iki kez yıkayın, yeniden askıya alınmış hücrelerden oluşan bir aliquot çıkarın, trian mavisiyle seyreldin ve hemo sitometre ile sayın.

Bu hücre sayısı, T-hücre ayrımında kullanılan reaktif hacimlerini belirleyecektir. İkinci adım, CD dört pozitif T-hücre ayrımı, sıvı aspirasyon ve akan tampon eklemek için toplam hacmi 10 milyon hücre başına 40 mikrolitre çıkarır. Genellikle bunun için 30 mikrolitre tampon ve kalan pellet hacmi gerekir.

Bu hacmi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. CD dört izolasyon kitinden antikor kokteyli ekleyin, 10 milyon hücre başlığı için 10 mikrolitre kapağının tüpünü ve 10 dakika buzun üzerinde koyun. Buzdan tüpü çıkarın, kapağı çıkarın ve her 10 milyon hücreye 30 mikrolitre çalışan tampon ekleyin.

CD dört izolasyon kitinden manyetik boncuklar ekleyin. 10 milyon hücre başına 20 mikrolitre tüpü kapalı ve 15 dakika boyunca buz üzerinde koyun. 10 hacim koşma tamponu ekleyerek yıkama ve 230 kat G ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın.

Dönme sırasında, mıknatıst ve beş mililitrelik polipropilen tüpünü çalışma alanınıza yerleştirin. Hücre pelletinden sıvı çekin. İki mililitre koşma tamponu ekleyin ve transfer pipeti kullanarak kümeleri çıkarın.

Aynı transfer pipetiyle hücreleri beş mililitrelik tüpe aktarır ve mıknatısta 15 dakika kuluçka yapar. CD dört pozitif T-hücre fraksiyonunu dikkatlice işaretli 15 mil bir tüpe dedikt edin; mıknatısı ters çevirip son damla hariç hepsini boşaltın. Beş mililitrelik tüpe iki mililitre daha koşma tamponu ekleyin ve mıknatıstan çıkarın.

CD dört negatif hücreyi tüpün kenarlarından nazikçe duruyup işaretli 15 mil tüpe aktarın. Her tüpe iki mililitre T-hücreli ortam ekleyin. Hücre sayımı için aliquotları çıkarın ve 10 dakika boyunca 230 kez G ile santrifüj yapın.

Hücre aliquotlarını trian mavisiyle seyreldin ve hemo sitometre ile sayın. Bu hücre sayıları, genleşme kültürü için kullanılan kuyu sayısını belirler. Üçüncü adım.

In vitro genleşme kültürü, hücre sayılarına göre CD dört pozitif ve CD dört negatif hücre pelletlerinden sıvı aspirasyon yapar. CD'ye dört pozitif hücreye medya ekleyin ve hacmi mil başına 3 milyon hücreye ayarlayın. CD'ye dört negatif hücreye medya ekleyerek hacmi mil başına 10 milyon hücreye ayarlayın.

Genişleme kültürü için kuyu başına 3 milyon CD dört negatif hücre ve her kuyu başına iki ila 3 milyon CD dört pozitif hücre gereklidir. Genellikle, CD dört pozitif hücreler sınırlayıcı popülasyondur. Aliquot CD, 48 kuyuluğa uygun sayıda kuyu kutusuna dört negatif hücre yerleştirin.

Her birine 300 mikrolitre ekleyerek plakayı bir saat boyunca 37 derecelik kuluçka makinesine yerleştirin. Plakayı, kuluçka makinesini çıkarın, 500 mikrolitre taze ortam ekleyerek kuyuları yıkayın ve transfer pipeti ile 12-20 kez nazikçe pipetle pipetle tüm sıvıyı çıkarın. Bu yıkama, ardında yapışkan antijen sunan hücreler tabakası bırakır.

Yıkama tamamlandığında, her birinin tabanını ıslatacak kadar miktarda malzeme ekleyin, yaklaşık 100 mikrolitre. Aksi takdirde A yapışkan hücreler kuruyacaktır. Gerekirse her kuyuya iki ila 3 milyon CD dört pozitif hücre ekleyin.

Her kuyunun toplam hacmini bir mililitre çıkarmak için ek medya ekleyin. Her birine istenen peptidi ekleyin. Kuyu. Uyarı için tipik konsantrasyon mililitrede 10 mikrogramdır.

Son yerleştirme plakası yedi gün boyunca 37 derece kuluçka makinesinde. Yedi gün sonra. Her sonraki gün 50 mikrolitre hemo IL ekleyin, her kuyuya iki tane ekleyin.

Henüz birleşmemiş besleyici kuyuları mikroskopla hücre büyümesini izleyin; ortamın yarısını çıkararak, taze ortam ve 50 mikrolitre IL ekleyerek hücrelerin yarısını boş bir kuyuya taşıyarak resesli askıya alınarak iki bölünmüş birleşik kuyuyu ekleyin. Yeni ortam ve 50 mikrolitre IL iki dönüş hücresi inkubatöre eklendi. Genişleyen hücreler, 13 ila 15 günlük kültür sonrası teer boyamaya hazır olur.

Dördüncü adım, teer boyama yoluyla T hücrelerini görselleştirmek, teterleri peptite uyacak şekilde satın almak veya birleştirmek. CD'yi uyarmak için kullanılan MHC kombinasyonları dört pozitif T hücresidir. Tabağı kuluçka makinesinden çıkarın.

Her birinden medyanın yarısını dikkatlice çekin. Her kuyudan genellikle 75 mikrolitre veya yaklaşık 50.000 hücre olan bir hücre alkotu aktarın; faks tüpü genellikle her 50 mikrolitre bir mikrolitre aktarır ve bir saat boyunca 37 derece kuluçka kutusuna kalın. Ayrıca, her kuyunun ikinci bir aliquotunu uyumsuz bir teer ile negatif kontrol etiketi olarak boyanması tavsiye edilir; anti CD üç, anti CD dört ve anti CD 25 antikorları içerir.

Ek veya alternatif antikor belirteçleri kullanılabilir. Ancak, bu kanalın şu anda teemler için ayrılması gerektiğinden PE etiketli antikorlar kullanmayın. Ayrıca, tek renk veya izotip kontrollerini ekstra hücrelerle etiketleyin.

Antikor etiketli hücreleri dört derecede 15 ila 30 dakika kuluçka edin. Her tüpü 0,5 ila bir mililitre koşma tamponu ile yıkayın ve 230 kat G ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Faks tüplerinden dikkatlice sıvı boşaltın, referans boncuklar, tek renkli kontrol tüpleri, izotip kontrolleri ve benzeri yöntemlerle akış sitometresini kalibre edin.

Her tüpü akış sitometresi ile analiz edin. Tetra pozitif hücreler, genişletilmiş CD dört pozitif T hücresi arasında ayrı bir popülasyon olmalıdır. Tetra pozitif hücreler genellikle CD 25 pozitif ve genellikle CD 4 yüksek.I.