Name: Vaccinia Virüs Enfeksiyonu and Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Öğrenin, HeLa hücrelerinde vaccinia virüsü enfeksiyonu ve farklı zaman noktalarında RNA izolasyonu yöntemini. Bu teknik, viral gen ifadesi dinamiklerini analiz etmek için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Whitehead Enstitüsü&#39;nden Fellows Fonları

Bölüm 1: enfeksiyon ayarlama <ol><li> Matara HeLa hücreleri büyümek ve hücrelerin yaklaşık% 80 konfluent kadar bekleyin. </li><li> % 2 FBS ile düzenli DMEM ve ilavesiz antibiyotikler: deney için yeterli viral büyüme ortamı hazırlayın. </li><li> Enfeksiyon ya ham vaccinia virüs bilinen bir titreye sahip hisse senedi, ya da ev sahibi gen ekspresyonu ile ilgili endişeleriniz varsa, bilinen bir titreye sahip virüs saflaştırılmış sakaroz ile yapılabilir. </li><li> Doğrudan devam, sakaroz saflaştırılmış virüs kullanıyorsanız, bölüm 2. </li><li> Hemen önce enfeksiyonu, ham vaccinia virüs stok kullanıyorsanız, çoğunlukla buz banyosu ve bir miktar su ile bir bardak sonikatör virüsün bir kısım sonikasyon. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 30W yaklaşık 20 saniye boyunca sonikasyon. </li><li> Vorteks tüp ve buz ve soğuk dolu bardağı tutmak için gerekirse daha fazla buz ekleyerek, sonication 3 kez tekrarlayın. </li><li> Her sonication adım arasında vorteksleyin. </li><li> Bölüm 2 ile devam edin. </li></ul></li><li> Alternatif olarak, bir fincan sonikatör sahip değilse, ham virüs stok ve 0.25mg/mL tripsin eşit miktarda karıştırın. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Şiddetle Vortex. </li><li> 37 ° C su banyosunda 30 dakika süreyle virüs stok / tripsin karışımı inkübe. </li><li> 5-10 dakika aralıklarla Vortex. </li><li> Bölüm 2 ile devam edin. </li></ul></li></ol> Bölüm 2: Enfekte hücrelerin <ol><li> , Enfeksiyon istenen çokluğu (İçişleri Bakanlığı) tek tabaka bulaştırmak için gerekli viral parçacıkların miktarını hesaplayın. Tipik olarak, (5 ila 10) İçişleri Bakanlığı, yüksek enfeksiyon timecourses için kullanılır. </li><li> 37 sakaroz saflaştırılmış virüs veya tripsinize ham virüs istenilen miktarda ° C viral büyüme medya ve iyice karıştırın. Sadece balonun alt kapağı için yeterli medyayı kullanmak gerekir. Örneğin, medya bir T-175 şişesinde 10 ml. </li><li> Hücrelerden medyayı çıkartın ve oda sıcaklığında PBS ile durulayın. </li><li> Her balona virüs / viral büyüme ortamı ekleyin. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Nazikçe Swirl, 37 ° eğim plakaları ve inkübe ° C 1 saat süreyle% 5 CO2 inkübatör. </li><li> Tilt ve girdap levhalar her 15 dakikada düzgün virüs yaymak ve hücrelerinin nemli tutmak için. </li><li> Bir 0hr/Mock zaman noktası için, hiçbir virüs, sadece viral büyüme medya ekleyebilirsiniz. </li></ul></li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, virüsü içeren medyayı çıkartın ve oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Her balona viral büyüme ortamının maksimum miktarda ekleyin. Örneğin, medya bir T-175 şişesinde 30 ml. 0 saat zaman noktası olarak sayma başlayın. </li></ol> Bölüm 3: Hasat hücreleri <ol><li> Hücrelerin mikroskop altında kontrol edin ve herhangi bir sitopatik etki (CPE) not edin. </li><li> Medyayı çıkartın ve oda sıcaklığında PBS 30 ml ile durulayın hücreleri. </li><li> Tripsin 15 mL hücrelere ekleyin ve 37 2-5dk inkübe ° C. </li><li> Hücre ayrılması için mikroskop altında kontrol edin ve hücreleri çıkarmak için şişeyi hafifçe dokunun. </li><li> Hücreleri, steril bir serolojik pipet yardımıyla 50 ml konik bir tüp içine aktarın. </li><li> Hücre büyümesi medya eşit hacmi ile şişesi yıkayın ve konik tüp tripsinize hücreleri için ortam ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Hücre pelet tripsin / medya çıkarın. </li><li> İstediğiniz RNA izolasyon kiti TRIzol reaktif veya lizis tamponu ya da hücre pelletini tekrar. </li><li> TRIzol kullanıyorsanız, -80 1.5mL etiketli Eppendorf tüpleri ve dondurma 1 ml alikotları örnek bölmek ° C </li><li> Zaman noktası başına bir şişeyi hasat, tüm zamanların noktaları için tekrarlayın. </li></ol> Bölüm 4: TRIzol numune RNA ekstraksiyonu <ol><li> Bu noktada, örnekleri işlenecek hazır TRIzol reaktif yeniden bekletildi ve olmalıdır. </li><li> Her bir tüp içinde TRIzol her 1 mL BCP Faz Ayırma Reaktif 200μL ekleyin. TRIzol büyük bir miktarı ile başlıyor, daha büyük bir tüp örnek aktarmak gerekebilir. </li><li> Vortex veya kuvvetlice çalkalanır ve oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. </li><li> 15 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de örnek santrifüjleyin. </li><li> Sulu faz temiz bir tüpe aktarın. Sulu faz açık üst katmanı. Ile başlayan TRIzol her 1 ml için yaklaşık 600μL kurtarmak olmalıdır. </li><li> BCP yerine ikinci bir fenol / kloroform ekstraksiyon, 1 ml TRIzol başına kloroform 500μL kullanarak bu kez yapın. </li><li> Vortex veya kuvvetlice çalkalanır ve oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. </li><li> 15 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de örnek santrifüjleyin. </li><li> Sulu faz temiz bir tüpe aktarın. Sulu faz açık üst katmanı. </li><li> Her bir örnek için doğrusal akrilamid 20μg ekleyin. Doğrusal akrilamid bir taşıyıcı gibi davranır ve RNA&#39;yı çöktürmek için yardımcı olur. </li><li> Ekle 500 &amp; micro; izopropanol L TRIzol 1 ml başına her bir örnek ile başladı ve iyice karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında numune inkübe edin. </li><li> 10-15 dakika maksimum hızda bir mikrosantrifüj santrifüjleyin. </li><li> RNA pelet tüpün alt kısmında görünür olacaktır. Çok dikkatli bir şekilde, bir vakum aspiratör ile, ya tüpten süpernatantı kaldırmak veya elle pipet. Pelet rahatsız etmeyin. </li><li> Pelet 1 ml% 70 etanol ile yıkayın. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Pelet için 1 ml% 70 etanol ekleyin. </li><li> En yüksek hızda 5-7 dakika boyunca 14.000 g santrifüjleyin. </li><li> Çok dikkatli bir şekilde, bir vakum aspiratör ile, ya etanol tüpten kaldırmak veya elle pipet. Pelet tüpün alt kısmında görünür olduğunu kontrol edin. </li><li> Süpernatantı atın. </li></ul></li><li> Yıkama adımı yineleyin. Süpernatantı atılır sonra pelet tüp işaretleyin. </li><li> 5 dakikadan daha uzun süre Hava kuru pelet. Overdry, yoksa RNA sulandırmak için zor olacak! </li><li> Kalan herhangi bir DNA numune kaldırmak için isteğe bağlı DNaz tedavisini takip etmek isterseniz, nükleaz içermeyen su 17μL pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Aksi takdirde, nükleaz ücretsiz su 20μL pelet tekrar süspansiyon ve 22 adıma geçin. </li><li> (Opsiyonel DNaz tedavi) Qiagen RNaz-free DNaz seti kullanarak, 2μL Tampon RDD ve 1μL RNaz yeniden süspanse RNA ücretsiz DNaz sulandırılmış eklemek. Yavaşça karıştırın. </li><li> (Opsiyonel DNaz tedavi) 37 ° C&#39;de 30 dakika. </li><li> (Opsiyonel DNaz tedavi) 2.5 mM EDTA ve inkübe 2μL 65 ° C 5 dakika DNaz inaktive. Kat daha uzun / yüksek sıcaklıklarda RNA düşmesine neden olarak inaktivasyon zaman veya sıcaklık aşmayın. </li><li> Spektrofotometre tarafından RNA konsantrasyonu kontrol edin. </li><li> -80 ° C&#39;de RNA örnek Mağaza </li><li> (Opsiyonel QC) Agilent BioAnalyzer kullanarak RNA kalitesini kontrol edin, ya da örnek denatüre edici bir jel üzerinde çalışıyor ve OD okumaları kontrol. (260nm ve 260/280 oranı) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Kritik Adımlar Part 1 &amp; 2 Senkron vaccinia enfeksiyonu kurma pek çok kritik adımlar vardır, virüsün ilk olmanın dikkatli sonication (veya trypzinizing), virüs parçacıkları parçalara ayırma için. Vaccinia toplayarak için son derece eğilimli ve virüs parçacıkları bozulması hücre bile enfeksiyon sağlamak için önemlidir. Senkron bir enfeksiyon ulaşmak için (2&#39;den fazla), İçişleri Bakanlığı, her bir hücre enfekte yüksek sağlamak için kullanılan olmalıdır. Enfekte v...

<table><tbody><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Roche'tan TriPure gibi benzer reaktifler de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>BCP Faz Ayrımı Reaktifi</td><td>Reaktif</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Seti</td><td>Reaktif</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNase işlemi isteğe bağlı bir adımdır.</td></tr></tbody></table>

vaccinia virüs enfeksiyonu &amp; virus gen İfadesi zamansal analizi: bölüm 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Aile<em&gt; Poxviridae</em&gt; Sadece enfekte hücrelerin sitoplazmasında çoğaltmak virüsler içeren büyük çift iplikli DNA oluşur. Üyeleri<em&gt; Orthopox</em&gt; Cinsine dahil variola, insan küçük çiçeği etkeni, monkeypox ve vaccinia (VAC), virüs aile prototipik üyesi. Göreceli olarak büyük (~ 200 kb) vaccinia genom içinde gen üç sınıfa kodlanır: erken, orta ve geç. Her üç sınıf, viral kodlanmış RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu olsa da, her sınıf, virüsün yaşam döngüsü içinde farklı bir fonksiyon sunar. Poxviruses enfeksiyon sırasında ev sahibi hücresel ortamı modülasyonu için çoklu stratejiler kullanmaktadır. Hem ev sahibi hem virüs gen ekspresyonu düzenlenmesi anlamak için, biz, hem virüs ve konak hücrelerine transkript bolluk analiz etmek için genom yaklaşımlar kullanılmaktadır. Burada, birkaç saat sonrası enfeksiyon Vaccinia virüs ve örnekleme RNA HeLa hücrelerinde zaman ders enfeksiyonları göstermektedir. Her iki konak ve viral toplam RNA gen ekspresyonu analizi için mikroarray&#39;ler hibridizasyon için izole edilmiş ve yükseltilir.

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Poxviridae ailesi, yalnızca enfekte hücrelerin sitoplazmasında replike olan, büyük çift sarmallı DNA içeren virüslerden oluşur. ... üyeleri

Vaccinia virüsü kullanılarak HeLa hücrelerinin zaman seyirli enfeksiyonları, viral enfeksiyonların hazırlanması, hücrelerin enfekte edilmesi ve ardından enfeksiyondan sonraki çeşitli zaman noktalarında enfekte hücrelerden RNA'nın toplanmasıyla başlar. Bu RNA, daha sonra gen ekspresyon analizleri için mikro dizilerle hibridizasyon amacıyla amplifiye edilebilir. Merhaba, ben Whitehead Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'ndeki Kate Irvins laboratuvarından Judy Ann.Bugün size, memeli hücrelerde vaccinia virüsü ile zaman serili bir enfeksiyon prosedürünü ve ardından enfeksiyon sonrası farklı zaman noktalarında enfekte hücrelerden RNA ekstraksiyonunu göstereceğiz. Bu teknik, virüsün enfeksiyon sırasındaki gen ekspresyonunu değerlendirmek amacıyla RNA'nın ekstrakte edilmesini ve amplifiye edilmesini hedefleyen ve diğer iki JoVE videosu ile tamamlanacak olan daha geniş kapsamlı bir protokolün başlangıç adımıdır. Öyleyse başlayalım. Enfeksiyon kurulumu için, HeLa hücrelerini flasklarda büyütün ve hücreler yaklaşık %80 konfluense ulaşana kadar bekleyin.Ardından, deney için yeterli miktarda viral büyüme ortamı hazırladığınızdan emin olun. %2 FBS içeren ve antibiyotik eklenmemiş standart DMEM kullanarak, enfeksiyon işlemi ya bilinen titreye sahip stok vaccinia virüsü ile ya da bilinen titreye sahip sükrozla saflaştırılmış virüs ile gerçekleştirilebilir. Konakçı gen ekspresyonu konusunda endişeleriniz varsa ve sükrozla saflaştırılmış virüs kullanıyorsanız, bir sonraki bölüme geçiniz.Kaba vaccinia virüsü kullanıyorsanız, enfeksiyondan hemen önce virüs stokunu sonikasyona tabi tutun ve alikotlara ayırın; çoğunlukla buz ve az miktarda su içeren bir banyo içinde, yaklaşık 30 W güçte 20 saniye boyunca sonikasyon uygulayın. Tüpü vorteksleyin ve sonikasyonu üç kez tekrarlayın; kabın buzla dolu ve soğuk kalması için gerekirse daha fazla buz ekleyin, her sonikasyon adımı arasında vortekslemeyi ihmal etmeyin. Eğer bir cup ator cihazınız yoksa, kaba virüs stoğundan eşit hacimde, mililitrede 0,25 miligram olacak şekilde karıştırın.Virüs stok şeritlerini tripsin ile güçlüce vorteksleyin ve 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe ederek karıştırın. Hücreleri enfekte etmek için her beş ila 10 dakikada bir vorteksleyin. Öncelikle, tek tabakayı istenen enfeksiyon çokluğuyla enfekte etmek için gereken viral partikül miktarını hesaplayın.Veya MOI. Enfeksiyon zaman serileri için tipik olarak 5 ile 10 arasında yüksek bir MOI kullanılır. Ardından, istenen miktarda sükrozla saflaştırılmış virüsü veya ham tryp virüsünü 37 °C'ye ayarlanmış viral büyüme besiyerine ekleyin ve iyice karıştırın.Flaskın tabanını tam olarak kaplayacak miktarda besiyeri kullanmalısınız. T 1 75 flask için 10 milliliters besiyeri yeterli olacaktır. Besiyerini hücrelerden uzaklaştırın ve oda sıcaklığındaki PBS ile durulayın.Sıfırıncı saat kontrol zaman noktası için her bir flaska virüsü veya viral büyüme ortamını ekleyin. Virüs eklemeden sadece viral büyüme ortamını ekleyin, nazikçe çalkalayın ve plakaları %5CO2'li bir inkübatörde 37 °C'de bir saat boyunca inkübe etmek üzere eğimli konuma getirin. Virüsün homojen dağılması ve hücrelerin nemli kalması için plakaları her 15 dakikada bir eğmeye ve çalkalamaya dikkat edin.İnkübasyon sonrası, virüs içeren medyumu uzaklaştırın ve oda sıcaklığındaki PBS ile üç kez durulayın. Her bir flaska maksimum miktarda viral büyütme medyumu ekleyin.Örneğin, T 1 75 flask için 30 mililitre besiyeri. Bunu, istediğiniz zaman noktasında sıfırıncı saat zaman noktanız olarak saymaya başlayabilirsiniz. Enfeksiyon sonrası hücreleri mikroskop altında inceleyin ve herhangi bir sitopatik etkiyi veya CPE'yi not edin.Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri 30 mililitre oda sıcaklığındaki PBS ile durulayın. Ardından, hücrelerin üzerine 15 mililitre tripsin ekleyin ve iki ila beş dakika inkübe edin. 37 °C'de, mikroskop altında hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin ve hücrelerin yerinden oynamasını sağlamak için flask'a hafifçe vurun.Hücreleri steril bir serolojik pipetle 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Flaskı eşit hacimde hücre büyüme ortamı ile yıkayın ve bu ortamı konik tüpteki tripsinize edilmiş hücrelere ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 Gs hızında santrifüjleyin.Santrifüjden sonra, hücre peletinden besi ortamını uzaklaştırın; hücre peletini ve seçtiğiniz RNA izolasyon kitindeki trizol reaktifini veya lizis tamponunu kullanarak yeniden süspande edin. Trizol kullanıyorsanız, örneği 1 mL'lik kısımlara ayırıp 1,5 mL'lik etiketli ependorf tüplerine aktarın ve -80 °C'de dondurun. Tüm zaman noktaları için işlemi tekrarlayın.Her zaman noktası için bir flask hasat edilir. Bu noktada, örneğiniz yeniden süspande edilmiş, triol reaktifi eklenmiş ve işlemeye hazır olmalıdır. 200 µL BCP faz ayırma reaktifi ekleyin.Her tüpteki her bir mililitre triol için, fenol yerine BCP veya bir bromo üç kloropropan kullanılır. Genomik DNA kontaminasyonunu azaltmak için örneği daha büyük bir tüpe aktarmanız gerekebilir. İşleme büyük miktarda triol ile başlıyorsanız, vorteksleyin veya şiddetle çalkalayın ve oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe edin; inkübasyon sonrası örneği 12,000 g'de 15 dakika santrifüjleyin.Üstte şeffaf bir tabaka şeklinde bir sulu faz görülmelidir. Sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Başlangıçta kullandığınız her bir mililitre triazole karşılık yaklaşık 600 microliters geri kazanmalısınız.İkinci bir fenol kloroform ekstraksiyonu yapın. Bu kez BCP yerine, her bir mililitre triazol için 500 µL kloroform kullanın. İkinci kloroform ekstraksiyonu, ekstraksiyondan kalan organik çözücü izlerini gidermek için kullanılır; çünkü eser miktardaki kalıntılar bile sonraki amplifikasyon basamaklarını inhibe edebilir.Vorteksleyin veya kuvvetlice çalkalayın, ardından oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkube edin. Santrifüjden sonra numuneyi 12,000 GS hızında 15 dakika santrifüjleyin. Üst fazı yeni bir tüpe aktarın.Sulu fazın üstteki berrak tabaka olduğunu unutmayın. Ardından, her örneğe 20 micrograms lineer akrilamid ekleyin. Lineer akrilamid, taşıyıcı görevi görerek RNA'nın çöktürülmesine yardımcı olur.Her bir örneğe, başlangıçtaki her 1 mililitre triol için 500 µL izopropanol ekleyin ve karıştırın. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sonrası örnekleri bir mikrosantrifüjde maksimum hızda 10 ila 15 dakika santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra RNA peleti tüpün dibinde görünür olacaktır.Süpernatantı, vakumlu bir aspiratörle veya manuel olarak pipetle tüpten çok dikkatli bir şekilde uzaklaştırın. Peleti rahatsız etmeyin. Peleti 1 mL %70 etanol ile yıkayın ve maksimum hızda beş ila yedi dakika santrifüjleyin.Çok dikkatli bir şekilde. Etanolü tüpten ya bir vakumlu aspiratörle ya da pipetle manuel olarak uzaklaştırın. Süpernatantı atın.Peletin tüpün dibinde görünür olduğundan emin olun. Süpernatant atıldıktan sonra bu yıkama adımını tekrarlayın. Peletin tüp üzerindeki konumunu işaretleyin.Peleti beş dakikadan fazla olmamak kaydıyla havada kurutun. RNA'nın yeniden çözünmesini zorlaştıracağı için aşırı kurutmayın. Ardından, DNA işlemi planlanmışsa, peleti 17 µL nükleaz içermeyen su içerisinde süspanse edin.D'S tedavisi planlanmıyorsa, resus 20 µL içinde süspande edin. D'S tedavisi için KaiGen RNA free DNA setini kullanın. İki µL tampon, RDD ve bir µL yeniden konfigüre edilmiş RNA free ekleyin.Resüspande edilmiş RNA ile DNA'lar karıştırılıp 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edilir. Ardından, 2,5 mM EDTA'dan iki µL ekleyin ve 65 °C'de beş dakika inkübe edin. DNA'yı inaktive etmek için inaktivasyon süresini veya sıcaklığını aşmayın; çünkü daha uzun süreler ve daha yüksek sıcaklıklar RNA'nın degradasyonuna neden olabilir.DNA işlemi tamamlandı. RNA konsantrasyonunu spektrofotometre ile kontrol edin. Fenol veya BCP kalıntıları, 260 nanometredeki standart pikin ötesinde, 270 nanometrede bir yükselme şeklinde tespit edilebilir.Ekstraksiyon sonrası toplam RNA'nın absorbansı ölçüldüğünde, eğer böyle bir kontaminasyon görülürse, amplifikasyona geçmeden önce filtre veya kolon tabanlı bir RNA ekstraksiyon yöntemi kullanarak RNA'yı geri kazanın. RNA örneğini -80 °C'de saklayabilirsiniz. Arzu ederseniz, bir Agilent bioanalyzer kullanarak veya örneği denatüre edici bir jelde yürütüp bioanalyzer üzerindeki OD okumalarını kontrol ederek RNA kalitesini kontrol edebilirsiniz.İyi RNA kalitesi, RNA bütünlük numarası veya RIN ile belirtilir. RIN, birin en bozunmuş profil, onun ise en sağlam profil olduğu, birden ona kadar uzanan bir numaralandırma sistemine dayanır. Size az önce, vaccinia virüsü ile zaman serili enfeksiyonun nasıl gerçekleştirileceğini ve enfeksiyon sonrası çeşitli zaman noktalarında enfekte hücrelerden RNA'nın nasıl ekstrakte edileceğini gösterdik.Bu prosedür uygulanırken, senkronize bir vaccinia enfeksiyonu kurulumunda birkaç kritik adım olduğunu hatırlamak önemlidir. İlk olarak, virüsün dikkatli bir şekilde sonikasyonla veya tripsinizasyonla işlenmesi gerekir. Vaccinia agregasyona oldukça yatkın olduğundan ve bu durum hücrelerin eşit şekilde enfekte olmasını engelleyeceğinden, virüs partiküllerinin agregatlarının çözülmesi önemlidir.İkinci olarak, asenkron enfeksiyondan kaçınmak için her hücrenin enfekte olduğundan emin olmak amacıyla iki'den büyük yüksek bir MOI kullanılmalıdır. Enfekte ve enfekte olmamış hücrelerin karışımı, birden fazla enfeksiyon döngüsüne, zaman noktalarının heterojen karışımlarına ve asenkron viral ve konakçı transkripsiyonel yanıtlara yol açacaktır. Üçüncü olarak, virüsün hücreler tarafından maksimum düzeyde emilmesini sağlamak için enfeksiyon, minimum miktardaki medyumda gerçekleştirilmelidir.Ek olarak, erlenin veya kültür kaplarının her 10 dakikada bir düzenli olarak çalkalanması, virüsün erlen içine dağılmasını sağlar ve hücrelerin kurumasını önler. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.RNA örneklerinin lineer amplifikasyonu ile floresan işaretli RNA'nın hazırlanması ve temizlenmesi prosedürlerini gösterdiğimiz bu serideki diğer videoları izlediğinizden emin olun.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. 3 Bölüm...

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Bölüm 3 floresan boyalar amino alil kaplin hem ev sahibi hem viral örnekleri amplifiye RNA etiketleme süreci anlatılmaktadır. 3 Bölüm...

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3

Viral enfeksiyon katılan Roman konakçı faktörleri fonksiyonu RNAi tarama hücre tabanlı genom zarara tespit edilebilir.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Oncolytic virüsler kanser tedavileri için umut vericidir. Tedavisi öncesinde hastalar elde edilen canlı doku örneklerinin infectability tespit etmek için bu tedavi yaklaşımı yeteneği benzersiz bir avantaj. Bu protokol için dokuların süreci...

Ex Vivo Enfeksiyon Oncolytic Virüsler Canlı Doku

Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında nükleer-için-sitoplazmik translocation uğrar. Bu olay moleküler mekanizması bilinmemektedir. Burada biz confocal mikroskop ICP0 translocation gelecek mekanik çalışmalarda kantitatif analiz etmek için zemin bırakır HSV-1 enfeksiyonu hareketinde ICP0 ölçmek için bir araç olarak nasıl kullanılacağını açıklar.

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

Öğrenin, HeLa hücrelerinde vaccinia virüsü enfeksiyonu ve farklı zaman noktalarında RNA izolasyonu yöntemini. Bu teknik, viral gen ifadesi dinamiklerini analiz etmek için temel oluşturur.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Daha fazla video keşfet