Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Vaccinia virüsü kullanılarak HeLa hücrelerinin zaman seyirli enfeksiyonları, viral enfeksiyonların hazırlanması, hücrelerin enfekte edilmesi ve ardından enfeksiyondan sonraki çeşitli zaman noktalarında enfekte hücrelerden RNA'nın toplanmasıyla başlar. Bu RNA, daha sonra gen ekspresyon analizleri için mikro dizilerle hibridizasyon amacıyla amplifiye edilebilir. Merhaba, ben Whitehead Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'ndeki Kate Irvins laboratuvarından Judy Ann.

Bugün size, memeli hücrelerde vaccinia virüsü ile zaman serili bir enfeksiyon prosedürünü ve ardından enfeksiyon sonrası farklı zaman noktalarında enfekte hücrelerden RNA ekstraksiyonunu göstereceğiz. Bu teknik, virüsün enfeksiyon sırasındaki gen ekspresyonunu değerlendirmek amacıyla RNA'nın ekstrakte edilmesini ve amplifiye edilmesini hedefleyen ve diğer iki JoVE videosu ile tamamlanacak olan daha geniş kapsamlı bir protokolün başlangıç adımıdır. Öyleyse başlayalım. Enfeksiyon kurulumu için, HeLa hücrelerini flasklarda büyütün ve hücreler yaklaşık %80 konfluense ulaşana kadar bekleyin.

Ardından, deney için yeterli miktarda viral büyüme ortamı hazırladığınızdan emin olun. %2 FBS içeren ve antibiyotik eklenmemiş standart DMEM kullanarak, enfeksiyon işlemi ya bilinen titreye sahip stok vaccinia virüsü ile ya da bilinen titreye sahip sükrozla saflaştırılmış virüs ile gerçekleştirilebilir. Konakçı gen ekspresyonu konusunda endişeleriniz varsa ve sükrozla saflaştırılmış virüs kullanıyorsanız, bir sonraki bölüme geçiniz.

Kaba vaccinia virüsü kullanıyorsanız, enfeksiyondan hemen önce virüs stokunu sonikasyona tabi tutun ve alikotlara ayırın; çoğunlukla buz ve az miktarda su içeren bir banyo içinde, yaklaşık 30 W güçte 20 saniye boyunca sonikasyon uygulayın. Tüpü vorteksleyin ve sonikasyonu üç kez tekrarlayın; kabın buzla dolu ve soğuk kalması için gerekirse daha fazla buz ekleyin, her sonikasyon adımı arasında vortekslemeyi ihmal etmeyin. Eğer bir cup ator cihazınız yoksa, kaba virüs stoğundan eşit hacimde, mililitrede 0,25 miligram olacak şekilde karıştırın.

Virüs stok şeritlerini tripsin ile güçlüce vorteksleyin ve 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe ederek karıştırın. Hücreleri enfekte etmek için her beş ila 10 dakikada bir vorteksleyin. Öncelikle, tek tabakayı istenen enfeksiyon çokluğuyla enfekte etmek için gereken viral partikül miktarını hesaplayın.

Veya MOI. Enfeksiyon zaman serileri için tipik olarak 5 ile 10 arasında yüksek bir MOI kullanılır. Ardından, istenen miktarda sükrozla saflaştırılmış virüsü veya ham tryp virüsünü 37 °C'ye ayarlanmış viral büyüme besiyerine ekleyin ve iyice karıştırın.

Flaskın tabanını tam olarak kaplayacak miktarda besiyeri kullanmalısınız. T 1 75 flask için 10 milliliters besiyeri yeterli olacaktır. Besiyerini hücrelerden uzaklaştırın ve oda sıcaklığındaki PBS ile durulayın.

Sıfırıncı saat kontrol zaman noktası için her bir flaska virüsü veya viral büyüme ortamını ekleyin. Virüs eklemeden sadece viral büyüme ortamını ekleyin, nazikçe çalkalayın ve plakaları %5CO2'li bir inkübatörde 37 °C'de bir saat boyunca inkübe etmek üzere eğimli konuma getirin. Virüsün homojen dağılması ve hücrelerin nemli kalması için plakaları her 15 dakikada bir eğmeye ve çalkalamaya dikkat edin.

İnkübasyon sonrası, virüs içeren medyumu uzaklaştırın ve oda sıcaklığındaki PBS ile üç kez durulayın. Her bir flaska maksimum miktarda viral büyütme medyumu ekleyin.

Örneğin, T 1 75 flask için 30 mililitre besiyeri. Bunu, istediğiniz zaman noktasında sıfırıncı saat zaman noktanız olarak saymaya başlayabilirsiniz. Enfeksiyon sonrası hücreleri mikroskop altında inceleyin ve herhangi bir sitopatik etkiyi veya CPE'yi not edin.

Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri 30 mililitre oda sıcaklığındaki PBS ile durulayın. Ardından, hücrelerin üzerine 15 mililitre tripsin ekleyin ve iki ila beş dakika inkübe edin. 37 °C'de, mikroskop altında hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin ve hücrelerin yerinden oynamasını sağlamak için flask'a hafifçe vurun.

Hücreleri steril bir serolojik pipetle 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Flaskı eşit hacimde hücre büyüme ortamı ile yıkayın ve bu ortamı konik tüpteki tripsinize edilmiş hücrelere ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 Gs hızında santrifüjleyin.

Santrifüjden sonra, hücre peletinden besi ortamını uzaklaştırın; hücre peletini ve seçtiğiniz RNA izolasyon kitindeki trizol reaktifini veya lizis tamponunu kullanarak yeniden süspande edin. Trizol kullanıyorsanız, örneği 1 mL'lik kısımlara ayırıp 1,5 mL'lik etiketli ependorf tüplerine aktarın ve -80 °C'de dondurun. Tüm zaman noktaları için işlemi tekrarlayın.

Her zaman noktası için bir flask hasat edilir. Bu noktada, örneğiniz yeniden süspande edilmiş, triol reaktifi eklenmiş ve işlemeye hazır olmalıdır. 200 µL BCP faz ayırma reaktifi ekleyin.

Her tüpteki her bir mililitre triol için, fenol yerine BCP veya bir bromo üç kloropropan kullanılır. Genomik DNA kontaminasyonunu azaltmak için örneği daha büyük bir tüpe aktarmanız gerekebilir. İşleme büyük miktarda triol ile başlıyorsanız, vorteksleyin veya şiddetle çalkalayın ve oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe edin; inkübasyon sonrası örneği 12,000 g'de 15 dakika santrifüjleyin.

Üstte şeffaf bir tabaka şeklinde bir sulu faz görülmelidir. Sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Başlangıçta kullandığınız her bir mililitre triazole karşılık yaklaşık 600 microliters geri kazanmalısınız.

İkinci bir fenol kloroform ekstraksiyonu yapın. Bu kez BCP yerine, her bir mililitre triazol için 500 µL kloroform kullanın. İkinci kloroform ekstraksiyonu, ekstraksiyondan kalan organik çözücü izlerini gidermek için kullanılır; çünkü eser miktardaki kalıntılar bile sonraki amplifikasyon basamaklarını inhibe edebilir.

Vorteksleyin veya kuvvetlice çalkalayın, ardından oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkube edin. Santrifüjden sonra numuneyi 12,000 GS hızında 15 dakika santrifüjleyin. Üst fazı yeni bir tüpe aktarın.

Sulu fazın üstteki berrak tabaka olduğunu unutmayın. Ardından, her örneğe 20 micrograms lineer akrilamid ekleyin. Lineer akrilamid, taşıyıcı görevi görerek RNA'nın çöktürülmesine yardımcı olur.

Her bir örneğe, başlangıçtaki her 1 mililitre triol için 500 µL izopropanol ekleyin ve karıştırın. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sonrası örnekleri bir mikrosantrifüjde maksimum hızda 10 ila 15 dakika santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra RNA peleti tüpün dibinde görünür olacaktır.

Süpernatantı, vakumlu bir aspiratörle veya manuel olarak pipetle tüpten çok dikkatli bir şekilde uzaklaştırın. Peleti rahatsız etmeyin. Peleti 1 mL %70 etanol ile yıkayın ve maksimum hızda beş ila yedi dakika santrifüjleyin.

Çok dikkatli bir şekilde. Etanolü tüpten ya bir vakumlu aspiratörle ya da pipetle manuel olarak uzaklaştırın. Süpernatantı atın.

Peletin tüpün dibinde görünür olduğundan emin olun. Süpernatant atıldıktan sonra bu yıkama adımını tekrarlayın. Peletin tüp üzerindeki konumunu işaretleyin.

Peleti beş dakikadan fazla olmamak kaydıyla havada kurutun. RNA'nın yeniden çözünmesini zorlaştıracağı için aşırı kurutmayın. Ardından, DNA işlemi planlanmışsa, peleti 17 µL nükleaz içermeyen su içerisinde süspanse edin.

D'S tedavisi planlanmıyorsa, resus 20 µL içinde süspande edin. D'S tedavisi için KaiGen RNA free DNA setini kullanın. İki µL tampon, RDD ve bir µL yeniden konfigüre edilmiş RNA free ekleyin.

Resüspande edilmiş RNA ile DNA'lar karıştırılıp 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edilir. Ardından, 2,5 mM EDTA'dan iki µL ekleyin ve 65 °C'de beş dakika inkübe edin. DNA'yı inaktive etmek için inaktivasyon süresini veya sıcaklığını aşmayın; çünkü daha uzun süreler ve daha yüksek sıcaklıklar RNA'nın degradasyonuna neden olabilir.

DNA işlemi tamamlandı. RNA konsantrasyonunu spektrofotometre ile kontrol edin. Fenol veya BCP kalıntıları, 260 nanometredeki standart pikin ötesinde, 270 nanometrede bir yükselme şeklinde tespit edilebilir.

Ekstraksiyon sonrası toplam RNA'nın absorbansı ölçüldüğünde, eğer böyle bir kontaminasyon görülürse, amplifikasyona geçmeden önce filtre veya kolon tabanlı bir RNA ekstraksiyon yöntemi kullanarak RNA'yı geri kazanın. RNA örneğini -80 °C'de saklayabilirsiniz. Arzu ederseniz, bir Agilent bioanalyzer kullanarak veya örneği denatüre edici bir jelde yürütüp bioanalyzer üzerindeki OD okumalarını kontrol ederek RNA kalitesini kontrol edebilirsiniz.

İyi RNA kalitesi, RNA bütünlük numarası veya RIN ile belirtilir. RIN, birin en bozunmuş profil, onun ise en sağlam profil olduğu, birden ona kadar uzanan bir numaralandırma sistemine dayanır. Size az önce, vaccinia virüsü ile zaman serili enfeksiyonun nasıl gerçekleştirileceğini ve enfeksiyon sonrası çeşitli zaman noktalarında enfekte hücrelerden RNA'nın nasıl ekstrakte edileceğini gösterdik.

Bu prosedür uygulanırken, senkronize bir vaccinia enfeksiyonu kurulumunda birkaç kritik adım olduğunu hatırlamak önemlidir. İlk olarak, virüsün dikkatli bir şekilde sonikasyonla veya tripsinizasyonla işlenmesi gerekir. Vaccinia agregasyona oldukça yatkın olduğundan ve bu durum hücrelerin eşit şekilde enfekte olmasını engelleyeceğinden, virüs partiküllerinin agregatlarının çözülmesi önemlidir.

İkinci olarak, asenkron enfeksiyondan kaçınmak için her hücrenin enfekte olduğundan emin olmak amacıyla iki'den büyük yüksek bir MOI kullanılmalıdır. Enfekte ve enfekte olmamış hücrelerin karışımı, birden fazla enfeksiyon döngüsüne, zaman noktalarının heterojen karışımlarına ve asenkron viral ve konakçı transkripsiyonel yanıtlara yol açacaktır. Üçüncü olarak, virüsün hücreler tarafından maksimum düzeyde emilmesini sağlamak için enfeksiyon, minimum miktardaki medyumda gerçekleştirilmelidir.

Ek olarak, erlenin veya kültür kaplarının her 10 dakikada bir düzenli olarak çalkalanması, virüsün erlen içine dağılmasını sağlar ve hücrelerin kurumasını önler. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

RNA örneklerinin lineer amplifikasyonu ile floresan işaretli RNA'nın hazırlanması ve temizlenmesi prosedürlerini gösterdiğimiz bu serideki diğer videoları izlediğinizden emin olun.