Name: Vaccinia Virüs Enfeksiyonu and Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Öğrenin, HeLa hücrelerinde vaccinia virüs enfeksiyonu sonrası RNA izolasyonu ve ters transkripsiyonla cDNA sentezi yöntemini. Bu protokol viral ve konak gen ifadesi analizi için mikrodizin hazırlığı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Whitehead Enstitüsü&#39;nden Fellows Fonları

Bölüm 1: RNA cDNA sentezi <ol><li> Ambion Amino Allyl MessageAmp II kiti kullanmadan önce, yıkama tamponlar Önerilen miktar,% 100 etanol ekleyin. </li><li> PCR reaksiyonu tüp, T7 oligo (dT) astar toplam RNA ve 1μl 5μg 100ng arasında ekleyin. Nükleaz içermeyen su ile 12μl hacim kazandırın. </li><li> 70 numune inkübe ° C bir termalcycler 10 dk. </li><li> 70 ° C ve santrifüj kısaca RNA örnekleri çıkarın. Buz üzerine yerleştirin. </li><li> 1. Strand Sentez ana karışımı hazırlayın ve oda sıcaklığında tutmak (% 10 hata pipetleme tutarı düşmek) (Tablo 1) </li><li> Pipet Master Mix veya fiske yavaşça karıştırmak ve ardından kısa bir süre santrifüj. </li><li> Her RNA örnek Master Mix 8μl aktarın. 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme karıştırın. </li><li> PCR 2 saat için 42 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj örnekleri kısaca yer ve buz üzerinde. Hemen dsDNA sentez sonraki adıma geçin. </li><li> Buz üzerinde 2. Strand Sentez master miks (% 10 hata pipetleme tutarı düşmek) (Tablo 2) hazırlayın </li><li> Pipet Master Mix veya fiske yavaşça karıştırmak ve ardından kısa bir süre santrifüj. </li><li> Her bir örnek 80μl aktarın ve hafifçe aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme karıştırın. </li><li> PCR 2 saat 16 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 2 saat inkübasyondan sonra, cDNA temiz-up adım ile devam ya da -20 ° C&#39;de hemen dondurmak </li></ol> Bölüm 2: Çift zincirli cDNA clean-up <ol><li> CDNA Saf buzdolabından çıkarın ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında gelmesini sağlar. Tam olarak kullanmadan önce, manyetik cDNA bağlayıcı boncuklar tekrar süspansiyon için şişeyi iyice çalkalayınız. </li><li> 1.5mL tüp ve inkübe 50-60 ° C önceki 2saat inkübasyon sırasında en az 10 dakika içine kısım nükleaz içermeyen su. </li><li> Her bir numune için cDNA Saf 180μl ekleyin ve iyice yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın. </li><li> Orbital çalkalayıcı plaka en az 2 dakika boyunca hafifçe sallayarak örneklerini karıştırmak için devam edin. </li><li> Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Yaklaşık 6 dakika boyunca stand plaka bırakın veya karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar. </li><li> Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Manyetik stand plaka çıkarın. </li><li> Her iyi 150μl cDNA Yıkama Tampon ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk yıkama tamponu düşük yüzey gerilimi nedeniyle, bu aşamada dağıtmak ETMEYECEKTIR. </li><li> Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. </li><li> Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Manyetik stand plaka çıkarın. </li><li> Yıkama 150μl cDNA Yıkama Tampon ile 2. kez tekrarlayın. </li><li> 2. yıkamadan sonra, maksimum hızda 2 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Overdry değil! </li><li> 18μl her numune için, önceden ısıtılmış nükleaz ücretsiz su ekleyerek boncuk cDNA elute. </li><li> Orbital çalkalayıcı 3 dakika plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor. </li><li> Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak. </li><li> Dikkatlice yıkandı, cDNA (~ 16μl) yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) aktarmak. </li><li> Doğrudan bir sonraki adıma geçin, ya da -20 ° C&#39;de cDNA dondurmak </li></ol> Bölüm 3: in vitro Transkripsiyon (IVT) <ol><li> IVT ana karışımı oda sıcaklığında (Tablo 3) hazırlayın </li><li> Master Mix veya karıştırmak için fiske yavaşça pipet, ve kısaca santrifüj. </li><li> Her bir örnek 24μl ekleyin ve hafifçe aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme karıştırın. </li><li> Bir termalcycler 14 saat için 37 ° C&#39;de inkübe, daha sonra bir sonraki adıma ° C kadar hazır 4 tutun. </li></ol> Bölüm 4: Arna clean-up IVT sonra <ol><li> Vortex RNA bağlayıcı boncuk kısaca kullanmadan önce düzgün bir karışım elde etmek için. </li><li> Oda sıcaklığında Arna Cilt Mix hazırlayın (Tablo 4) Bu vaktinden önce yapılabilir. Hazırlanan bağlayıcı karışım, oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklanabilir . </li><li> Vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> 1.5mL tüp ve en az 10 dakika boyunca 50-60 ° C&#39;de inkübe içine kısım Arna Elüsyon Tampon. </li><li> Arna bağlayıcı karışımı 70μl ekleyinher bir örnek ve aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme iyice karıştırın. </li><li> PCR plaka 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın. </li><li> Her numune için% 100 izopropanol 50μl 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Yavaşça örnekleri iyice karıştırmak için en az 2 dakika süreyle orbital çalkalayıcı plaka sallayın. </li><li> Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar stand plaka bırakın. </li><li> Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Manyetik stand plaka çıkarın. </li><li> Her iyi 100μl Arna Yıkama Çözeltisi ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk tam bu aşamada dağıtmayın. </li><li> Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. </li><li> Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Manyetik stand plaka çıkarın. </li><li> Yıkama 100μl Arna Yıkama Çözümü ile 2. kez tekrarlayın. </li><li> 2. yıkamadan sonra, maksimum hızda 1 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Örnekleri overdry etmeyin! </li><li> Her numune için 40μl önceden ısıtılmış Arna Elüsyon Tampon ekleyerek boncuk Arna Zehir. </li><li> 3 dakika orbital çalkalayıcı plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor. </li><li> Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak. Süpernatant temizlenmiş amino alil dahil Arna içerir. </li><li> Yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) dikkatlice yıkandı, Arna aktarın. </li><li> (Opsiyonel adım) NanoDrop spektrofotometre 1.5μl ölçerek örneklerinin RNA konsantrasyonu kontrol edin. </li><li> Hemen bir sonraki adıma üzerine devam eder, ya da -80 Arna saklamak ° C </li></ol> Tablo 1: cDNA 1. Strand Sentez Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> 1 reaksiyon için Tutarı </td></tr><tr><td> 10X İlk Strand Tampon </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Ribonükleaz İnhibitörü </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Dizi Komut </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 2: cDNA 2. Strand Sentez Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> 1 reaksiyon için Tutarı </td></tr><tr><td> Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 63 ul </td></tr><tr><td> 10X İkinci Strand Tampon </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> DNA Polimeraz </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> RNaz H </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 3: IVT Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> 1 reaksiyon için Tutarı </td></tr><tr><td> aaUTP çözümü (75 mM) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> CTP, ATP, GTP mix (25 mM) </td><td> 12 ul </td></tr><tr><td> T7 UTP çözümü (75 mM) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> T7 10X Reaksiyon Tamponu </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> T7 Enzim Mix </td><td> 4 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Arna Bağlama Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> 1 reaksiyon için Tutarı </td></tr><tr><td> RNA Cilt Boncuk * </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Boncuk Tekrar Süspansiyonu Çözüm * </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> % 100 izopropanol ** </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> Arna Cilt Tampon Konsantre </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> * İlk RNA bağlayıcı boncuk boncuk tabanda çözümü ile karıştırın. ** Izopropanol Arna bağlayıcı tampon konsantre eklemeden önce ekleyin ve iyice karıştırın.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Kritik Adımlar Dizi veri önyargıları gözlenmiştir olarak ikinci bir tur amplifikasyon tavsiye edilmez. (1. ve 2. iplikçik cDNA sentezi, IVT) enzimatik her adım dikkatle Karıştırma her enzimatik adım inkübasyon uygun sıcaklık, iyi amplifikasyon verimi elde etmek için kritik öneme sahiptir. IVT sırasında 2-3 derece bir hava hibridizasyon fırın veya su banyosu hibridizasyon gibi küçük amplifiye ürün verimi önemli ölçüde etkileyebilir bile sapmalar ayarlanabilir ısıtmalı kapa...

<table><tbody><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplifikasyon kiti</td><td>Reaktif</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>20 reaksiyon için</td></tr><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplifikasyon kiti</td><td>Reaktif</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>100 reaksiyon için, 96 kuyucuklu formatta</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spektrofotometre</td><td>Diğer</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Veya eşdeğer bir spektrofotometre</td></tr></tbody></table>

vaccinia virüs enfeksiyonu &amp; virus gen İfadesi zamansal analizi: part 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Aile<em&gt; Poxviridae</em&gt; Sadece enfekte hücrelerin sitoplazmasında çoğaltmak virüsler içeren büyük çift iplikli DNA oluşur. Üyeleri<em&gt; Orthopox</em&gt; Cinsine dahil variola, insan küçük çiçeği etkeni, monkeypox ve vaccinia (VAC), virüs aile prototipik üyesi. Göreceli olarak büyük (~ 200 kb) vaccinia genom içinde gen üç sınıfa kodlanır: erken, orta ve geç. Her üç sınıf, viral kodlanmış RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu olsa da, her sınıf, virüsün yaşam döngüsü içinde farklı bir fonksiyon sunar. Poxviruses enfeksiyon sırasında ev sahibi hücresel ortamı modülasyonu için çoklu stratejiler kullanmaktadır. Hem ev sahibi hem virüs gen ekspresyonu düzenlenmesi anlamak için, biz, hem virüs ve konak hücrelerine transkript bolluk analiz etmek için genom yaklaşımlar kullanılmaktadır. Burada, birkaç saat sonrası enfeksiyon Vaccinia virüs ve örnekleme RNA HeLa hücrelerinde zaman ders enfeksiyonları göstermektedir. Her iki konak ve viral toplam RNA gen ekspresyonu analizi için mikroarray&#39;ler hibridizasyon için izole edilmiş ve yükseltilir.

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. 3 Bölüm 2

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2

Poxviridae ailesi, yalnızca enfekte hücrelerin sitoplazmasında replike olan, büyük çift zincirli DNA içeren virüslerden oluşur. ... üyeleri

Merhaba, ben Whitehead Biyomedikal Araştırmalar Enstitüsü'ndeki Kate Rubins laboratuvarından Judy Yen. Önceki bir JoVE video protokol gönderisinde gösterildiği üzere, HeLa hücrelerini vaccinia virüsü ile enfekte edip toplam RNA'yı izole ettikten sonra, viral RNA ters transkripsiyon ve in vitro transkripsiyon kullanılarak izole edilebilir ve amplifiye edilebilir; amplifiye edilen RNA daha sonra viral ve konak gen ekspresyonunun mikroarray analizinde kullanılacaktır. Öyleyse başlayalım.RNA'dan cDNA sentezine başlamak için, Ambient Amino Allele Message AMP 2 kitini kullanmadan önce yıkama tamponlarına önerilen hacimde %100 etanol ekleyin. Bir PCR reaksiyon tüpüne 100 ng ile 5 µg arasında toplam RNA ve 1 µL T7 oligo primeri ekleyin. Hacmi nükleaz içermeyen su ile 12 µL'ye tamamlayın. Numuneleri bir termosiklet cihazında 70 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, RNA örneklerini santrifüjle 70 °C'den çıkarın. Santrifüjlemeden hemen sonra örnekleri buza yerleştirin. Pipetleme hatalarını telafi etmek için %10 hacim fazlası ile birinci zincir sentez master mix'ini hazırlayın.Oda sıcaklığında bekletin, master mix'i nazikçe pipetleyin veya karıştırmak için hafifçe vurun ve ardından kısa süreliğine santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, master mix'in sekiz mikrolitresini her bir RNA örneğine aktarın ve üç ila dört kez yukarı aşağı pipetleyerek karıştırın; ardından termosiklet cihazında 42 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası örnekleri kısa süreliğine santrifüjleyin ve buz üzerinde bekletin. Hemen ardından cDNA sentezinin bir sonraki adımına geçin.İkinci zincir sentez ana karışımını, pipetleme hatalarını telafi etmek için %10 hacim fazlasıyla buz üzerinde hazırlayın; ana karışımı nazikçe pipetleyerek veya tüpü hafifçe tıklatarak karıştırın ve ardından kısa bir süre santrifüjleyin. Her örneğe 80 microliters aktarın ve pipetle üç ila dört kez yukarı-aşağı çekerek nazikçe karıştırın. Termosiklet cihazında 16 degrees Celsius sıcaklıkta iki saat boyunca inkübe edin.İki saatlik inkübasyonun ardından, cDNA temizleme adımına geçin veya hemen -20 °C'de dondurun. Çift sarmallı cDNA temizleme işlemine başlamak için; öncelikle, cDNA Pure kitini buzdolabından çıkarın ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesini bekleyin, manyetik cDNA bağlama boncuklarını tamamen yeniden süspande etmek için şişeyi çalkalayın, nükleaz içermeyen suyu 1,5 mL'lik tüplere paylaştırın ve en az 10 dakika boyunca 50 ila 60 °C'de inkübe edin.Önceki iki saatlik inkübasyon sırasında, her örneğe 180 µL CD NA pure ekleyin ve pipetle aşağı yukarı hareket ettirerek iyice karıştırın. Örnekleri 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın. Örnekler plakaya aktarıldıktan sonra, plakayı bir orbital çalkalayıcıda en az iki dakika boyunca hafifçe sallayarak örnekleri karıştırmaya devam edin.Manyetik boncukları yakalamak için plakayı manyetik bir standa yerleştirin. Karışım şeffaf hale gelene ve bağlayıcı boncuklar çökelene kadar plakayı yaklaşık altı dakika boyunca stand üzerinde bekletin. Manyetik boncukları yerinden oynatmadan süpernatantı bir vakum aspiratörü ile dikkatlice aspire edin.Alternatif olarak, süpernatanı bir pipetle dikkatlice çekin ve atın. Süpernatan atıldıktan sonra, plakayı manyetik stanttan çıkarın. Her kuyucuğa 150 microliters CDNA yıkama tamponu ekleyin ve plakayı orbital sarsıcıda orta hızda bir dakika boyunca sallayın.Yıkama tamponunun düşük yüzey gerilimi nedeniyle bu aşamada boncuklar dağılmayacaktır. Çalkalama işleminden sonra plakayı manyetik standa geri yerleştirin. Manyetik boncukları yakalamak için, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı bir vakum aspiratörü ile dikkatlice aspire edin.Veya süpernatantı bir pipetle dikkatlice çekip atın. Plakayı manyetik standdan çıkarın. Yıkama işlemini 150 µL CDNA yıkama tamponu ile ikinci kez tekrarlayın.İkinci yıkamadan sonra, plakayı orbital çalkalayıcıda maksimum hızda iki dakika sallayarak boncukları kurutun. Boncukların aşırı kurumamasına dikkat etmek önemlidir. Ardından, her bir örneğe önceden ısıtılmış nükleazsız sudan 18 µL ekleyip kuvvetlice karıştırarak cDNA'yı boncuklardan elüe edin.Plakayı orbital çalkalayıcıda üç dakika boyunca çalkalayın. Ardından manyetik boncukların tamamen dağıldığından emin olun. Eğer dağılmamışlarsa, çalkalama işlemine devam edin.Manyetik boncuklar tamamen dağıldıktan sonra, plakayı manyetik bir standa yerleştirin. Manyetik boncukları yakalamak için, elüe edilen cd NA'yı dikkatlice yeni bir PCR plakasına veya PCR tüplerine aktarın. Örnek başına yaklaşık 16 µL elüsyon geri kazanmalısınız.Doğrudan bir sonraki adıma geçin veya cDNA'yı -20 °C'de dondurun. IVT master mix'ini oda sıcaklığında hazırlayın. Master mix'i yavaşça pipetleyin veya karıştırmak için hafifçe vurun ve kısa süreliğine santrifüjleyin.Santrifüjden sonra, her örneğe 24 µL ekleyin ve pipetle üç dört kez yukarı aşağı çekerek nazikçe karıştırın, ardından bir termosiklet cihazında 37 °C'de 14 saat inkübe edin. Sonra, bir sonraki adıma hazır olana kadar 4 °C'de muhafaza edin; kullanmadan önce homojen bir karışım elde etmek için RNA bağlama boncuklarını kısa süreli vorteksleyin. A RNA bağlama karışımını oda sıcaklığında hazırlayın.Bu işlem önceden yapılabilir. Hazırlanan bağlama karışımı oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklanabilir. A RNA elüsyon tamponundan bir alikotu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın, vorteksleyerek iyice karıştırın ve en az 10 dakika boyunca 50 ila 60 derece Celsius'ta inkübe edin.Şimdi, her bir örneğe 70 µL A RNA bağlanma karışımı ekleyin ve pipetle üç ila dört kez çekip bırakarak iyice karıştırın. Örnekleri PCR plakadan 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın. Ardından, her bir örneğe 50 µL %100 izopropanol ekleyin ve pipetle üç ila dört kez çekip bırakarak iyice karıştırın.Plakayı bir orbital çalkalayıcıda en az iki dakika boyunca nazikçe çalkalayın. Örnekleri tamamen karıştırmak için plakayı manyetik bir standa yerleştirin. Manyetik boncukları yakalamak için.Karışım şeffaflaşana ve bağlayıcı boncuklar çökelene kadar plakayı stand üzerinde bırakın. Boncuklar çökeldiğinde, manyetik boncukları rahatsız etmeden süpernatanı vakum aspiratörü ile dikkatlice aspire edin. Alternatif olarak, süpernatanı bir pipetle dikkatlice çekin ve atın.Plakayı manyetik standdan çıkarın. Ardından, her bir kuyucuğa 100 µL RNA yıkama çözeltisi ekleyin ve plağı orbital sarsıcıda orta hızda bir dakika boyunca sallayın; boncukların tamamen dağılması gerekmez. Bu adımda, plağı manyetik standa yerleştirin.Manyetik boncukları tutmak için; manyetik boncukları rahatsız etmeden süpernatanı bir vakum aspiratörü ile dikkatlice aspire edin. Alternatif olarak, süpernatanı bir pipetle dikkatlice çekip uzaklaştırın.Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra plakayı manyetik stanttan çıkarın. Yıkama işlemini 100 µL RNA yıkama solüsyonu ile ikinci kez tekrarlayın. İkinci yıkamanın ardından, plakayı orbital sarsıcıda maksimum hızda bir dakika boyunca sallayarak boncukları kurutun.Numuneleri aşırı kurutmamaya dikkat edin; önceden ısıtılmış 40 µL A RNA elüsyon tamponu ekleyerek boncuklardan A RNA'yı elüye edin. Her numune için plakayı orbital sarsıcıda üç dakika boyunca kuvvetlice sallayın. Ardından, manyetik boncukların tamamen dağıldığından emin olmak için kontrol edin.Eğer değilse, çalkalamaya devam edin. Manyetik boncuklar tamamen dağıldığında, manyetik boncukları yakalamak için plakayı manyetik bir standa taşıyın. Süpernatan, RNA'ya entegre edilmiş temizlenmiş amino aleli içerir.Elüe edilen RNA'yı dikkatlice yeni bir PCR plakasına veya PCR tüplerine aktarın. Bu aşamada, NanoDrop spektrofotometresinde 1.5 µL ölçüm yaparak örneklerin RNA konsantrasyonunu kontrol edebilirsiniz. Hemen bir sonraki adıma geçin veya RNA'yı -80 °C'de saklayın.Mikrodizi hibridizasyonu için amplifiye edilmiş immüno allel dahil edilmiş RNA örneklerinin floresanla nasıl etiketleneceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, ikinci bir amplifikasyon turu yapılmasının önerilmediğini unutmamak önemlidir. Yanlılıklar ve dizi verileri gözlemlendiğinden, her enzimatik basamakta, birinci ve ikinci zincir sentezlerinde dikkatlice karıştırmanın önemli olduğunu da hatırlatmak isteriz.Her bir enzimatik basamağın uygun sıcaklıkta inkübe edilmesi gibi, cDNA sentezi veya IVT basamağı da iyi amplifikasyon verimleri elde etmek için kritiktir. In vitro transkripsiyon sırasında iki ila üç derece kadar küçük sapmalar bile hava hibridizasyon fırınında veya su banyosunda yapılan hibridizasyonu önemli ölçüde etkileyebileceği için ayarlanabilir ısıtmalı kapağı olan bir PCR döngüleyici tercih edilir ve amplifiye edilen ürünün verimini belirgin şekilde değiştirebilir.İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz. Vaccinia virüsü ile zaman serisi enfeksiyonunun nasıl gerçekleştirileceğini, örneklerin RNA ekstraksiyonunu ve floresan işaretli RNA'nın hazırlanması ile temizlenmesini gösterdiğimiz bu serideki diğer videoları izlemeyi unutmayın.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Bölüm 3 floresan boyalar amino alil kaplin hem ev sahibi hem viral örnekleri amplifiye RNA etiketleme süreci anlatılmaktadır. 3 Bölüm...

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3

Viral enfeksiyon katılan Roman konakçı faktörleri fonksiyonu RNAi tarama hücre tabanlı genom zarara tespit edilebilir.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Oncolytic virüsler kanser tedavileri için umut vericidir. Tedavisi öncesinde hastalar elde edilen canlı doku örneklerinin infectability tespit etmek için bu tedavi yaklaşımı yeteneği benzersiz bir avantaj. Bu protokol için dokuların süreci...

Ex Vivo Enfeksiyon Oncolytic Virüsler Canlı Doku

Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında nükleer-için-sitoplazmik translocation uğrar. Bu olay moleküler mekanizması bilinmemektedir. Burada biz confocal mikroskop ICP0 translocation gelecek mekanik çalışmalarda kantitatif analiz etmek için zemin bırakır HSV-1 enfeksiyonu hareketinde ICP0 ölçmek için bir araç olarak nasıl kullanılacağını açıklar.

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

Öğrenin, HeLa hücrelerinde vaccinia virüs enfeksiyonu sonrası RNA izolasyonu ve ters transkripsiyonla cDNA sentezi yöntemini. Bu protokol viral ve konak gen ifadesi analizi için mikrodizin hazırlığı sağlar.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2

Daha fazla video keşfet