Name: Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Öğrenin FM 4-64 boyası ile hipokampal nöron kültürlerinde presinaptik vezikül salınım kinetiğini ölçmeyi. Bu yöntem, gerçek zamanlı görüntüleme ile sinir iletimi mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hücreler: Rat (veya fare) primer hipokampal nöron kültürleri (in vitro 14-28 gün). Uyarım: Elektrik, iki platin elektrot ile teslim; 70-90 mV Mikroskopi: ters bir CCD floresan mikroskop 60x petrol objektif. Yazılım: Slidebook (Akıllı Görüntüleme Yenilikler, Santa Monica, CA) Daha fazla ayrıntı için tamamlayıcı yöntemler sayfasına bakınız <ol><li> Warm Hepes-tamponlu salin (HBS) oda sıcaklığında. Glutamat reseptör antagonistleri APV (50 mcM son konsantrasyon) ve CNQX (10 mcM son) ekleyin. Her FM deney genellikle 20-30 ml HBS gerektirir. 10 mcM FM 4-64 (Molecular Probes) konsantrasyonu çalışmalar için, (antagonistleri eklenmiş) HBS stok solüsyonu 1:1000 sulandırmak. Her bir deney için 2 mL FM soln olun. Çözüm ışık maruz kalmayı önlemek için folyo ile örtün. </li><li> Nöron içeren elektrot odasının üzerine lamel monte edin. Medya odasında odasının üst düzeyi olup olmadığını kontrol edin ve tamamen elektrotlar kapsar. Lamel altındaki herhangi bir aşırı çözüm çıkarın. Lens (bir petrol lens kullanıyorsanız) yağı ekleyin. </li><li> Perfüzyon aparat ayarlayın. Su, etil alkol, su, daha sonra HBS: İlk verilen sipariş (sonraki eklemeden önce iyice her biri akışını sağlar) her biri aşağıdaki birkaç mL ile durulayın. Sonraki HBS (gelecekteki adımları elle eklemek için birkaç ml kaydedin) ve perfüzyon yakın. Lamel kenarlarında ters taraftan perfüzyon çıkışı ve emme ayarlayın. Emme en üst kısmında geri kalanı nerede olarak perfüzyon çıkışı odasına ulaşırsa en iyisidir. HBS (ya perfüzyon veya elle) eklerken sağ taraftaki medya seviyesi sadece elektrotları tam kapsayan korur, böylece emiş açmak ve kendi konumunu ayarlamak. </li><li> Görüntü isteyen ve kabaca odak getirmeyi deneyin lamel alanı için bak. Optimal alanlarda çok sayıda sinaps içerir, ancak bireysel süreçleri ayırt edilemez hale gelir böyle çok yoğun olmamalıdır. Olmamalıdır hiç-minimal hücre gövdeleri, gereksiz membranlar (astrosit kümeleri gibi), ya da diğer nonspesifik malzemeleri (örneğin, tüy bırakmayan gibi). FM boya nonspecifically bu uygun olabilir. </li><li> (Yeşil ışık heyecanlandıran ve kırmızı-uzak kırmızı emisyon toplar) &quot;WG&quot; filtre küp kullanın. 0 (genellikle 300 900 AP&#39;ler Bu yükleme uyaran için kullanılır) görüntü başlaması üzerine 10Hz az 900 AP sunmak için SlideView &quot;yakalama tercihleri&quot; ayarlayın. Görüntü penceresinde, &quot;fluo-vis-kırmızı&quot; filtre ayarları seçin ve maruz kalma süresi 100 ms değiştirin. Önceden varolan timelapse ayarları kapatın. Stimülasyon başlatmak için hazır olana kadar herhangi bir görüntü almayın. </li><li> Emme açık açık / kapalı olduğundan emin olun. Hızla emme ters sonunda odasına FM soln (2 ml) ekleyin. Hemen bir görüntü çekmek ve stimülasyon başlamak için görüntü penceresinde tamam tuşuna basın. Stimülasyon sonra 30-45 saniye bekleyin ve sonra hızlı bir şekilde yaklaşık 2 mL HBS (bir pipet yardımıyla elle Bunu yapmak için, ama bu da perfüzyon tarafından yapılabilir) ekleyerek FM yıkayın. </li><li> ~ 10 dakika perfüzyon yoluyla FM HBS ile yıkayın. Akış hızı 1-1.5 ml / dak olmalıdır. Bu yıkama adım sırasında, stimülasyon başlangıcında başlar, böylece uyarılması tercihlerini değiştirmek @ görüntü 10 (genellikle 900 ila 1200 AP&#39;ler @ 10 Hz bu destaining uyaran için kullanılır). Yıkama içine 7 dk Hakkında tercihleri ​​(görüntü uyaranın başlangıcından 10), çift kontrol edin. Şimdi küçük bir odak pencereyi seçin ve subregion odağı. Stimülasyon ayarları bir sonraki adıma geçmeden önce değiştirilmiş olduğundan emin olun. Yıkama tam olup olmadığını görmek için tek bir görüntü (bireysel sinaps açıkça noktalı olmalıdır) atın. Aksi takdirde, akış oranı ek bir 0.5mL/min artış ve başka bir 2 dakika bekleyin. </li><li> Bir kez yıkamak tam, (genellikle 50-100 ms Pozlama süreleri arasında FM hızlı photobleaching nedeniyle minimize edilmelidir) yine de iyi ve net bir sinyal almak için gerektiği gibi pozlama süresi ayarlayabilirsiniz. Daha sonra her 5 saniyede 38 görüntü almak için timelapse tercihlerinizi ayarlayabilirsiniz. HBS başka bir 5 dakika yeterli perfüzyon kontrol edin ve perfüzyon akan bırakın. Destaining başlamak için timelapse başlayın. </li><li> Destain sonra, resmin 0 üzerine 1200 AP @ 10Hz (genellikle 1200 - 2000 AP&#39;ler bu son adım için kullanılır) sunmak için stimülasyon ayarlarını değiştirmek. Timelapse ayarları kapatın ve stimülasyon başlamak için tek bir görüntü alabilir. Perfüzyon Bu adım, başlangıçtaki / &quot;toplam açıklanmaması&quot; floresan belirlemek için, kalan veziküler FM boya giderilmesine yardımcı olur, akıcı olmalıdır. Uyaran tamamlandıktan sonra, uyarılması ayarlarını kapatmak bölgenin odak noktası haline getirmek. Perfüzyon ve emme kapatınVe ardından son iki temel görüntüleri çekmek. Tek görüntü veya Z-yığın görüntüleri (0.5 mikron adımları) Ya alınabilir. Z-yığınlar, deney sırasında odak düzlemi bir kayma vardı durumunda yararlıdır. </li><li> FM deney yapılır. Hemen daha fazla deney yapıyorsanız, her deneme arasında objektif ve oda temizlenir, ancak perfüzyon cihaz son deney sonrasına kadar temizlenmesi gerekmez olmalıdır. Cihazın, daha sonra su, etanol ile tamamen durulayın. </li></ol>

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
</ol>

Yazarların beyan edeceği bir çıkar çatışması yoktur.

300 aksiyon potansiyelleri (AP), vezikül geri dönüşüm en azından bir tur, 300 AP&#39;ler veya daha sık veziküllerin geri dönüşüm havuzu etiket verilir yükleme uyaran ikna etmek için yeterli. 900 AP&#39;ler gibi daha yoğun yükleme uyaranlara, etiketli ek veziküllerin nominal izin verebilir rağmen, bu da daha fazla non-spesifik boyanması için boya ekstrasellüler membranlar gömebilirsiniz süreyi artırır. Ben, doğru destaining sağlamak için kritik bir yıkama adım bulduk. Genellikle 10 için akış hızı dakikada 1 - 1,5 ml + 2 dakika serpmek için ö...

<table><tbody><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>T-3166</td><td></td></tr><tr><td>CNQX disodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-239</td><td></td></tr></tbody></table>

nöronlar fm etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada FM boya ile etiketlenmiş veziküller presinaptik vezikül bırakma oranı izlemek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır. FM4-64 endositoz uyarılmış olarak sinaptik veziküllerin membranlar içine gömer kırmızı floresan amfifilik styryl boya. Lipofilik etkileşimleri boya büyük veziküller ve nominal bir ekstrasellüler sıvı ile ilişkili böylece parlak bir sinyal yayan floresan artışa neden olur. Yıkama adım, plazma zarı içinde dış boya kaldırmanıza yardımcı kullanıldıktan sonra, kalan FM veziküller içinde yoğunlaşmıştır ve ekzositoz, elektrik stimülasyonu başka bir yuvarlak ile indüklenen zaman sonra atılır. Floresans ortaya çıkan düşüşten vezikül serbest oranı ölçülür. FM boya geçici dış uygulanır ve olabilir bu yana, özellikle transfekte sinaps ve komşu kontrolü BOUTONS arasında oranlarını karşılaştırarak, nöronal kültürlerin ekzositoz oranlarının belirlenmesi için yararlı bir araçtır.

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada kırmızı floresan boya FM 4-64 etiketli veziküller presinaptik hipokampal nöron kültürlerinde vezikül serbest hızını ölçmek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Vezikül salınım kinetiğini ölçebilme yeteneği, nörotransmisyonun bazı temel mekanizmalarına dair içgörü sağlanmasına yardımcı olabilir. Burada, gerçek zamanlı...

Ben Jimmy Lynn. Harvard'daki Moleküler ve Hücresel Biyoloji programında lisansüstü öğrencisiyim. Şu anda Murphy Laboratuvarı'nda çalışıyorum ve laboratuvarımızda Hipokampal Nöronlar üzerine çalışıyoruz.Şimdi size FM-d deneylerinin nasıl yapılacağını göstereceğim. Şimdi, üzerinde nöronların bulunduğu lamelini bu özel yapım kamaraya monte edeceğiz. Mikroskobumuz ters bir CCD'dir; alt kısmın tamamen kuruduğundan emin olun.Elektrotlar bağlanacak. Şimdi perfüzyon sistemi kuruldu. Sistemi haznenin bir ucuna yerleştireceğim.Tutmak için kil kullanıyoruz. Deney başına HBS liderleri ilerleyerek tüm bunları ekleyecektir. Füzyon kurulumu tamamlanmıştır.Bunu sabitlemek için kil kullanmak istersiniz; sanırım hücre gövdelerinin olduğu böyle bir yer seçilmeli çünkü hücre gövdelerinin membranları boyanın büyük bir kısmını tutacak ve doğrudan sinapslara iletecektir. Belki de hemen şurası gibi komşu bir alan, burada sadece bu bölgeyi belirledim ve devam ediyoruz. Ve böylece ilk 10 görüntüden gelen başlangıç fotobleykinden (foto-ağartma) kaynaklanan durum.Ve işte buradayız, ben Jamil Newton. Harvard'daki moleküler biyoloji programında lisansüstü öğrencisiyim. Şu anda Vinky Murphy'nin yürütücü olduğu b

measuring-exocytosis-in-neurons-using-fm-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Merkezi sinir terminallerine ikmal ve belirli sinaptik vezikül (SV) havuzları seferberlik ölçmek için canlı bir floresan görüntüleme tekniği açıklanmıştır. SV geri dönüşüm iki tur bir iç kontrol sağlayan aynı sinir uçlarında izlenir.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

Floresan boya retrograd taşıma anatomik projeksiyona dayalı nöronların bir alt-nüfus etiketler. Etiketli akson görsel olarak...

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

Bu videoda, Drosophila larvaları sinir lifleri, hücre zarı lipidlerine bağlanan FM boyasına daldırılır. Emme mikroelektrodu ve elektrik darbeleri, FM boyasını yeni oluşan endositik veziküllere dahil ederek endositoz sürecini uyarır. Nörotransmisyonun presinaptik aşamalarını görselleştiren bu yöntem, sinaptik fonksiyonu ve nörotransmitter salınımını incelemek için yararlıdır.

Drosophila Larva Sinir Hücrelerinde Mikroelektrot Aracılı FM Boya Yükleme ve Boşaltma

Fonksiyonel sinir terminallerinin sinaptik vezikül görüntü geri dönüşüm için stiril FM boyaların kullanımını tarif eder. Bu protokol, sadece uyarılmış için değil, aynı zamanda doğal ve minyatür sinaptik faaliyetleri uygulanabilir. Protokol etkili değerlendirilebilir sinaptik olayların çeşitli genişletir.

Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Burada, stiril piridinyum boyalarla boyama ve lekelenme sırasında fare kulağı derisi kıl foliküllerini innerve eden palisade uçlarının canlı mızrak şeklinde duyusal terminallerini görüntülemek için yeni bir hazırlığı açıklıyoruz.

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fare Kulak Cilt

Sinaptik vezikül endositoz sinaptik vezikül protein ile erimiş pHluorin ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu vezikül Alım tarafından algılanır.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

Cilt hücrelerinin fizyolojik ve patolojik özellikleri ile ilgili önemli bir parametredir. Biz tam alan ölçüm-in vitro nöron birim neurites ve dinamik yapıları nöronal artışa örtülü analizi için gerekli alt micrometric eksenel çözünürlük ile sağlayan bir floresan dışlama yöntemi açıklanmaktadır.

Yüksek çözünürlüklü ses görüntüleme, nöronlar Floresans kullanım dışlama yöntemi tarafından ve adanmış mikrosıvısal aygıtları

Sinaptik vezikül (SV) Bisiklete binme nöronal sinapslarda, hücreler arası iletişim çekirdek mekanizması vardır. FM boya alımı ve yayın kantitatif SV endo - ve ekzositozu raporlaması birincil yoludur. Burada, biz FM1-43 Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) modeli sinaps Bisiklet sürmeyi tüm uyarım yöntemleri karşılaştırın.

FM sinaps Bisiklete binme boya: yüksek potasyum depolarizasyon, elektrik ve Channelrhodopsin stimülasyon karşılaştırma

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Öğrenin FM 4-64 boyası ile hipokampal nöron kültürlerinde presinaptik vezikül salınım kinetiğini ölçmeyi. Bu yöntem, gerçek zamanlı görüntüleme ile sinir iletimi mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Daha fazla video keşfet