Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3

Merhaba, ben Whitehead Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'ndeki Kate Rubins'in laboratuvarından Judy Y. Burada, hem vaccinia virüsü ile enfekte olmuş hela hücrelerinden hem de virüsten toplanan antisens RNA örneklerinin, boyaların amino tüm LEO eşleşmesi ile nasıl etiketleneceğini gösteriyoruz. Daha sonra, etiketli A RNA'nın nasıl temizleneceğini ve gen ekspresyonunun mikrodizi analizi için hibritleştirilmeye nasıl hazırlanacağını gösteriyoruz.

Önceki Joe videoları, viral enfeksiyonların, toplam RNA izolasyonunun ve RNA amplifikasyonu ve amplifikasyon adımlarının nasıl gerçekleştirileceğini vurgulamaktadır. Öyleyse başlayalım. Bir RNA etiketlemesine başlamak için, önce bir mikrogram A RNA örneğini 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine ekleyin.

Numuneleri tamamen kuruyana kadar düşük ısıda veya hiç ısınmadan vakumla kurutun. Her tüpü kuruduktan hemen sonra kapatın. Numuneler kuruduktan sonra aşırı kurutulmamalıdır.

Her tüpe dokuz mikrolitre birleştirme tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca hafifçe girdap yaparak A RNA'yı yeniden süspanse edin, numuneyi tüpün dibinde toplamak için kısaca santrifüjleyin ve ardından numuneyi buz üzerinde bekletin. Daha sonra, her bir SCI üç veya S beş boya tüpüne 22 mikrolitre yüksek kaliteli DMSO ekleyin, iki numune için bir tüp boya yeterlidir. Referans numunelerinizi etiketlemek için S SI üç kalıp ve SCI beş boya, test numunelerinizi etiketlemek içindir.

İyice karıştırmak için boyaları girdaplayın. Boyaları kullanıma hazır olana kadar karanlıkta tutmayı unutmayın. Boyayı kullanmadan bir saatten daha erken hazırlamayın ve boya DMSO karışımına hiçbir noktada su girmediğinden emin olun.

Şimdi 11 mikrolitrede hazırlanan D-M-S-O-S boya karışımı her numuneye girdaplama ile iyice karıştırılır. Oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika yavaşça inkübe edin. Işığa maruz kalmayı en aza indirmek için numuneleri folyo ile örtün veya bir çekmecede saklayın.

4.5 mikrolitrede inkübasyondan sonra, reaksiyonu söndürmek için her numuneye hidroksi lamin girdaplama ile iyice karıştırılır. 15 dakika daha süpürge sıcaklığında yavaşça inkübe edin. Işığa maruz kalmayı en aza indirmek için numuneleri folyo ile örtün veya bir çekmecede saklayın.

Etiketi temizlemek için, RNA bağlayıcı boncuklar olan RNA girdabını kullanırlar. Kullanmadan önce kısaca eşit bir karışım elde etmek için, A RNA bağlayıcı karışımını oda sıcaklığında hazırlayın. A RNA elüsyon tamponunu 1.5 mililitrelik bir tüpe girdaplayarak ve en az 10 dakika boyunca 50 ila 60 santigrat derece inkübe ederek bağlayıcı karışımı iyice karıştırın.

Her numuneye 70 mikrolitre A RNA bağlayıcı karışım ekleyin ve karıştırdıktan sonra üç ila dört kez yukarı ve aşağı ekleyerek boru ile iyice karıştırın, numuneleri PCR plakasından 96 kuyucuklu yuvarlak bir alt plakaya aktarın. Ardından, her numuneye 50 mikrolitre yüzde yüz izopropanol ekleyin ve üç ila dört kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Plakayı bir orbital çalkalayıcı üzerinde en az iki dakika hafifçe sallayın.

Örnekleri iyice karıştırmak için. Plakayı manyetik bir standa taşıyın. Manyetik boncukları yakalamak için.

Karışım şeffaf hale gelene ve bağlayıcı boncuklar topaklanana kadar plakayı stand üzerinde bırakın. Manyetik boncukları bozmadan süpernatanı bir vakum aspiratörü ile dikkatlice aspire edin. Alternatif olarak, süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın ve süpernatanı atın.

Süpernatant, dahil edilmemiş boya molekülleri nedeniyle bu noktada ya parlak pembe ya da parlak mavi olmalıdır. Süpernatan atıldıktan sonra, plakayı manyetik standdan çıkarın. Şimdi her bir oyuğa yüz mikrolitre, bir RNA yıkama solüsyonu ekleyin ve plakayı orbital çalkalayıcı üzerinde orta hızda bir dakika çalkalayın.

Boncuklar bu adımda tam olarak dağılmayabilir, plakayı manyetik bir standa geri koyun. Manyetik boncukları yakalamak için. Manyetik boncukları bozmadan süpernatanı bir vakum aspiratörü ile dikkatlice aspire edin.

Alternatif olarak, süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın ve süpernatanı atın. Plakayı manyetik standdan çıkarın. Yıkamayı 100 mikrolitre, A RNA yıkama solüsyonu ile ikinci kez tekrarlayın.

İkinci yıkamadan sonra. Plakayı orbital çalkalayıcı üzerinde maksimum hızda bir dakika sallayarak boncukları kurutun. Numuneleri aşırı kurutmayın, önceden ısıtılmış 20 mikrolitre, A RNA elüsyon tamponu ekleyerek boncuklardan A RNA'yı elüte edin.

Her numuneye, orbital çalkalayıcı üzerindeki plakayı üç dakika boyunca kuvvetlice sallayın. Ardından manyetik boncukların tamamen dağıldığından emin olmak için kontrol edin. Değilse, sallamaya devam edin.

Manyetik boncuklar tamamen dağıldıktan sonra, manyetik boncukları yakalamak için plakayı manyetik bir standa hareket ettirin. Süpernatant, temizlenmiş etiketli A RNA örneklerini içerir ve soluk pembe veya soluk mavi olmalıdır. Daha sonra, ima edilen bir RNA'yı dikkatlice yeni bir PCR plakasına veya PCR tüplerine aktarın.

Bu noktada bir NanoDrop spektrofotometresinde 1,5 mikrolitre ölçer ile numunelerdeki RNA konsantrasyonunu ve boya miktarını kontrol edebilirsiniz. Mikrodizi modülünü kullanarak, etiketli A RNA'yı hemen seçtiğiniz bir mikrodizi platformuna hibritleyin. Veya alternatif olarak, etiketli A RNA'yı hibridizasyona hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayabilirsiniz.

Bu, numune konsantrasyonunu ve boya katılımını ölçmek için NanoDrop spektrofotometre kullanılarak oluşturulan temsili bir spektrofotometre okuması ve OD grafiğidir. Numunelerin konsantrasyonunu hesaplamak için 260 nanometrede OD tepe noktalarını ve sırasıyla S3 ve SCI beş boyasını temsil eden 532 ve 635 nanometre civarındaki iki tepe noktasını görebilirsiniz. Mikroışın hibridizasyonu için amplifiye edilmiş immüno-alel içeren RNA örneklerini floresan olarak nasıl etiketleyeceğinizi az önce gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, birleştirmeden bir saatten daha kısa bir süre önce boyayı DMSO'da yeniden süspanse etmeyi unutmamak ve boya üzerindeki aktif grupla reaksiyona gireceği için boya DMSO karışımına su girmediğinden emin olmak önemlidir. Gerekirse RNA'yı aşırı kurutmamayı unutmamak da önemlidir. Numuneler tamamen kurumak yerine bir ila iki mikrolitreye kadar kurutulabilir ve daha sonra birleştirme reaksiyonu sırasında birleştirme tamponunda iyi bir şekilde yeniden süspanse edilebilir.

Ara sıra hafifçe vurarak reaksiyonları karanlıkta tutun ve istenirse döndürün. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.

Vaccinia virüsü ile bir zaman seyri enfeksiyonunun nasıl gerçekleştirileceğini ve örneklerin RNA ekstraksiyonunu ve RNA örneklerinin doğrusal amplifikasyonu prosedürünü gösterdiğimiz bu serideki diğer videoları izlediğinizden emin olun.