Name: Vaccinia Virüs Enfeksiyonu and Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Öğrenin, Vaccinia virüsü ile enfekte HeLa hücrelerinden izole edilen RNA örneklerini amino alil boya kovalent bağlama yöntemiyle etiketleme ve mikrodizi analizi için hazırlama tekniklerini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Whitehead Enstitüsü&#39;nden Fellows Fonları

Bölüm 1: Arna etiketleme: boyaların amino alil kaplin <ol><li> 1.5mL mikrosantrifüj tüpler içine Arna örnekleri 1μg ekleyin. </li><li> Tamamen kuruyana kadar, hiç olmaması veya düşük ısı örnekleri kuru vakum. En kısa sürede kuru olarak her tüp kap - overdry yok! </li><li> Her bir tüp 9μl kaplin tampon ekleyin ve 1 dakika boyunca yavaşça karıştırın Arna tekrar süspansiyon haline getirin. Tüpün alt örnek toplamak için kısaca santrifüjleyin ve sonra örnek buz üzerinde bekletin. </li><li> Cy3 veya Cy5 boya her tüp 22μl yüksek kalite DMSO ekleyin. Bir tüp boya 2 örnek için yeterli. Referans örnekleri etiketleme için Cy3 boya ve Cy5 boya, test örnekleri etiketleme için. </li><li> Iyice karıştırın boyalar Vortex. Kullanıma hazır olana kadar koyu boyaları tutun. Kullanmadan önce 1 saat daha erken boya hazırlamak etmeyin. Herhangi bir noktada boya / DMSO karışımı hiç su alır emin olun. </li><li> Her bir numune için hazırlanan DMSO / Cy boya 11μl ekleyin. Hafifçe karıştırın ve iyice karıştırınız. </li><li> 30-45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Kalay ile Kapak örnekleri veya ışığa maruz kalmanın en aza indirmek için bir çekmecede saklayın. </li><li> Inkübasyondan sonra, tepkisini gidermek için her bir örnek 4.5μl hydroxlyamine ekleyin. Hafifçe karıştırın ve iyice karıştırınız. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Kalay ile Kapak örnekleri veya ışığa maruz kalmanın en aza indirmek için bir çekmecede saklayın. </li></ol> Bölüm 2: Arna temiz-etiketli <ol><li> Vortex RNA bağlayıcı boncuk kısaca kullanmadan önce düzgün bir karışım elde etmek için. </li><li> Oda sıcaklığında Arna Cilt Mix hazırlayın (Tablo 1) . </li><li> Vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> En az 10 dakika süreyle, 50-60 ° C&#39;de bir 1.5mL tüp ve inkübe Arna Elüsyon Tampon Aliquote. </li><li> Her bir örnek 70μl Arna bağlayıcı karışımı ekleyin ve 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme iyice karıştırın. </li><li> PCR plaka 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın. </li><li> Her numune için% 100 izopropanol 50μl 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Yavaşça örnekleri iyice karıştırmak için en az 2 dakika süreyle orbital çalkalayıcı plaka sallayın. </li><li> Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar stand plaka bırakın. </li><li> Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. Süpernatant parlak pembe ya da tüzel kişiliği olmayan boya molekülleri nedeniyle bu noktada bir parlak mavi olmalıdır. </li><li> Manyetik stand plaka çıkarın. </li><li> Her iyi 100μl Arna Yıkama Çözeltisi ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk tam bu aşamada dağıtmayın. </li><li> Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. </li><li> Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Manyetik stand plaka çıkarın. </li><li> Yıkama 100μl Arna Yıkama Çözümü ile 2. kez tekrarlayın. </li><li> 2. yıkamadan sonra, maksimum hızda 1 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Örnekleri overdry etmeyin! </li><li> Her numune için 20μl önceden ısıtılmış Arna Elüsyon Tampon ekleyerek boncuk Arna Zehir. </li><li> 3 dakika orbital çalkalayıcı plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor. </li><li> Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak. Süpernatant temizlenmiş, etiketli Arna örnekleri içerir ve bir soluk pembe ya da soluk mavi olmalıdır. </li><li> Yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) dikkatlice yıkandı, Arna aktarın. </li><li> (Opsiyonel adım) Mikroarray modülü kullanılarak NanoDrop spektrofotometre 1.5μl ölçerek örneklerinde RNA konsantrasyonu ve boya miktarını kontrol edin. </li><li> Hemen sizin seçtiğiniz bir mikroarray platformu üzerine etiketli Arna melezleşme ya da alternatif olarak, -80 etiketli Arna depolamak ° C hibridizasyon için hazır olana kadar. </li></ol> Tablo 1 Arna Bağlama Mix <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> 1 reaksiyon için Tutarı </td></tr><tr><td> RNA Cilt Boncuk * </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> Boncuk Tekrar Süspansiyonu Çözüm * </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> % 100 izopropanol ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> Arna Cilt Tampon Konsantre </td><td> 50μl </td></tr></tbody></table> * RNA bağlayıcı boncuk Mixilk boncuk tabanda çözüm ** Izopropanol Arna bağlayıcı tampon konsantre eklemeden önce ekleyin ve iyice karıştırın.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Kritik Adımlar Amino alil kaplin yaparken, kaplin önce kısa bir süre DMSO (1 saatten az) boya tekrar süspansiyon ve aktif boya grubu ile reaksiyona girer hiçbir su, boya / DMSO karışımı içine alır sağlamak için kritik öneme sahiptir. RNA (1-2uL yerine tamamen kuru aşağı kurutulmuş olabilir) overdry ve kaplin tampon tekrar süspansiyon haline getirin. Kaplin reaksiyon sırasında, zaman zaman Flicking, karanlıkta reaksiyon tutmak ve istenirse aşağı doğru döndürün. Uygula...

<table><tbody><tr><td>CyDye Etiketleme Sonrası Reaktif Boya Paketi</td><td>Reaktif</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>Hem Cy3 hem de Cy5 boyalarını içerir</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spektrofotometresi</td><td>Diğer</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Veya eşdeğer bir spektrofotometre</td></tr></tbody></table>

vaccinia virüs enfeksiyonu &amp; virus gen İfadesi zamansal analizi: bölüm 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Aile<em&gt; Poxviridae</em&gt; Sadece enfekte hücrelerin sitoplazmasında çoğaltmak virüsler içeren büyük çift iplikli DNA oluşur. Üyeleri<em&gt; Orthopox</em&gt; Cinsine dahil variola, insan küçük çiçeği etkeni, monkeypox ve vaccinia (VAC), virüs aile prototipik üyesi. Göreceli olarak büyük (~ 200 kb) vaccinia genom içinde gen üç sınıfa kodlanır: erken, orta ve geç. Her üç sınıf, viral kodlanmış RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu olsa da, her sınıf, virüsün yaşam döngüsü içinde farklı bir fonksiyon sunar. Poxviruses enfeksiyon sırasında ev sahibi hücresel ortamı modülasyonu için çoklu stratejiler kullanmaktadır. Hem ev sahibi hem virüs gen ekspresyonu düzenlenmesi anlamak için, biz, hem virüs ve konak hücrelerine transkript bolluk analiz etmek için genom yaklaşımlar kullanılmaktadır. Burada, birkaç saat sonrası enfeksiyon Vaccinia virüs ve örnekleme RNA HeLa hücrelerinde zaman ders enfeksiyonları göstermektedir. Her iki konak ve viral toplam RNA gen ekspresyonu analizi için mikroarray&#39;ler hibridizasyon için izole edilmiş ve yükseltilir.

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Bölüm 3 floresan boyalar amino alil kaplin hem ev sahibi hem viral örnekleri amplifiye RNA etiketleme süreci anlatılmaktadır. 3 Bölüm 3

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3

Poxviridae ailesi, yalnızca enfekte hücrelerin sitoplazmasında replike olan, büyük çift sarmallı DNA içeren virüslerden oluşur. ... üyeleri

Merhaba, ben Whitehead Biyomedikal Araştırmalar Enstitüsü'nde Kate Rubins laboratuvarından Judy Y. Burada, hem vaccinia virüsle enfekte edilmiş hela hücrelerinden hem de virüsten toplanan antisense RNA örneklerinin, boyaların amino allyl LEO eşlemesi yoluyla nasıl işaretleneceğini gösteriyoruz. Ardından, işaretli A RNA'nın nasıl temizleneceğini ve gen ekspresyonunun mikroarray analizi için hibridizasyona nasıl hazırlanacağını gösteriyoruz.Önceki JoVE videolarında viral enfeksiyonlar, toplam RNA izolasyonu ve RNA amplifikasyon adımlarının nasıl gerçekleştirileceği vurgulanmıştır. Öyleyse başlayalım. RNA etiketlemesine başlamak için, öncelikle 1 µg RNA örneğini 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine ekleyin.Örnekleri, tamamen kuruyana kadar düşük ısıda veya ısıtmadan vakumlu kurutmaya bırakın. Her tüp kurur kurumaz kapağını kapatın. Örnekler kuruduktan sonra aşırı kurutulmamaları önemlidir.Her tüpe dokuz µL kenetleme tamponu ekleyin ve A RNA'sını bir dakika boyunca hafifçe vorteksleyerek yeniden süspande edin; örneği tüpün dibine toplamak için kısa süreli santrifüjleyin ve ardından örneği buz üzerinde bekletin. Daha sonra, SCI 3 veya S 5 boyası içeren her tüpe 22 µL yüksek kaliteli DMSO

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. 3 Bölüm...

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2

Viral enfeksiyon katılan Roman konakçı faktörleri fonksiyonu RNAi tarama hücre tabanlı genom zarara tespit edilebilir.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Oncolytic virüsler kanser tedavileri için umut vericidir. Tedavisi öncesinde hastalar elde edilen canlı doku örneklerinin infectability tespit etmek için bu tedavi yaklaşımı yeteneği benzersiz bir avantaj. Bu protokol için dokuların süreci...

Ex Vivo Enfeksiyon Oncolytic Virüsler Canlı Doku

Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında nükleer-için-sitoplazmik translocation uğrar. Bu olay moleküler mekanizması bilinmemektedir. Burada biz confocal mikroskop ICP0 translocation gelecek mekanik çalışmalarda kantitatif analiz etmek için zemin bırakır HSV-1 enfeksiyonu hareketinde ICP0 ölçmek için bir araç olarak nasıl kullanılacağını açıklar.

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

Öğrenin, Vaccinia virüsü ile enfekte HeLa hücrelerinden izole edilen RNA örneklerini amino alil boya kovalent bağlama yöntemiyle etiketleme ve mikrodizi analizi için hazırlama tekniklerini.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3

Daha fazla video keşfet