Geniş Alan Mikroskop kullanarak Uzun vadeli Görüntüleme Memeli Hücreleri

Aslında yapacağım şey, önce buraya monte etmek ve sonra sizi değiştirmek. Şimdi aspirasyon yapacağım, mümkün olduğunca nazik olmaya çalışacağım. Tamam. Birkaç saniye boyunca sadece bekletiyorum. Tamam. Pekala.

Yaşam tarzı görüntüleme ızgaramızın önemli özellikleri şunlardır: Cihaz ters bir mikroskoptur, yani objektif ve buradaki örnekler objektifin altındadır. Böylece objektif yukarı bakmaktadır ve objektifler ile örnekler dahil olmak üzere mikroskobun tamamı, ya da neredeyse tamamı 37 °C'dedir. Yani bu plastik kutunun içindeki her şey 37 °C'dedir.

Sahnenin hemen üzerinde bir hava ve CO2 karışımı bulunmaktadır. Bu, %5CO2'dir. Buradaki temel fikir, numunenin aslında bir hücre içinde olmasıdır; bu durum bir hücre inkübatörü gibidir.

Böylece, hava ve CO2 için olan karıştırıcımız burada; burada nemlendirilir ve ısıtılır, ardından sahne üzerindeki numuneye borularla iletilir. Tamam. Bugün sadece tek kanallı GFP floresan görüntüleme yapacağız. Bu, %5 CO2'nin girdiği hortumdur ve doğrudan sahne tutucusuna oturur.

Bu önemli. Ardından bunları kapatıp indirebilir ve ilk konumumuza geçebiliriz. Yapacağım şey, kontrol numunem olan ilk alana gitmek ve ekranda gördüklerime göre konumları belirlemek olacaktır.

Bu yüzden, her yeni kuyucukta mikroskoba gerçekten baktığımdan emin oluyorum, çünkü her kuyucuğun odak düzlemi farklıdır; tabağın alt kısmı tamamen düz değildir. Bu nedenle, kuyucuktan kuyucuğa geçerken hassas ayarlamalar yapmanız gerekecektir. Şu anda ilk kuyucuktayım; odaklama yapacağım, yani mikroskobun iletime ışığını açtım.

Tüm ışığın okülerlere gittiğinden emin oluyorum. Ardından bakarak temiz bir alan elde ettiğimden emin oluyorum. Sonrasında ise normal ışığı kapatıp floresan ışığını açarak, incelediğim hücrelerin sağlıklı göründüğünden ve apoptotik olmadığından emin oluyorum.

Ve, bunu kapatıyorum. Ardından yaptığım şey göndermek; yani şimdi konumları seçmeye başlayacağım, bu da ışık yolunu kameraya yönlendirmem gerektiği anlamına geliyor. Kamera tam burada.

Mikroskoba görüntünün tamamını kameraya göndermesini söylüyorum, böylece okülerlerden hiçbir şey görünmez. Ardından mikroskobu kontrol eden yazılımda, bizim amaçlarımız için uygun olan psy filtre setini seçeceğim. Sonrasında ise bir pozlama süresi belirleyeceğim.

Bu hücreleri çok iyi tanıyorum ve 0.2 saniyelik bir pozlama süresi aldıklarını biliyorum. Bu nedenle yazılıma bunu yapmasını söylüyorum. Ardından odaklama düğmesine basacağım.

Bu alan, temel olarak canlı hücrelerden oluşuyor. Bir ışık yanacak ve, hücreleri görüp göremediğinizden emin değilim ancak buranın iyi bir alan olmasının nedeni, tüm hücrelerin, floresan özellikleri bakımından bile, uygun olmasıdır; apoptotik hücre bulunmamaktadır. Apoptotik hücreler genellikle çok parlak olma eğilimindedir ve alanda herhangi bir kir veya kalıntı yoktur.

Ve görebileceğiniz üzere bunlar aslında, bu bir metafaz hücresi ve şu da bir metafaz hücresi, şuradaki ise muhtemelen mitozdan yeni çıkmış bir hücre. Bunu söyleyebiliyorum çünkü bu iki kromatin setinin birbirine göre çok düzgün bir şekilde konumlandığı görülüyor. Sanki anfazdan yeni çıkmışlar gibi.

Yani bu uygun bir alan. Pozlama süresinin ve filtre setinin doğru olduğunu bildiğime göre —ki bu durum kullanılan yazılıma göre değişiklik gösterecektir— konumları kaydedeceğim; böylece yazılım bu alanın X, Y, Z konumunu hafızasına almış olacak. Ardından, aynı kuyucuk içerisinde başka bir alan seçerken, objektiften bakmak yerine deklanşörü açıp ekranda gördüklerime dayanarak yeni alanlar belirleyeceğim.

Dolayısıyla orada toniklerimden hiçbirini görmüyorum. Ancak yine de, güzelce merkezlenmiş olsalar bile, bu hücreler PS'den geçecek; devam ediyorum, işte iyi bir örnek. Bundan kaçınacağım şeylerin iyi bir örneği burada, ne kadar parlak olduğuna bakın?

Bu çok parlak. Muhtemelen apoptotik bir hücre kalıntısıdır. Burayı tercih etmeme sebebim ise, çok parlak olduğu için yazılım otomatik odaklama yaptığında sadece oraya odaklanacak olması ve böylece diğer tüm hücrelerle aynı düzlemde olmayacaktır.

Ve böylece o alandan herhangi bir bilgi elde etmeyeceğim. Bu güzel görünüyor. Şurada bir pro-metafaz var, bu ise bir metafaz.

Böylece, her kuyucuktan üç pozisyon alacağım. Bu üç pozisyondur ve şimdi bir sonraki kuyucuğa geçiyorum, böylece muhtemelen her 10 dakikada bir görüntü alacağım. Bu bir orta yoldur.

Canlı hücre görüntüleme her zaman bir ödünlemedir, değil mi? Görüntüleme yapmanız gerekir ancak hücreleri, özellikle mitozla ilgileniyorsanız, sağlıklı tutmanız gerekir. Bu nedenle, floresan hatta maruz kalımlarını en aza indirmeniz gerekir.

Ancak bilgi edinmek istiyorsunuz. Bu nedenle görüntüler almanız gerekiyor; yani bir ödün vermeli, neyi yakalamak istediğiniz ve ne tür bir bilgi elde etmek istediğiniz konusunda bir seçim yapmalısınız. Bizim amacımız doğrultusunda, mitoz genellikle yaklaşık bir saat sürer.

Yani 10 dakikalık aralıklar alıyorsak, bu oldukça yeterli. Profazı, metafazı, anafazı görüyoruz ve hücre döngüsünün bu belirli aşamalarını etkileyen tedaviler, ilaçlar veya siRNA'lar olduğunda bunu gözlemleyebiliyoruz. Dolayısıyla bizim amaçlarımız için bu yeterli, ancak her zaman daha fazlasını isteriz.

Her zaman daha fazla konum veya daha hassas zaman ve aralık gibi özellikler isteriz. Dolayısıyla bu bir ödünleşimdir. Şimdi, başlat düğmesine basacağım.

Yazılımımız, ilk aşamada bir otomatik odaklama işlemi gerçekleştirir. Başlat'a bastığımda otomatik odaklama başlamalıdır ve otomatik odaklama sırasında shutter'ın açılıp kapandığını göreceksiniz. Şimdi başlat'a basıyorum.

İşte panjurun açılıp kapanması bu şekilde. Z motoru devreye giriyor ve aslında en yüksek kontrastlı, dolayısıyla en net olan düzlemi bulmaya çalışıyor. Ekran üzerinde, en iyi odak düzlemini bulmaya çalışırken içeri girip çıktığını görebilirsiniz; bu durum endişe verici olabilir.

Yaptığı işlem, en iyi odağı, yani görüntünün en net olduğu düzlemi bulmak için Z motorunu sürmektir. Ardından orada bir görüntü alır ve bu Z konumunu kaydeder. Daha sonra, sonraki 12 geçiş için bu Z konumunu kullanacaktır.

Ardından otomatik odaklama işlemini tekrar gerçekleştireceğiz. Ne tür deneyler yapıyorlar? Tamam, laboratuvarımız çoğunlukla mitotik ilerlemeyi nelerin düzenlediğini anlamakla ilgileniyor veya en azından ben bunu anlamakla en çok ilgileniyorum.

Canlı hücre görüntüleme ve özellikle çok pozisyonlu, uzun süreli görüntüleme mikroskobumuz ile hücrelerin mitoza giriş ve çıkışlarını iki veya üç gün boyunca filme alabilir ve böylece süreci anlayabilmek için birden fazla mitoz döngüsünü görüntüleyebilirsiniz. Ardından, incelemek istediğiniz hücrelere ilaçlar, RNA'lar veya herhangi bir perturbasyon uygulayabilirsiniz. Böylece bu ilaçların veya genlerin mitoz ilerleyişinin düzenlenmesinde nasıl bir öneme sahip olduğunu anlayabilirsiniz.

Sabitlenmiş hücre çalışması değil, canlı hücre çalışması olduğu için, mitozu etkilemek için ne zaman bir perturbasyon uygulamanız gerektiğini veya mitozun hangi evresinin etkilendiğini anlayabilirsiniz. Bu açıdan gerçekten çok güçlü bir yöntem. Peki, bu deneylerin temel teknik unsurları nelerdir?

Olası problemler nelerdir? En büyük sorun, düzeneği kurmanın yanı sıra -ki düzeneği kurmak basit bir işlem değildir- birçok kişide düzeneğin olması ancak bunun sizin uygulamanız için düzgün çalıştığından emin olmaktır.

Finansal boyut, bilirsiniz, azımsanacak bir miktar değil. Bir yandan cihazın kurulumu var, diğer yandan ise veriler toplandıktan sonra gerçek bir veri analizi sorunu ortaya çıkıyor. Bu videolar, örneğin, her birinde 30 hücre bulunan 40 video topladığınızı varsayalım; yani görüntülediğiniz 40 alan var ve bu alanların her birinde 30 hücre bulunuyor; bu durumda her bir videoyu tek tek inceleyip videodaki her bir hücreye bakmanız gerekiyor.

Dolayısıyla veri analizi yapmak gerçekten çok uzun zaman alıyor. Yani, toplamanız iki gün süren verileri analiz etmek bir haftayı buluyor. Bu durum, çok miktarda veri toplama açısından çok büyük bir engel teşkil ediyor.

Yani, yüksek hacimli veri toplama işlemi olsa da yüksek hacimli bir analiz söz konusu değil. Peki, bu deneyi gerçekten yüksek hacimli hale getirmek için ne yapardınız? Laboratuvarımız, veri analizini otomatik olarak gerçekleştiren bir program geliştirme sürecindedir.

Ve oldukça başarılı bir program. Mükemmel değil. İnsan gözü her zaman daha iyidir, ancak program bu seviyeye yaklaşmaktadır.

Peki, bu deneyin ilginç uygulama alanları nelerdir? Hücre bölünmesi dışında değinebileceğiniz başka alanlar var mı?

Canlı hücre görüntüleme için mi demek istediniz? Evet. Şey, hücre hareketliliği analizleri yapabilirsiniz. Kullanılan mikroskopi yöntemine bağlı olarak, hücrelerin nasıl hareket ettiğine bakabilirsiniz, hatta gerçekten isterseniz tümör gelişimini de inceleyebilirsiniz.

Ancak, eğer doğru görüntüleme düzeneğine sahipseniz, hemen hemen hiçbir şeyle sınırlı kalmazsınız. Bizim mikroskobumuz geniş alanlıdır ve 20x objektif kullanıyoruz. Bu oldukça düşük çözünürlüklü bir düzenek olsa da, görmemiz gerekenler için yeterlidir.

Yani varlar, ancak kesinlikle sınırlanmazsınız. Biyoloji gibi herhangi bir dinamik deney türüne sahip olan her şey, canlı hücre görüntülemeden gerçekten fayda sağlar. Örneğin, bizim cihazımızda yapamasanız bile kalsiyum görüntüleme bir canlı hücre yöntemidir.

Bunun için kesinlikle canlı hücre görüntülemeye ihtiyacınız var. Belirttiğim gibi, hasta analizleri, motilite analizleri ve benzeri çalışmalar canlı hücre görüntülemeden gerçekten fayda sağlayacaktır. Önceki deneyimleriniz hakkında birkaç söz söylemek ister misiniz?

Bu teknikler üzerinde ne kadar süre çalıştınız? Daha önce nelerle uğraştınız? Vay canına. Doktora eğitimim sırasında bununla çalışmadım.

Çok sayıda konfokal mikroskopi çalışması yaptım ancak canlı hücre görüntülemesi yapmadım. Bu nedenle doktora sonrası çalışmalarım sırasında, Dr. King'in bu düzeneği edinmesine ve bu fragmanların kurulumunu gerçekleştirip sistemi çalışır hale getirmesine yardımcı oldum. Dolayısıyla doktora sonrası dönemimde, hem geniş alan mikroskobumuzdaki zaman aşımı (TimeLapse) görüntüleme hem de konfokal mikroskopi ile zaman aşımı (TimeLapse) görüntüleme konularında geniş deneyim kazandım.

Ve bunun gerçekten güçlü olduğunu söyleyebilirim. Çok fazla bilgi elde ediyorsunuz ancak mükemmel şekilde çalıştırması kolay değil. Bu nedenle, sürecin her küçük adımında gerçekten büyük bir dikkat ve detaylara karşı yüksek bir özen gerektiriyor.

Ve, ardından hala sorunlar yaşayabilirsiniz. Bu yüzden zorlu bir uygulama; ancak bilimsel probleminizi incelemek için buna ihtiyacınız varsa, bu açıdan paha biçilemezdir, fakat zordur. Bu nedenle, ne yaptığını bilen birini bulun ve ondan yardım alın.

Tavsiyem budur. Çok iyi.