Name: Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Öğrenin, konfokal mikroskopi kullanarak zebra balığı embriyolarında gelişmekte olan omurgalı beynini tek hücre çözünürlüğünde canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel sinirbilim araştırmalarında detaylı hücresel analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sive laboratuvarda ilk kez bu tekniği geliştirdi Dr. Jennifer Gutzman çok teşekkür ederiz. Lütfen plazmid kodlama CAAX-GFP mRNA sağlanan Dana-Farber Kanser Enstitüsü Boston, MA de JB Green teşekkür ederiz. Konfokal görüntüleme Whitehead WM Keck Vakfı Biyolojik Görüntüleme Tesisleri&#39;nde gerçekleştirildi. HS NIHMH70926 tarafından desteklenmektedir. EG, bir NSF öncesi doktora bursu ile desteklenmektedir.

1. Enjeksiyon için mRNA hazırlanması <ol><li> Bu prosedürde kullanılan mRNA bir plazmid kodlama CAAX eGFP (memGFP) mRNA transkripsiyonu. İlk plazmid ve ark, 2008 Gutzman göre linearize. </li><li> Sonra mMessage mMachine kiti kullanılarak memGFP mRNA yazıya. </li><li> Ortaya çıkan 1μg/μl için mRNA, kısım, ve mağaza sulandırmak -80 ° C </li><li> Bir hücre aşamada embriyo şerit genişliği ile% 1 agaroz bir enjeksiyon kalıp hazırlayın. </li><li> Enjeksiyon bir gün önce, kadın erkek ayıran çiftleşme kafesleri kurdu. </li><li> Enjeksiyon gününde, enjeksiyon hazırlanmak için bir mikropipet çektirmenin kılcal iğneler kullanarak çekin. </li></ol> 2. MRNA enjekte <ol><li> Enjeksiyon gününde, buz üzerinde 1μg/μl memGFP mRNA bir kısım Çözülme. </li><li> 200ng/μl bir final konsantrasyon mRNA 01:05 sulandırınız su ve buz üzerinde tutmak. </li><li> 200ng/μl hazırlanan memGFP mRNA 1μl ile kılcal bir iğne yükleyin. </li><li> Gazla çalışan bir mikroenjektör bağlı bir mikromanipülatör içine yerleştirin iğne yüklendi. </li><li> 1nl enjeksiyon hacmi ayarlayın. </li><li> Önceki günden itibaren çiftleşme kafesleri kadar yabani türü balıklar bölücüler çekin. </li><li> Embriyoların kısa sürede belirtilen olarak toplayın. Orient onları mikromanipülatör uzak tarafında tek hücreli embriyo orta (Westerfield 1995) kapsamına agaroz enjeksiyon kalıp. </li><li> Koryon enjekte edilir ve mRNA tek bir hücrenin içine doğrudan yatırıldığına dair sarısı. Deneme başına yaklaşık 50 embriyolar enjekte edilir. Hücre ikiye böldü enjekte etmeyin. </li><li> , 28 ° C'de orta bir gecede embriyo inkübe embriyolar </li></ol> 3. Montaj ve Görüntüleme Embriyolar <ol><li> Embriyoların montaj ve görüntü için, ilgi bir zaman noktasında stereomikroskopta bir saat önce embriyoların forseps ile koryon çıkarın. </li><li> 4 embriyolar kadar montaj için bir slayt hazırlayın. <ul><li> Yaklaşık 1 cm çapında bir delik ile 2mm kalınlığında özel olarak tasarlanmış plastik slayt alt lamel mühür silikon vakum gres kullanın. </li><li> % 0.7 agaroz slayt delik doldurun ve yaklaşık 20 dakika veya sertleşmiş kadar bekletin </li><li> Agaroz katılaşmış sonra, her embriyo monte etmek için silindirik delik oluşturmak için 200μl pipet uçları kullanarak küçük bir fiş çıkarın. </li></ul></li><li> Diseksiyon mikroskobu altında agaroz dolu slayt embriyolar yerleştirin. Embriyoların uyutmak için tricaine 50μl (Westerfield, 1995) ekleyin. </li><li> Altta yatan lamel karşı beyin ya da bölgeye ilgi agaroz silindirik delikler embriyolar konumuna forseps kullanın. </li><li> Agaroz embriyolar silikon vakum gres ile güvenli başka bir lamel ile örtün. </li><li> Görüntü kullanılarak embriyo ters bir lamba, floresan, lazer tarama veya disk konfokal mikroskop iplik. 63x ya da yüksek çözünürlüklü görüntüleri neuroepithelium içinde tek hücre toplamak için daha yüksek görüntü. </li><li> Görüntüler LSM yazılım TIFF dosyaları olarak ihraç ve Photoshop kullanılarak analiz edilmektedir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç Şekil 1'de gösterildiği gibi, orta beyin ve arka beyin ventriküller arasında 24 hpf zebrafish neuroepithelium bir temsilcisi konfokal görüntü. Her hücre membran bağlı GFP ile etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" alt="" width="450" height="449"> Şekil 1. MemGFP-enjekte 24 hpf zebrafish embriyo konfokal görüntüleme Canlı. (A), GFP tarafından açıklanan her hücre ile 24 hpf embriyo Neuroepithelium. Bölge görüntülü, orta beyin Beyin sınır oluşturan, orta beyin ve arka ventriküllerin (E, H, sırasıyla) ayırır.

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

Bu video, tek bir hücrenin zebrafish embriyolar içine mRNA enjeksiyon için bir yöntem ortaya koymaktadır. Burada, her bir hücre etiket için bir zar-hedefli GFP kodlayan mRNA kullanın. Daha sonra tek bir hücre çözünürlükte gelişmekte olan beyin nasıl montaj ve görüntü göstermektedir. Bu teknik bize hücre şekil değişikliği, orta beyin arka beyin sınır formasyonu (Gutzman ve ark, 2008) için gerekli olan bir roman türü, bazal daralma çalışmak için izin verdi. Benzer diğer olayların analiz omurgalı morfolojilerinden ve altta...

<table><tbody><tr><td>SeaKem GTG agaroz</td><td> Reaktif</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoik asit etil esteri (Trikain)</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Kapiler boru</td><td>Araç</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0 mm dış çap x 0,5 mm iç çap/fiber 100 mm</td></tr><tr><td>Silikon vakum gresi</td><td>Reaktif</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>Pensler</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont #5 Bio Inox</td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;Pipet uçları</td><td>Araç</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>Bunlar, 24 hpf embriyolar için uygun boyutlardır. </td></tr><tr><td>mMessage mMachine transkripsiyon kiti</td><td>Reaktif</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>SP6 RNA polimeraz</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 taramalı konfokal </td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Araç</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td>Araç</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çekici</td><td>Araç</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

konfokal mikroskop zebra balığı embriyonik beyin görüntüleme canlı

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Bu video, laboratuarımızda, gelişmekte olan zebrafish beyin (Gutzman ve ark, 2008) viraj ve katlama için gerekli hücre şekli değişiklikleri ve düzenlenmeleri analiz etmek için geliştirdiği yöntem göstermektedir. Böyle bir analiz, omurgalı beynin 3 boyutlu yapısının gelişimi için gerekli olan temel hücre biyolojisi yeni bir anlayış tanıyor ve nöral tüp morfolojilerinden çalışma yeteneğini önemli ölçüde artırır. Embriyonik zebrafish beyin 18 saat sonra döllenme (hpf) başlayarak neuroepithelium şişirmek içinde ventriküller olarak şekillenir. 24 hpf, nöral tüp morfolojilerinden ilk adımları tamamlamalısınız. Burada anlatılan yöntemi kullanarak, bir hücre aşamada embriyo mRNA kodlama membran hedefli yeşil flüoresan protein (memGFP) ile enjekte edilir. Enjeksiyon ve inkübasyonu, embriyo, şimdi 18 ve 24 arasında hpf sonra, agaroz, ters, monte edilir ve konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş. Özellikle, floresan görüntüleme için ideal bir sistem haline zebrafish embriyo şeffaftır. Analizler, orta beyin Beyin sınır ve arka beyin odaklanmış olmasına rağmen, bu yöntem 80-100 mikron derinliğe kadar zebrafish herhangi bir bölge analizi için genişletilmiş olabilir.

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Bu videoda, ...'yı bükmek ve katlamak için gerekli olan hücre şekli değişikliklerini ve yeniden düzenlenmeleri analiz etmek amacıyla laboratuvarımız tarafından geliştirilen yöntemi gösteriyoruz.

Bu prosedür, hücrenin enjeksiyon aparatının ters yönüne bakacak şekilde bir enjeksiyon kalıbına yerleştirildiği tek hücreli bir zebra balığı embriyosunun enjeksiyonu ile başlar. Ardından, iğne vitellustan geçip hücreye girecek şekilde embriyolara MRNA enjekte edilir. Ertesi gün.Plastik bir montaj lamı aros ile doldurulur. Ardından, anestezi uygulanmış bir embriyo, aros içindeki bir deliğe ters şekilde yerleştirilir ve konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Merhaba, ben Whitehead Biyomedikal Araştırmalar Enstitüsü'ndeki Dr. Hazel Sieve laboratuvarından ve MIT biyoloji bölümünden Graham.Bugün size, tek hücre aşamasındaki zebra balığı embriyolarının enjeksiyonu ve ardından konfokal mikroskopi ile beynin canlı görüntülemesi prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, omurgalı beyin morfojenezini tek hücre çözünürlüğünde incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Bu prosedürde kullanılan mRNA, C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A membran bağlı GFP kodlayan bir plazmitten transkribe edilir. Önce plazmiti sindirim yoluyla doğrusallaştırın, ardından doğrusal plazmitten M message ve machine kiti kullanarak membran GFP mRNA'sını transkribe edin. mRNA transkribe edildikten sonra, elde edilen

live-imaging-of-the-zebrafish-embryonic-brain-by-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

In vivo görüntüleme sinir sistemi gelişiminin altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Burada, larva zebra balıklarının üç boyutlu floresan mikroskobu kullanılarak in vivo tüm beyin görüntülemesi için bir protokol sunulmaktadır. Deneysel prosedür numune hazırlama, görüntü toplama ve görselleştirmeyi içerir.

İn Vivo Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi

Gelişmekte olan zebra balığı optik tektumunda mikroglia hücrelerinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için hızlı taramalı konfokal mikroskopiden yararlanan ve bu hücrelerin dinamiklerinin in vivo analizine olanak tanıyan bir yöntem gösteriyoruz.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak GCaMP kalsiyum göstergelerini eksprese eden transgenik zebra balıklarının beyin bölgelerindeki nöral aktiviteyi incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

In vivo (İn canlı) Kısmen Kısıtlanmış Larva Zebra Balıklarında Duyusal Stimülasyonla İndüklenen Nöral Aktivitenin Konfokal Floresan Görüntülemesi

Öğrenin, konfokal mikroskopi kullanarak zebra balığı embriyolarında gelişmekte olan omurgalı beynini tek hücre çözünürlüğünde canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel sinirbilim araştırmalarında detaylı hücresel analiz sağlar.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Daha fazla video keşfet