Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Bu işlem, enjeksiyon cihazından uzakta olacak şekilde yerleştirilen tek hücreli zebra balık embriyosunun enjeksiyon kalıbına yerleştirilmesiyle başlar. Embriyolar, iğnenin sarıdan hücreye doğru ilerlemesiyle MRNA enjekte edilir. Ertesi gün.

Plastik montaj sürgüsü aros ile doldurulur. Anestezi edilmiş bir embriyo, konfokal mikroskopi ile görüntülenen arostaki bir deliğe ters yerleştirilir. Merhaba, ben Grabham, Whitehead Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'nden Dr. Hazel Sieve'in laboratuvarından ve MIT'in biyoloji bölümünden.

Bugün size zebrafish embriyolarının tek hücre aşamasında enjekte edilmesi ve ardından beynin konfokal mikroskopi ile canlı görüntülenmesini göstereceğiz. Laboratuvarımızda, bu prosedürü tek hücre çözünürlükte omurgalı beyin morfogenezini incelemek için kullanıyoruz. O zaman başlayalım.

Bu işlemde kullanılan mRNA, C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A membranla bağlı bir plazmidden transkribe edilir. Önce plazmidi sindirimle doğrusal hale getirir, sonra mRNA transkribe edildikten sonra M mesajı ve makine kiti kullanılarak doğrusal plazmidden membran GFP mRNA'sını transkribe ederek, elde edilen mRNA ve suyu bir mikrolitre bir mikrograma kadar seyreltir. Eloqua ve ihtiyaç duyulana kadar eksik 80 derece Celsius'ta sakla. Enjeksiyondan bir gün önce, aşılama günü erkekleri dişilerden ayıran çiftleşme kafesleri kuruldu. Enjeksiyon için kapiler iğneleri çekmek için bir setter cihazı, mikropipet polar kullanın.

Enjeksiyon gününde bir hücre aşamasında embriyoların genişliğinde yollar içeren %1 AGA gül enjeksiyon kalıbı hazırlayın, buz üzerinde mikrolitre başına bir mikrogram konsantrasyonda membran GFP mRNA'sının bir aliquotunu eritin. mRNA'yı bir ila beş suda suya inceltin ve mikrolitrede 200 nanogram nihai konsantrasyona getirin ve buzda kalın. Kapiller iğneye hazırlanmış bir mikrolitre membran, GFP mRNA ile yükleyin, mikrolitre başına 200 nanogram.

Burada mRNA'ya enjeksiyonlarda görünür hale getirmek için %0,05 fenol kırmızısı ekliyoruz. Yüklü iğneyi, gazla çalışan mikro enjektöre bağlı bir mikro manipülatöre yerleştirin. Enjeksiyon hacmini bir nanolitre ayarlayın.

Sonra, önceki günden çiftleşme kafeslerinde kurulmuş yabani tip balıkların bölücülerini çekin. Embriyolar bırakıldıkları anda toplayın. AGA gül enjeksiyon kalıbını embriyo ortamıyla doldurun ve embriyoları mikro manipülatörden uzak bir yanda tek bir hücre ile kalıpta yönlendirin.

Korona ve sarıdan mRNA'nın doğrudan tek hücreye biriktirilmesi için enjekte edilir. Her deney başına yaklaşık 50 embriyo enjekte edin. Ancak, hücre bölündüyse, embriyolar enjekte edildikten sonra enjekte edilmeyin, embriyo ortamında gece boyunca 28 derece Celsius sıcaklıkta kuluçka yapın.

Gece kuluçkasından sonra, enjekte edilen embriyolar montaj ve görüntülemeye hazırdır. Bu işlemi başlatmak için, projeksiyon noktasından bir saat önce preses ile embriyolardan koroyu çıkarın, dört embriyoya kadar monte edilebilecek bir slayt hazırlanın. Sonra slaytı sadece slaydın üstüne kadar %0.7 aros ile doldurun ve yaklaşık 20 dakika veya aros katılana kadar bekleyin.

Aros katılaştıktan sonra, aeroslarda 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak her embriyoyu monte etmek için silindirik delikler oluşturun. Aros tıvalarını forsepsle çıkar takmadan önce. Embriyoları aeros dolu slayt üzerine disseksiyon mikroskobu altında yerleştirin.

Anestezi yapmak için 50 mikrolitre trika ekleyin. Embriyolar. Pensler kullanılarak arosun silindirik deliklerinde ters çevrilmiş embriyoları yönlendirin; beyin veya ilgi alanı, alttaki kapak kapakına karşı konumlandırın.

AGA'daki embriyolar başka bir kapak slipiyle yükseldi ve silikon vakum yağıyla sabitlendi. Embriyonlar artık görüntülemeye hazır. Embriyoyu burada gösterildiği gibi ters floresan lazer taramalı konfokal mikroskopla veya 63 x veya daha yüksek oranda dönen disk konfokal mikroskobu görüntüsüyle nöro epitelyumdaki tek hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için görebilirsiniz.

Görüntüler, LSM yazılımından TIF dosyaları olarak dışa aktarılır ve Photoshop kullanılarak analiz edilir. Bu, orta beyin ve arka beyin ventrikülleri arasında 24 saat çalışan bir zebrafish embriyosunun, nöro epitelin temsil eden konfokal görüntüsüdür. M orta beyin, ventrikül, H ise arka beyin ventrikülünü gösterir.

Her hücre zarla bağlı GFPE ile etiketlenmiştir. Gelişen zebrafish beynini tek hücre çözünürlüğü olarak analiz etmenizi sağlayan bir teknik gösterdik. Bu teknik, BA bazal daraltma adı verilen yeni bir hücre şekli değişikliği türünü incelememizi sağlamıştır.

Ayrıca diğer olgu türlerini analiz etmek ve omur organogenezi ile temel hücre biyolojisi konusundaki anlayışımızı önemli ölçüde genişletmek için de kullanılabilir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde bol şans.