Zebra balığı Beyin Ventrikül Enjeksiyon

Bu prosedür, zebra balığı embriyolarının evrelemesi ile başlar. Embriyolar ilgili evreye ulaştığında, koriondan çıkarılırlar. Ardından, embriyoları sabitlemek için aros kaplı bir kapta pipet ucuyla delikler oluşturulur ve embriyolar kuyrukları aşağı gelecek şekilde bu deliklere nazikçe yerleştirilir.

Embriyolar yerleştirildikten sonra, arka beyin yoluyla embriyonun ventrikül boşluğuna dikkatlice floresan boya enjekte edilir. Ventrikül enjeksiyonunun ardından embriyolar görüntülenir ve veriler Photoshop kullanılarak işlenir. Merhaba, ben Massachusetts, Cambridge'deki MIT'de bulunan Whitehead Biyomedikal Araştırmalar Enstitüsü'ndeki Dr. Hazel Sieve'in laboratuvarından Jennifer Gutman.

Bugün size zebrafish beyin ventrikül enjeksiyonu prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, canlı zebrafishlerde beyin ventrikül oluşumunu ve nöroepitelyal morfojenezi incelemek için laboratuvarımızda kullanıyoruz. Şeffaf zebrafish embriyolarının doğası gereği, beyin ventrikül şeklini karakterize etmek zor olabilir.

Bu teknik, sıvıyla dolu alanı çevreleyen dokudan ayırmak ve beyin ventrikül oluşum kusurları olabilecek mutant embriyoları karakterize etmek için yararlı ve basit bir yöntemdir. Öyleyse başlayalım. Zebrafish beyin ventrikülüne enjeksiyon hazırlığı için öncelikle enjeksiyon iğnelerini yaparak başlıyoruz.

Kılcal iğneleri çekmek için bir Sutter cihazının iğne poları kullanılır. Ardından kılcal iğne, Texas red dekstrin gibi floresan bir boya ile doldurulur. Sonrasında, doldurulmuş iğne mikroenjeksiyon düzeneğindeki bir mikromanipülatöre monte edilir.

İğneyi açılı bir şekilde uygun boyutta kesin. Bevel uç oluşturmak için, iğnenin damlatma boyutunu ölçün ve yağda enjeksiyon başına bir ila iki nanolitre arasında olduğundan emin olun. Bu prosedür aşamasına başlamak için, Kimmel'a göre tüm embriyolar, ilgi duyulan aşamadan 30 dakika önce enjekte edilmelidir.

Örneğin, döllenmeden 24 saat sonra ventrikülleri incelemek için embriyolara döllenmeden 23,5 saat sonra enjeksiyon yapın. İlgilenilen aşamadaki embriyo stereo mikroskobun altına yerleştirilir ve koriyon, forseps kullanılarak embriyodan dikkatlice uzaklaştırılır. Ardından, %1 agar ile kaplanmış plastik bir kap kullanılarak embriyolar için bir agar tabağı hazırlanır; agar üzerindeki delikler, plastik bir 200 µL pipet ucu ile açılır.

Aros tıkaçlarını deliklerden forseps kullanarak dikkatlice çıkarın. Embriyoyu ve embriyo ortamını delikli aros kabına aktarın. Embriyoyu anesteze etmek ve hareketini önlemek için ortama trica ekleyin.

Deney sırasında, embriyoyu kuyruğu aşağı gelecek şekilde nazikçe deliğe yerleştirin ve enjeksiyon aparatının embriyonun posterior tarafında olacağı şekilde yönlendirin. Embriyo, agar tabağına doğru şekilde yerleştirilip yönlendirildiğine göre, beyin ventrikül enjeksiyonuna hazırız. İlk olarak, mikro-manipülasyon düzeneğini, iğne ucunun yüksek büyütmede embriyo ile aynı görüş alanında olacağı şekilde ayarlayın.

İğneyi, altındaki beyin dokusuna zarar vermeden, arka beynin ince tavan plakası üzerinden R0 R1 menteşe noktasının hemen arkasına dikkatlice yerleştirin ve ventrikülleri tamamen dolduracak kadar boya enjekte edin. Embriyonun evresine bağlı olarak, ventrikül boşluğunu doldurmak için birkaç enjeksiyon gerekebilir. Embriyoya enjeksiyon yapılıp görüntüleme aşamasına gelindiğinde, embriyo için yeni bir agaroz kap hazırlanır.

Temiz bir %1aros kaplı kap kullanarak, kapta delikler açın ve tıkaçları çıkarın. Embriyoyu kaba aktarın ve embriyoyu anestezi altına almak ve hareketini önlemek için trica ekleyin. Ventrikül enjeksiyonu yapılmış embriyonun kuyruğunu, dorsal görüntüleme için uygun pozisyonda olacak şekilde deliğe yerleştirin.

Embriyo artık görüntüleme için hazırdır. Geçirgen ışık kullanarak bir görüntü alın. Embriyoyu veya mikroskobu hareket ettirmemek kritik öneme sahiptir.

Ardından, mikroskop ayarlarını değiştirin ve floresan ışıkla bir görüntü alın. Embriyoyu, hem transmisyon ışığı hem de floresan ışıkla lateral görüntüler almak için yeniden konumlandırın. Tüm görüntüleri, Photoshop'ta görüntü işleme yapmak üzere dosya olarak kaydedin.

Görüntüleri Photoshop'ta işlemek için, aynı embriyodan aynı konumda çekilmiş transmisyon ışığı ve floresan ışığı görüntülerini açın. Tüm ayarların aynı olduğundan emin olun. Her görüntü için, floresan görüntüsünü transmisyon ışığı görüntüsünün üzerine sürükleyin ve floresan görüntü seçiliyken bunları tam olarak hizalayın. Görüntü ayarlamalarını (image adjustments) seçin, ardından renk değiştirme (replace color) seçeneği ile siyah arka planı beyaza dönüştürün.

Renk değiştirme penceresinde, floresan görüntü renk bakımından homojen görünene kadar bulanıklık faktörünü sağa doğru ayarlayın. Katmanlar penceresinden "multiply" (çarpma) seçeneğini seçin. Üst üste bindirilmiş görüntüleri görüntülemek için, ventrikül boşluğu görüntünüz ile iletim ışığı görüntüsü tam olarak eşleşmelidir.

Bu dosyayı kaydedin ve diğer tüm görüntüler için işlemi tekrarlayın. Ventrikül enjeksiyonu doğru şekilde gerçekleştirildiyse, burada 25 saatlik post-fertilizasyon dönemine ait görüntülerde gösterildiği gibi, diffüz olmayan boyada keskin kenarlar görülmelidir; panel A parlak alan görüntüsünü, panel B floresan görüntüsünü ve panel C ise üst üste bindirilmiş (overlay) görüntüyü göstermektedir.

Bindirme görüntüsünün yan görünümü Panel D'de gösterilmiştir. Öte yandan, ventrikül enjeksiyonu sırasında iğne çok derin yerleştirilirse, ventrikül boşluğunun altındaki beyin dokusuna girer ve hatalı bir enjeksiyona yol açar. Bu durum, burada gösterildiği gibi, boyanın ventrikül boşluğunun dışında ve vitellusta görünmesiyle sonuçlanır. Panel E, parlak alan görüntüsünü göstermektedir.

Panel F floresan görüntüyü ve panel G üst üste bindirilmiş görüntüyü göstermektedir. Üst üste bindirilmiş görüntünün yan görünümü panel H'de gösterilmiştir. Oklar, boyanın beyin ventrikül boşluğunun ötesine geçtiği bölgeleri belirtmektedir. Bu videoda, gelişmekte olan zebrafish beyin ventriküllerine floresan boyanın nasıl enjekte edileceğini gösterdik.

Bu yöntem, beyin ventrikül boşluğunu çevreleyen nöroepitelyumla kontrast oluşturacak şekilde görselleştirmek için kullanılır ve ventrikül boşluğunun şeklinin yanı verilen çevre beyin dokusunun şeklinin belirlenmesinde son derece faydalıdır. Bu teknik, canlı embriyoda beyin ventrikül oluşumu ve beyin morfogenezi sürecinin zaman içindeki gelişimini daha iyi anlamamızı sağlar. Beyin ventrikül oluşum bozukluklarını incelemek ve beyin morfogenezi mutantlarının ilk karakterizasyonunu yapmak için mükemmel bir araçtır.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.