S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Bu prosedür, yem suşunun SLAC kontrol suşunda normal amino asitler ve ağır izotopik lizin ve arginin içeren ortamda kültürlenmesiyle başlar. Her iki suşun eşit miktarları karıştırılır ve öğütme ve sıvı nitrojen ile parçalanır Ham lizatlar, önce santrifüj ile peletlenir ve daha sonra sferos boncuklarına bağlanarak temizlenir. Hücre lizatı daha sonra IgG boncuklarına bağlanır.

IgG boncuklarına bağlanan proteinler proteaz, bölünme ile ima edilir ve çökeltilir. Numune artık kütle spektrometresi ile analiz için hazırdır. Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Yaşam Bilimleri Enstitüsü Hücre Çevre Biyolojisi Bölümü'ndeki Lone Lab'dan Jesse Chao.

Bugün size silak adı verilen kantitatif proteomik analiz için bir prosedür gösteriyorum. Afinite saflaştırması ile birlikte. Bu prosedürü laboratuvarımızda protein komplekslerini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım Bu prosedürde, yem suşu normal amino asitler içerirken, SLAC kontrol suşu ağır izotopik, lizin ve arginin içerir. Başlamak için önce bir litre büyütün, yem suşunun ve kontrol suşunun her birini ekranınızda gösterilen değere ayrı ayrı büyütün. Daha sonra, kültürü 500 mililitrelik Nalgene santrifüj tüplerine dökün.

Pelet hücrelerindeki yükü 2.580 RCF'de dengeleyin, ortamı boşaltın ve peleti yeniden askıya alın. Hücreleri 50 mililitreye aktarırken 50 mililitre soğuk D H2O ile tüpleri santrifüjleyin, hücreleri 3000 RCF'de peletleyin. Bu noktada peleti eksi 80 santigrat derecede dondurabilirsiniz.

Kontrol suş kültürünü, kuru pelet ağırlığına göre bire bir olarak yem suş kültürüyle eşleştirmeyi unutmamak önemlidir. Her hücre peletini bir ila 2000 proteaz inhibitörü kokteyli ile 10 mililitre NP 40 tamponunda yeniden süspanse edin. Bir tüpü diğerine doğrudan boşaltarak iki hücre kültürünü karıştırın.

Önce hücreleri öğütmeye başlamak için, önceden soğutulmuş harcın içine sıvı nitrojen dökün ve tamamen buharlaşmasına izin verin. Daha sonra, harca iki mililitre hücre ekleyin. Hücreleri dondurmak için biraz sıvı nitrojen dökün.

Hücreler ince hale gelene kadar hücreleri öğütün. Toz. Tüm hücreler topraklanana kadar işlemi tekrarlayın. Hücrelerin çözülmesine izin vermediğinizden emin olun.

Gerektiğinde sıvı nitrojen ekleyin. Ardından, tozu buz gibi soğuk bir behere aktarın ve oda sıcaklığında çözdürün. Kenarlar çözülmeye başladığında, çözüldükten sonra bir ila 200 PIC ile 20 mililitre NP 40 tamponu ekleyin.

Ham lizatı 40 mililitrelik Nalgene tüplerine aktarın ve 30 dakika boyunca bir Sovos SA 600 rotorunda 16.000 RPM'de döndürün. Beklerken, SRO'ların iki B boncuğundan 300 mikrolitre alın ve boncukları 300 mikrolitre NP 40 tamponunda üç kez yıkayın. Daha sonra, boncukları bire bir bulamaç içinde olacak şekilde 300 mikrolitrelik tamponlarda yeniden askıya alın.

Bir sonraki adım, hücre lizatını önceden temizlemektir. Bunu yapmak için önce süper natini yeni bir tüpe aktarın ve Spheros'a iki B boncuğu ekleyin. Soğuk bir odada dönen bir platformda 30 dakika inkübe edin.

İnkübe edilirken, 300 mikrolitre IgG SRO altı boncuk alın ve boncukları 300 mikrolitre NP 40 tamponunda üç kez yıkayın. Daha sonra boncukları 300 mikrolitrelik tamponlarda tekrar süspanse edin, böylece bire bir bulamaç içinde olurlar. Kuluçkadan sonra, SRO'ları peletleyin.

İki boncuk olsun. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra batı lekelemesi için hücre lizatının bir alikotunu saklamayı unutmayın.

Ardından IgG boncuklarını ekleyin. Daha verimli bağlama için içeriği iki tüpe ayırın, iki saat boyunca soğuk bir odada dönen bir platformda inkübe edin. İnkübasyondan sonra, boncukları dört santigrat derecede bir kromatografi sütununda toplayın.

Bağlantısız fraksiyonun bir alikotunu kaydettiğinizden emin olun. Boncukları 10 mililitre ile yıkayın. NP 40 tamponu.

Sonra, boncukları üç mililitre ile yıkayın. TEVC arabelleği. Yine, boncukların bir kısmını kaydetmeyi unutmayın.

Bu, boncukları elüte etmek için bağlanma verimliliğini yansıtacaktır. İlk olarak, bir mililitre TEVC tamponuna beş mikrolitre ACTEVV ekleyin. Boncuklara TEVC tamponu ekleyin ve karıştırın.

İçeriği daha verimli bir şekilde karıştırdıktan sonra iki adet 1,5 mililitrelik EINOR tüpüne aktarın ve gece boyunca soğuk bir odada dönen bir platform üzerinde inkübe edin. Daha sonra, boncukları aşağı doğru döndürün ve elüatı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Boncukları yıkadıktan sonra ilave 0,5 mililitre TEVC tamponu ile yıkayın.

Sekizi bir tüpte birleştirin. Toplamda 1,5 mililitre ELU sekizine sahip olmalısınız. Çökelmek için TEV Elu sekizinin bir alikotunu saklayın.

Yüzde yüz TCA ile alikotları %25 TCA'ya ayarlayın. Bunu yapmak için, 1.5 mililitre LU sekizini her biri 750 mikrolitrelik iki tüpe ayırın. Tüpe 250 mikrolitre% 100 TCA ekleyin.

Çözümünüz sütlü hale gelmelidir. Ardından, 30 dakika boyunca buzun üzerine koyun. İnkübasyondan sonra karışımı periyodik olarak girdaplama.

Masa üstü santrifüjde soğuk bir odada 30 dakika boyunca maksimum hızda döndürün. 0.05 normal hidroklorik asit içeren 500 mikrolitre buz gibi aseton ile bir kez yıkayın. Ardından dört santigrat derecede maksimum hızda beş dakika döndürün.

Daha sonra, 500 mikrolitre buz gibi, aseton ile bir kez yıkayın ve dört santigrat derecede maksimum hızda beş dakika döndürün. Döndürdükten sonra, gümüş lekeleme için asetonu ve kuru peleti dikkatlice çıkarın. Pelet, SDS numune tamponunun bir katı olan 50 mikrolitrede yeniden süspanse edin.

Çökeltilmiş proteini kütle spektrometresi tabanlı analiz için kullanmayı planlıyorsanız, etanol kullanarak çökeltmeniz önerilir. Bunu yapmak için önce 20 mikrogram glikojen ekleyin, ardından numuneleri yüzde yüz etanol ile beş kez seyreltin ve pH 5.0'da 2.5 molar stok ile 50 milimolar sodyum bikarbonata ayarlayın. Tüpü ters çevirerek çözeltiyi karıştırın.

Oda sıcaklığında iki saat bekletin. Son olarak, içeriği iki einor tüpüne bölün. Çökeltilmiş proteini oda sıcaklığında 12.000 GS'de 10 dakika santrifüjleyerek peletleyin.

Saflaştırma prosedürü sırasında kaydedilen alikot, önceden temizlenmiş hücre lizatını, bağlı fraksiyonu, bağlanmamış fraksiyonu ve kaçan fraksiyonu içermelidir. Yukarıdaki alikotların protein içeriklerini, deneyin bağlanma ve elüsyon verimliliğini yansıtmak için Antit TAP antikoru veya gümüş boyama kullanarak Western blotlama ile analiz etmenizi öneririz. Bu gümüş leke jelinde, SCS iki musluk etkileşiminde saflaştırılmış, ortaklar görselleştirildi ve bu Western blot'taki etiketsiz bir kontrolle karşılaştırıldı.

SCS iki musluğun saflaştırılması sırasında alınan çeşitli fraksiyonlar, Antit musluk antikoru kullanılarak Western blotlama ile analiz edildi. SCS iki musluğun, TEV proteaz bölünmesi ile elucian'dan sonra daha düşük bir moleküler ağırlıkta göç ettiğini ve elüsyondan sonra IgG boncuklarında S SCS iki musluk kalmadığını fark edin. Bu, saflaştırmanın oldukça verimli olduğunu doğruladı.

IgG boncukları ile afinite saflaştırarak protein komplekslerini nasıl saflaştıracağınızı az önce gösterdik. Bu prosedürü yaparken, saflaştırma prosedürüne başlamadan önce temel gerinim ve kontrol gerinimini kuru pelle ağırlığına göre eşleştirdiğinizden emin olmayı unutmamak önemlidir. LAC bize protein bağlayıcı ortakların tarafsız ve qued ölçümlerini sağladığından, numune kaybını en aza indirmek için musluk saflaştırmasının yalnızca ilk aşamasını gerçekleştiriyoruz.

Önemli miktarda belirsiz bağlanma yaşarsanız, soğuk su veren liman kılavuzunda bulunabilecek tüm protokolü uygulamak isteyebilirsiniz. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.

Hey, hadi, mark. Ah, git.