Name: S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Öğrenin, S. cerevisiae'de SILAC ve afinite saflaştırma ile kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlama yöntemini. Bu teknik, Scs2p bağlanma ortaklarını belirlemek için yüksek hassasiyet sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gereç ve Yöntem <ol><li> Maya suşları <ul><li> Bu çalışmada kullanılan tüm suşlar BY4742 arka plan üzerine dayanır. Arg4 silme suşu (G418: Mat, his3, ura3, leu2 ve Arg4): BY4742 (Mat alfa, çiftleşme SILAC kontrol suşu (Mat, his3, leu2, ura3, lys2 ve Arg4: G418) tarafından yapıldı his3, leu2, ura3 ve lys2) ve mayotik haploids tetrad diseksiyonu ile elde edilmiştir. Bu nedenle, kontrol suşu, lisin ve arjinin bir auxotroph. Yem gerilme vektörü pBS1479 kullanarak PCR-aracılı homolog rekombinasyon tarafından yapılmıştır. Bu nedenle, bu çalışmada kullanılan epitopu etiketi tandem yakınlık arıtma (TAP) etiketi (3). </li></ul></li><li> SILAC: <ul><li> SILAC kontrol suşu% 98 L-lizin-4 ,4,5,5-D4 (0.03 g / L, Cambridge İzotop) ve% 98 L-arjinin-13 C 6 (desteklenen minimum ayrılma medya yetişen 0.036 g / L, Cambridge İzotop). </li><li> Yem zorlanma normal izotopik amino asitler düzenli zengin bir ortamda yetişmiştir. </li></ul></li><li> İlk aşama TAP arıtma [Bu protokol Cold Spring Harbor laboratuvar elbette manuel (4) uyarlanmıştır] ** Önceki gece -80 ° C derin dondurucu arıtma, ön-chill havanda. Ayrıca, bir beher öncesi chill -20 ° C ** (1 L kültür) hemen önce bu tamponlar olun: <ul><li> 25 ul PIC (1 / 2000), 1M DTT 50 ul ile 30 ml NP-40 tampon </li><li> NP-40, 1 / 200, PIC 1M DTT 50 ul ile tampon 20 ml </li><li> TEV-C 10 ml, 1 / 2000 PIC ile tampon, 1 M DTT 10 ul </li></ul></li></ol> SILAC ve sınava hazırlık <ol><li> Yem zorlanma ve kontrolü her OD 600 = 1,0-1,3 için ayrı ayrı zorlanma 1L büyütün. </li><li> 500ml Nalgene santrifüj tüplerine kültür dökün. 2580X g. yük ve pelet hücreleri Dengesi </li><li> 50ml santrifüj tüplerine hücreleri aktarımı yaparken soğuk dH 2 O 50ml ile Durusu medya ve tekrar süspansiyon pelet. Pelet hücreleri. ** -80 Pelet dondurabilirsiniz ° C ** </li><li> ** Önemli **, kuru pelet ağırlığı ile 1:1 yem gerginlik kültür kontrol suşu kültür maç. </li><li> 1 / / 2.000 Proteaz İnhibitör Kokteyl (PIC) ile tampon NP-40 10ml her hücre pelletini tekrar. </li><li> Diğer bir tüp doğrudan şişeden iki hücre kültürleri karıştırın. Öğütme </li><li> Önceden soğutulmuş harç içine sıvı N 2 dökün ve tamamen buharlaşması için izin verir . Dairesel hareketlerle harç hücre 2 ml ekleyin. Bazı sıvı N 2 hücreleri dondurma dökün. Hücreler, hücreler ince bir toz haline gelinceye kadar eziyet. Tüm hücreleri zemin kadar işlemi tekrarlayın. ** Hücrelerin Çözülme izin vermeyin. Sıvı N 2 Gerekli ** </li><li> Oda sıcaklığında, buz gibi soğuk beher ve çözülme toz aktarın. Kenarları Çözülme başladığınızda, 1 / 200 PIC ile NP-40 tampon 20 ml ekleyin. </li><li> 40 ml Nalgene tüpler ham lizat aktarın. 39000 xgfor 30 dakika Spin. </li><li> Beklerken, sepharose 2B boncuk (GE) 300 ul alır. NP-40 tampon (1 / 2, 000 PIC) 3 kez 300 ul boncuk yıkayın. 01:01 bulamaç böylece 300 ul tampon boncuk tekrar Ön temizleme hücre lizat </li><li> Süpernatantı transferi ve yeni bir tüp sepharose 2B boncuk eklemek. 30 dakika süreyle soğuk oda dönen bir platform üzerinde inkübe edin. </li><li> Beklerken, IgG sepharose 6 boncuk (GE) 300 ul alır. NP-40 tampon (1 / 2, 000 PIC) 3 kez 300 ul boncuk yıkayın. 01:01 bulamaç böylece 300 _L tampon boncuk tekrar </li><li> Pelet boncuk. Yeni bir tüp süpernatantı aktarın. ** Batı sonra Blot için bir kısım hücre lizat kaydedin ** IgG sepharose boncuklar için bağlayıcı </li><li> Santrifüj sepharose 2B boncuk çıkarın. IgG boncuk (1:01 bulamaç önceden hazırlanmış) ekleyin. Daha verimli bir bağlama için iki tüp içine içeriğini ayırın. 2 saat süreyle soğuk oda dönen bir platform üzerinde inkübe edin. </li><li> Boncuk aşağı spin. ** Ilişkisiz hizip bir kısım ** Kaydet </li><li> 10 ml NP-40 tamponu (1 / 2, 000 PIC) ile yıkayın boncuk. </li><li> Boncuk 3 ml TEV-C tampon (1 / 2, 000 PIC) ile yıkayın. ** Boncuklar bir kısım kaydedin. Bu bağlayıcı ** verimliliği yansıtacak TEV proteaz bölünme IgG boncuk salınımlı </li><li> TEV-C 1 ml tampon (1 / 2, 000 PIC) için 5 ul AcTEV ekleyin. Karıştırıldıktan sonra, daha etkin bir şekilde karıştırılması için iki adet 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine içeriğini ayrı. Gece soğuk oda dönen bir platform üzerinde inkübe edin. </li><li> Boncuklar Spin ve 1.5 ml taze bir tüp eluat transfer. TEV-C tampon ek 0.5 ml boncuk yıkayın </li><li> Bir tüp elaute birleştirin. Eluat, toplam 1.5 ml olmalıdır.** TEV eluat bir kısım ** Kaydet Trikloroasetik asit (TCA) precipatation (kütle spektrometresi tabanlı analiz için, biz EtOH / asetat yağış kullanmanızı tavsiye ederiz) </li><li> % 25% 100 TCA TCA alikotları ayarlayın. Bunu yapmak için, her biri 750 ul 2 tüp içine 1.5 ml eluat ayırın. Tüp TCA% 100 250 ul ekleyin. Sizin çözüm sütlü açmalısınız. </li><li> Periyodik vorteks ile 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. </li><li> 30 dakika süreyle soğuk oda masa üstü santrifüj maksimum hızda dönerler. </li><li> 500 ul 0.05 N HCl ve spin içeren maksimum hız (soğuk oda) az 5 dakika buz gibi aseton ile bir kez yıkayın. </li><li> Ul 500 max (soğuk oda), 5 dakika buz gibi aseton ve spin ile bir kez yıkayın. </li><li> Aseton ve kuru pelet dikkatlice çıkarın. </li><li> Gümüş boyama, 1X SDS numune tamponu 50 ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin. EtOH / asetat precipatation </li><li> 20 mg glikojen ekle </li><li> 5X örnekleri% 100 EtOH ile seyreltilir ve 2.5 M stok, pH 5.0, 50 mM nach 3 COO uyum </li><li> 2saat için çözüm Standı </li><li> Pelet 12.000 X g oda sıcaklığında 10 dakika süreyle santrifüj yoluyla protein hızlandırdı. </li></ol> Tampon NP-40 (200 ml) <table border="0"><tbody><tr><td></td><td> Stok konsantrasyonu </td><td> Eklemek </td></tr><tr><td> 10 mM sodyum fosfat tamponu (pH 7,2) </td><td> 0,1 M </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td><td> 2 M </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> % 1 NP-40 </td><td> % 100 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 50 mM NaF </td><td> 1 M </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 0.1 mM Na 3 VO 4 </td><td> 10 mM </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td style="text-align:right;" colspan="3"> 200 ml hacim </td></tr></tbody></table> Kullanmadan önce ADD: <ol><li> 1 M DTT 1 / 1, 000 </li><li> PIC 1 / 2, 000 (Proteaz İnhibitörleri Kokteyl) </li></ol> TEV-C Tampon (50 ml) <table border="0"><tbody><tr><td></td><td> Stok konsantrasyonu </td><td> Eklemek </td></tr><tr><td> 25 mM Tris (pH 8.0) </td><td> 100 mM </td><td> 12.5 ml </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td><td> 2 M </td><td> 3.75 ml </td></tr><tr><td> % 0.1 NP-40 </td><td> % 100 </td><td> 50 _L </td></tr><tr><td> 0.5 mM EDTA </td><td> 500 mm </td><td> 50 __l </td></tr><tr><td style="text-align:right;" colspan="3"> 50 ml hacim </td></tr></tbody></table> Kullanmadan önce ADD: <ol><li> 1 / 1, 000 1M DTT </li><li> PIC 1 / 2, 000 </li></ol>

<ol><li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Jour.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.</li>
<li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 Forthcoming.</li>
<li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 Forthcoming.</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Yeast+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methods in Yeast Genetics.</a> , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 123-125 Forthcoming.</li>
</ol>

Arıtma işlemi sırasında kaydedilen alikotları (1) ön-temizlenir hücre lizat, (2) bağlı fraksiyon, (3) bağlanmamış fraksiyonu, ve (4) yıkandı, fraksiyon içermelidir. Biz Batı tarafından yukarıda alikotları protein içeriğini analiz deney bağlayıcı ve salınımlı etkinliğini yansıtmak için anti-TAP antikor veya gümüş boyama kullanarak blot önerilir. Gümüş lekeli bir jel ve leke örnekleri Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. SILAC protein bağlayıcı ortakları, tarafsız ve niceliksel ölçümler bize bu yana...

s. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipidler önemli hücre içi sinyal molekülleri olarak, son zamanlarda engel olarak ve hücre zarının bu işlev, hücresel süreçlerin compartmentalization içinde yapı taşları ve. Ancak, proteinlerin aksine, lipidler, küçük hidrofobik moleküllerdir öncelikle membran iletişim siteleri (MCSS) meydana varsayımla kötü açıklanan nonvesicular yolları, trafik. MCSS endoplazmik retikulum (ER) bir ortaklık organel, örneğin, plazma zarı (PM) ile doğrudan fiziksel temas yapan bölgelerdir. Bu lipid sentezini bu sitelere ve MCSS lipid trafiği için önemli olduğunu ima, lipid sentezleme enzimleri, ER-PM MCSS ER bölümü zenginleştirilmiştir. Maya 1000&#39;den fazla hücre başına kişiler ve tüm ökaryotlarda korunmuş doğa, bolluk nedeniyle ER-PM MCSS çalışma için ideal bir model. MCSS oluşturan proteinler ortaya çıkararak hücrelerindeki lipidler trafik nasıl yapılır anlamak için önemlidir, ve sinyal molekülleri olarak hareket. Biz Scs2p denilen bir ER ER-PM MCSS lokalize bulundu ve kendi oluşumu için önemlidir. Biz Scs2p moleküler ortaklarının ortaya çıkarılması üzerinde duruldu. Protein kompleksleri tanımlanması geleneksel olarak ilk kez kütle spektrometresi tarafından peptidlerin protein bantları ve analiz jel sindirim jel elektroforez, saflaştırılmış protein örnekleri çözme dayanır. Bu genellikle proteinlerin küçük bir alt çalışma sınırlar. Ayrıca, protein kompleksleri işlem sırasında denatüre veya fizyolojik olmayan koşullara maruz kalmaktadır. Bu sorunları aşmak için, tarafsız ve nicel veri ayıklamak için büyük ölçekli nicel proteomik tekniği uyguladık. Biz, bir etiketsiz kontrol suşu proteinlerin zımba izotop çekirdekleri dahil hücre kültürü amino asitleri (SILAC) ile stabil izotop etiketleme kullanın. Eşit hacimli, etiketli, kültür ve etiketsiz, SILAC etiketli kültürü birbirine karıştırılır ve sıvı nitrojen içinde taşlama tarafından parçalanmış. Daha sonra protein kompleksleri aşağı çekmek için bir yakınlık arıtma işlemi yürütmek. Sonuç olarak, yüksek performanslı sıvı kromatografisi / tandem kütle spektrometresi ile analiz için hazır protein örnek, hızlandırabilir. En önemlisi, kontrol suşu proteinler ağır izotop etiketli ve etiketsiz proteinlere karşı yem zorlanma sayılabilir edilebilir bir kütle / yük değişimi üretecek. Bu nedenle, kirleticiler, ya da belirsiz bağlama kolayca ortadan kaldırılabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, ER-PM MCSS lokalize birkaç roman proteinleri tespit ettik. Burada bizim yaklaşımımız ayrıntılı bir açıklama mevcut.

Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipidler, bariyer görevi gören ve hücresel süreçlerin bölümlere ayrılmasında rol oynayan hücresel membranların yapı taşlarıdır ve son zamanlarda...

Bu prosedür, yem suşun SLAC kontrol suşu için normal amino asitler içeren besiyerinde, diğer suşun ise ağır izotopik lizin ve arjinin içeren besiyerinde kültüre edilmesiyle başlar. Her iki suştan eşit miktarlar karıştırılır ve öğütme ve sıvı azot yoluyla lizize edilir. Ham lizatlar, önce santrifüjle pelletlenir ve ardından spheros boncuklarına bağlanarak temizlenir. Hücre lizatı daha sonra IgG boncuklarına bağlanır.IgG boncuklarına bağlı proteinler proteaz ile açığa çıkarılır, parçalanır ve çöktürülür. Örnek artık kütle spektrometrisi ile analiz için hazırdır. Merhaba, ben University of British Columbia Yaşam Bilimleri Enstitüsü Hücre Çevresel Biyolojisi Bölümü'ndeki Lone Laboratuvarı'ndan Jesse Chao.Bugün size, afinite saflaştırma ile birleştirilmiş, SILAC olarak adlandırılan kantitatif proteomik analiz prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda protein komplekslerini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Bu prosedürde, yem suşu normal amino asitler içerirken, SLAC kontrol suşu ağır izotopik lizin ve arjinin içerir. Başlamak için, öncelikle yem suşu ve kontrol suşunun her birini ayrı ayrı ekranınızda gösterilen değere ulaşana kadar birer litre yetiştirin. A

identification-protein-complexes-with-quantitative-proteomics-s

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Cryolysis, üre solubilziation, HILIC fraksiyonasyon ve fosforile peptidlerin IMAC zenginleştirme kullanarak kantitatif fosforilasyon prosedürü açıklaması.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Bu videoda, hedef DNA ile etkileşime giren birden fazla proteini tespit eden modifiye maya tek hibrit testini gösteriyoruz. Dönüştürülmüş maya hücreleri, raportör genin yukarı akışındaki hedef DNA dizisini içerir. Ek olarak, transkripsiyon faktörü proteinlerini eksprese ederler. Proteinler kompleksler oluşturduğunda ve hedef DNA'ya bağlandığında, raportör gen eksprese edilir ve enzimatik olarak tespit edilebilir.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşimlerini Tespit Etmek için Modifiye Maya-Bir Hibrit Testi

Tarif edilen karşılaştırmalı nicel proteomik yaklaşım, farklı koşullar altında multiprotein komplekslerinin bileşimi içine bir bakış açısı elde etmeyi amaçlamaktadır ve genetik olarak farklı suşların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Kantitatif analiz için bir sükroz yoğunluk gradyanı farklı fraksiyonların eşit hacimleri kütle spektrometresi ile analiz edilir ve karıştırılır.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

HaloTag teknolojisi, memeli hücrelerinden, küçük ve büyük protein komplekslerinin izolasyonu ile önemli bir başarı göstermiştir çok fonksiyonlu bir teknolojidir. Burada mevcut alternatiflere göre bu teknolojinin avantajları vurgulamak ve ökaryot hücrelerin içindeki protein fonksiyonunun birçok yönlerini incelemek için onun yararını göstermektedir.

Protein Etkileşimleri keşfetmek ve HaloTag Teknoloji Kullanımı Protein Fonksiyonu Karakterizasyonu

Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Öğrenin, S. cerevisiae'de SILAC ve afinite saflaştırma ile kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlama yöntemini. Bu teknik, Scs2p bağlanma ortaklarını belirlemek için yüksek hassasiyet sağlar.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Daha fazla video keşfet