Odak Ca ^{2 + Geçici Algılama}

İlk olarak, bir kalsiyum yükleme çözeltisi hazırlanır, ısıtılır ve köpürtülür. İdrar kesesi diseke edilir, açılır, düz bir şekilde sabitlenir ve bir detrusor şeridi alınır. Detrusor şeridi yükleme çözeltisine eklenir, inkübe edilir ve durulanır, düz bir şekilde sabitlenir.

Doku içindeki kalsiyum taban dördü lazer ışığı ile uyarılır ve yayılan ışık yakalanır. Tek tek karelerden oluşan filmler, ardışık kareler karşılaştırılarak analiz edilir. Arka plan çıkarılır.

Hücre kenarı eşiği, olayların nerede bulunabileceğini belirler ve ardışık beyinler arasında bir oran alınır. Kalan olaylar önceden tanımlanmış ölçütlerle eşleşirse, bunlar vurgulanır ve etiketlenir. Merhaba, benim adım Oxford Üniversitesi Farmakoloji Bölümü'nde Keith Brain ve Tom Kinane'nin laboratuvarlarından John Young.

Ben Rob Amos, aynı zamanda Brain ve Canne Labs'tan ve adım Keith Brain. Bugün, John ve Rob size düz kaslarda bir kalsiyum görüntüleme tekniği gösterecekler. Bunu laboratuvarımızda, otonom sinirlerden nörotransmitter salınımını ve bunun düz kas üzerindeki etkisini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Kalsiyum indikatör organı yeşil, 4 88 BAFTA 1:00, 50 mikrogram toz içeren 500 mikrolitrelik şişelerde gelir. Kalsiyum göstergesini 40 mikrolitre Onic F1 27 solüsyonunda toza hazırlamak için ve ardından 30 saniye boyunca hafifçe çalkalayın, ardından 460 mikrolitre fizyolojik tuzlu su çözeltisi PSS'de ve 30 saniye daha hafifçe çalkalayın.

Nihai çözüm, 10 mikro azı dişi organ yeşili. 4 88 BAFTA 1:00, her biri 125 mikrolitrelik dört alikot sağlar. Işığa maruz kalmaktan kaçının ve ilgilenilen dokuyu incelemeden önce çözeltiyi eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Kalsiyum indikatörünü dondurucudan çıkarın ve kalsiyum indikatörü inceyken oda sıcaklığında çözdürün. Bir test tüpüne ve 33 santigrat derecede bir su banyosuna bir mililitre PSS yerleştirin. Bir fıskiyeyi bir tıkaç ile test tüpüne sabitleyin veya perfil kullanabilir ve daha sonra saniyede yaklaşık bir kabarcık ortaya çıkan bir oranda% 95 oksijen ila% 5 karbondioksit karışımı ile kabarcık

Düz kas organını hayvandan ayırın. Bu durumda, bir farenin idrar kesesidir. Organı yıkamak için yaklaşık 50 milimetre PSS'ye yerleştirin: doku yıkandıktan sonra, ciero yağ dokusunu ve bağ dokusunu dikkatlice çıkarın.

İdrar kesesi için düz kas laurean tipine göre diseksiyon açın. Mesane boynundan uzunlamasına açın, burun ucu kubbenin tepesine kadar açın. Kraniyal uç Baskın kas demetleri yönünde keserek, resser'ın sırt yüzeyi boyunca altı ila sekiz milimetre uzunluğunda ve bir ila iki milimetre genişliğinde dört şerit hazırlayın.

tüpündeki dokuya 125 mikrolitre 10 mikromolar organ yeşili, 4 88 B ila 1:00 kalsiyum göstergesini yüklemek için disseke edilmiş dokuyu ve savaş öncesi ve kabarcıklı PSS'yi yerleştirin ve karıştırmak için elinizle biraz sallayın. Tüpü su banyosuna geri koyun. Köpürmeye devam edin ve su banyosunu bir folyo ile örtün.

Kalsiyum indikatörünü almak için yeterli dokunun geçmesi için geçen süre, dokunun büyüklüğüne ve düz kas tabakasının kalınlığına göre değişir. Örneğin, fare detrusor ve sıçan öküzleri için bu süre 70 dakikadır. Sıçan detrusor ve fare VAs deensleri için ise 120 dakika kuluçkaya yatırıyoruz.

Doku kalsiyum indikatörü ile yüklendikten sonra mikroskopi için hazırlanabilir. İlk olarak, dokuyu kabarcıklı PSS'de 10 dakika durulayın. Ardından, dokuyu S koruyucu astarlı bir hazırlama kabına monte edin.

Düz bir tabaka oluşturmak için hafifçe gerin. Dokuyu kısa uzunluklar kullanarak sabitleyin. Örneğin, iki milimetre 25 ila 50 mikrometre çapında gümüş tel ve pimleri açılı olarak yerleştirin.

Objektifi çizebilecekleri için birkaç milimetreden daha uzun pimler kullanmaktan kaçının. Dokunun dikkatli bir şekilde tutturulması, dokunun spontan durumunun en aza indirilmesi ve görüntüleme için uygun bir yerin belirlenmesinin kolaylaştırılması açısından önemlidir. Doku sabitlendikten sonra, hazırlama kabını mikroskop tablasına yerleştirin.

PSS'nin çanağın sil koruma kaplı alanından çıkmamasına dikkat edin. Çünkü bu, PSS'de geniş bir alanın kaplanmasına neden olabilir. Süperfüzyon gösteri amaçlı başladığında, ışıkta aşağıdaki adımlar yapılacaktır.

Lütfen bu deneylerin normalde karanlıkta yapıldığını unutmayın. Hazırlığı süper kaynaştırmak için pompayı açın. PSS ile, genellikle saatte 100 mililitre bir oran kullanılır.

Isıtıcı üniteyi açın, giriş ve çıkış borularını ve sıcaklık probunu, her birini tabanındaki mıknatıs ile metal şeride sabitlemek için hazırlık kabına yerleştirin. Çıkış borusunun ucunun yüksekliği, PSS'nin derinliğini belirleyecektir. Bazen olmadığı için çıkışın gerçekten PSS'yi kaldırdığından emin olmak için dikkatli olun.

Başlangıçta, ısıtıcı ünitesindeki sıcaklığı 33 ila 35 santigrat derece arasında istenen sıcaklığa ulaşacak şekilde ayarlayın. Düşük güç hedefiyle dokunun en az 10 dakika dengelenmesine izin verin. 10 veya 20 kez.

Düz kasları görüntülemek ve izlenecek uygun bir bölgeyi belirlemek için epi floresan veya mavi ışıkla heyecan verici kullanın. Uyarılmaya maruz kaldığından, aydınlatma göstergeyi foto-ağartacaktır. Bir seferde birkaç saniyeden fazla kullanmaktan kaçının.

Görüntü algılama algoritmasında çok sayıda yanlış pozitife neden olabileceğinden parlak yapıları görmekten kaçının. Sahada minimum hareket ve çok sayıda düz kas hücresi olan bir yer seçmeye çalışın. Görüntülenecek siteyi seçtikten sonra, 40 x gibi daha yüksek bir güç hedefine geçin.

Sahneyi veya optik ekseni, düz kas hücresi veya hücreleri yatay olacak şekilde döndürün. Bu, hızlı tarama eksenine paraleldir. Düz kas hücreleri artık konfokal mikroskopi ile görüntülemeye hazırdır.

Bu protokolde Leica SP iki dik konfokal mikroskop kullanıyoruz. İğne deliğini bir havadar diske kapatın. Cuto optik ayarlanabilir filtrede lazer gücünü %25 ile %35 arasında ayarlayın.

Bu değer, parlaklık ve fotoğraf ağartma arasında bir değiş tokuştur. Veri analizine hazırlanmak için imaj J'yi indirin ve yükleyin.Platforma özel sürümü indirin ve ardından eski dosyayı değiştirmek için en son ImageJ jar dosyasını indirerek en son sürüme güncelleyin. Ardından, Excel yazıcı jar dosyasını indirin ve eklentilerin jar dizinine yükleyin.

Bu dosyaları eklentiler dizinine kopyalayın. Eklenti makrolarını kullanarak bu komut dosyalarının her birini yükleyin. Görüntünün yükleme işlevi J. Leica SP için kullandığımız iki konfokal mikroskop için yazılım Leica olarak adlandırılır.

LCS, her serinin ayrı karelerini ayrı bir dosya olarak kaydeder. Seriyi yeniden inşa etmek için. Yeniden oluşturulacak tüm çerçevelerin tek bir klasörde olduğundan emin olun.

Örneğin, veri klasörü tiffs. Ardından eklentiler makroları menüsünden Leica SP iki istifleyici makrosunu seçin. Bu durumda veri klasöründe kök dizini seçin.

Açılır listeden istediğiniz klasörü seçin. Bu durumda, tiffs bir çıktı dizini seçer veya yeni bir tane oluşturur. Örneğin, veri klasörü yığınları.

Komut dosyası daha sonra hareketi düzeltmek için serileri tek tek karelerden yeniden oluşturacaktır. Bir dizi indirme yığını, teçhizat ve turbo reg içindeki kareleri hizalayan veya eşleştiren ücretsiz olarak kullanılabilen bir algoritma kullanıyoruz. Her birinin dosyalarını yığınlar klasörüne kopyalayın.

İşlenecek bir yığın yükleyin ve ardından ilgi alanını açıkça gösteren bir çerçeveye geçin. Diğer çerçeveler bu referans çerçevesine hizalanacaktır. Bundan sonra, eklenti yığınlarına gidin.

Her site için neyin en etkili olduğunu belirlemek için farklı dönüşümlerin her birini deneyin. Kalsiyum geçişlerinin tespitini etkileyen görüntülenen faktörler, her bir bölgenin belirli özelliklerinin, partikül parametrelerinin ölçülmesiyle değişecektir.

Algılamanın duyarlılığı ve özgüllüğü artırılır. Bu nedenle, her site için, oran ve hücre kenarı eşiği için çıkarılan eşik için eşiği hesaplayacağız. Başlamak için eklentilere, makrolara gidin, yükleyin ve seçin jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Ardından eklenti makro yükleme yığınına gidin.

Bir seri seçin ve aşağıdaki parçacık parametrelerini hesaplayın. Çıkarılacak eşiği hesaplamak için, arka plan ölçüsü olduğuna inandığınız değerin üzerinde dikdörtgen bir ilgi alanı seçin. Not aşağı ortalama Oran eşiğini hesaplamak için, düz kas hücresinin veya hücrelerinin optik olarak düz bir alanı etrafında dikdörtgen bir ilgi alanı seçin.

Nota aşağı ortalama ve standart sapmayı ölçün. İşlemi iki kez daha tekrarlayın veya shift tuşuna basarak aynı anda üç kutu çizebilirsiniz. Hesaplayın, not ekleyin, oran eşiğini düşürün.

Standart sapmanın ortalamaya bölünmesiyle hesaplayın, bir ekleyin ve ardından sonucu 32 ile çarpın. Üç kopyadan elde edilen değerlerin ortalaması alındığında, devam eden çerçeveden hiçbir değişikliğin 32'lik bir tamsayı değerine eşlenmediği rasyonlama algoritmasını hesaba katmak için 32 faktörü gereklidir. Bu, orandaki artışları ve düşüşleri tespit etmek için iyi bir dinamik aralık sağlar.

Sekiz bitlik bir görüntü için, görüntü ayarlama eşiğini seçin. Siyah ve beyazı seçin. Üst kaydırma sınırının altında tanımlayın ve karşılık gelen değeri not edin.

Bu, kaydırıcının sağındadır. Yalnızca siyah bölgelerde meydana gelen olaylar sayılacaktır. Sıfırla'yı tıklayın.

Artık oran için çıkarılan eşik eşiği ve satış kenarı eşiği hesaplandığına göre, görüntü yığınlarını analiz edebiliriz. Analiz edilecek yığınların konumunu belirleyin. Bu aşamada sadece bir seri seçin.

Bu ilk dosyadır ve son dosya aynı olmalıdır. Ardından veri dosyalarının ve yığınlarının çıktısı için bir konum seçin. Örneğin, veri klasörü çıktısı.

Oran eşiği ve satış kenarı eşiğinin çıkarılması için eşik değerlerini girin. Diğer ayarları varsayılan değerlerinde bırakın. Algoritma, işlenen serinin solda ve orijinalin sağda gösterildiği çift bölmeli bir pencere üretecektir.

Bu dosyayı çıktı klasöründen açın ve yanlış pozitiflerin sayısını ve gözle görülebilen olayların algılanmadığı durumları değerlendirmek için bunu dikkatlice gözden geçirin. Algoritma, her seri için, algılanan olayın genlik alanı gibi özelliklerini ayrıntılandıran bir Excel dosyası üretir ve algoritmanın çıktılarının bu Excel dosyasından elle kaldırılabileceği görüntü dosyalarını gözden geçirerek tanımlanan yanlış pozitifleri konumlandırır. Yine de bunu yapmak için katı kriterlere sahip olmalısınız.

Bu, düz kastaki kalsiyum geçişinin bir filmidir. Bu örnekte, film beş hertz'de elde edilen 100 ayrı kareden oluşur. Örneğin, belirli bir ilacın kalsiyum geçici sıklığı üzerindeki etkisini araştırırken, deney başına bu filmlerin çoğunu elde ederdik.

Burada düz kas hücrelerinde çok sayıda spontan kalsiyum geçişi görüyoruz. Parçacık algılama algoritmasının sonucu burada gösterilmektedir. Algoritma, her seri için algılanan olayın genlik alanı ve konum gibi özelliklerini ayrıntılandıran bir Excel dosyası üretir.

Bu yüzden, idrar kesesi gibi düz kas organlarında kalsiyum transını görüntülemek için bir yöntem gösterdik ve bu kalsiyum geçişlerini laboratuvarda ürettiğimiz bir algoritma kullanarak analiz ettiğimiz bir yol gösterdik. Unutulmaması gereken önemli noktalar dokuyu kalsiyum görüntülemesine iyi bir şekilde hazırlamaktır. Yani bugün gösterdiğimiz doku söz konusu olduğunda, bu bağ dokusunu çıkarmak ve alanı gizleyebilecek herhangi bir yağı çıkarmak.

Dokuyu düz bir tabakaya sabitlemek de önemlidir. Deneylerinizde iyi şanslar ve izlediğiniz için teşekkür ederim.