Name: Odak Ca 2 + Geçici Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Öğrenin düz kas dokusunda yüksek çözünürlüklü kalsiyum görüntüleme yöntemini. Konfokal mikroskopi ile sinir iletici etkilerini analiz edin ve düz kas fizyolojisi araştırmaları için protokolü keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wellcome Trust sağlanan mali destek (VIP JSY ve KLB için 074.128 Araştırma Bursu Ödülü). Tıbbi Araştırma Konseyi Bursu RJA için Leica_SP2_Stacker, TIFF &#39;yeniden yapılanma&#39; için bir dizi içine almak için kullanılan bir algoritma, Leica_tiff_sequence onun izni ile Tony Collins tarafından geliştirilen ve kullanılan ImageJ Leica SP2, TIFF, okumak için bir eklenti dayanmaktadır. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg ve TurboReg, doku hareketi düzeltmek için kullanılan algoritmalar, Pe venaz ve arkadaşları (1998) 9 dayanmaktadır. Excel_writer.jar Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html) tarafından yazılmıştır. JNCT0.08JoVE.ijm, parçacık algılama algoritması, KL Beyin tarafından yazılmış ve daha önce 5 detaylı bir algoritma dayanmaktadır.

Bölüm 1: Hazırlık Ca 2 + göstergesi (Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00) <ol><li> Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 AM toz (50 mg) gibi küçük bir miktar 500 ul flakonlarda geliyor. Toz F-127 çözümü, 30 saniye hafifçe sallayarak 40 ul Pluronic ekleyin, daha sonra 460 ul PSS ve 30 saniye hafifçe çalkalanır Nihai çözüm, 10 mcM Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00, 4 x 125 ul alikotları sağlar. -20 C&#39;de saklamak için ışık ve maruz kalmaktan kaçınınız. </li></ol> Bölüm 2: Ca 2 + yükleme <ol><li> Dondurucuda (-20 C) Ca 2 + göstergesi (Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00) çıkarın ve oda sıcaklığında çözünme sağlar. </li><li> 1 ml bir tüp ve su banyosu yer PSS alın. % 95 O% 2 / 5 saniyede yaklaşık 1 görünen kabarcık bir oranda CO 2 ile Kabarcık. Bubbler kapamak veya Parafilm ile örneğin tüp içine güvenli olması gerekir. </li><li> Hayvan doku inceleyin ve Sylgard çizgili bir Petri kabındaki, bağ dokusu dikkatli bir şekilde kaldırın. Düz kas organ türü ne olursa olsun, PSS her 10 dakikada yerini olmalı ve doku (PSS üç kez yerine örneğin) ve aşağıdaki diseksiyonu yıkanmalıdır. Vas deferens: doku bir levha üretmek uzunluğu yönlü kesme organ düşünün. Mesane için: kubbenin üst (ön) (arka) mesane boynu boyuna açık. 8 uzun mm ve 1 - baskın kas demetlerinin yönünü kesme detrüsör dorsal yüzeyi boyunca 2 mm genişliğinde, dört şeritler, 6 hazırlayın. </li><li> Place &#39;önceden ısıtılmış ve kabarmış&#39; PSS doku disseke. </li><li> 10 mcM Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 tüp PM 125 ul ekleyin ve biraz sallamak vermek, elle karıştırmak için. </li><li> Folyo kaplı köpürme ve izin, devam edin. Yeterli doku Ca 2 + göstergesi doku ve düz kas tabakasının kalınlığı boyutu ile değişir almak için zaman alır. Örneğin: 120 dakika (sıçan detrüsör, fare vas deferens) 70 dakika (detrüsör fare, sıçan anococcygeus). </li></ol> Bölüm 3: mikroskopi için &#39;Ca 2 + yüklü&#39; doku hazırlanması Dikkatli doku bağlantılarını doku spontan hareket (nispeten sağlam doku düz kas hücrelerinin görüntüleme bir özelliği) en aza indirmek ve görüntüleme için uygun bir sitenin konumu (düz bir doku parçası gibi olabilir kolaylaştırmak amacıyla gerekli iki boyut yerine üç) inceledi. <ol><li> En az 5 dakika süreyle doku kabarmış PSS durulayın. </li><li> Uzanan düz bir levha şeklinde doku (biraz), çizgili Sylgard hazırlık çanak monte edin. Amacı çizebilir uzun &#39;pimleri&#39; kullanmaktan kaçının; &#39;pimleri&#39; olarak 25-50 mikron çaplı gümüş tel yerine kısa uzunluklarda ve bir açıyla yerleştirin. </li><li> (Bu superfusion başlar PSS kaplı geniş bir alana yol) PSS Sylgard astarlı çanak alanından kaçmak değildir ki emin olmak için dikkatli olmak, mikroskop sahne hazırlık tabağına yerleştirin. </li><li> PSS ile hazırlık superfuse amacıyla pompa açın. Saatte 100 ml &#39;lik bir oranı genellikle istihdam edilmektedir. </li><li> Isıtıcı ünitesi açın. </li><li> Hazırlık çanak (tabanı üzerinde mıknatıs metal şerit her iliştirilmesi) giriş ve çıkış tüpleri ve sıcaklık probu yerleştirin. Çıkış tüpünün ucu yüksekliği, derinliği PSS belirleyecektir. Çıkış aslında (bazen başlangıçta olduğu gibi) PSS kaldırıyor sağlamak için dikkatli olun. </li><li> Istenilen sıcaklığa, örneğin 33-35 C ulaşmak için ısıtıcı ünitesi sıcaklığı ayarlayın </li><li> En az 10 dakika süreyle doku gelmesini sağlayınız. </li></ol> Bölüm 4: site Seçim görüntü Uyarma aydınlatma maruz kalma göstergesi photobleach, böylece bir seferde birkaç saniye daha fazla kullanmaktan kaçının. <ol><li> Düşük güç bir hedef (10x ya da 20x) düz kas görüntülemek ve izlemek için uygun bir bölge belirlemek için, mavi bir ışık ile Epifloresans, heyecan verici kullanın. Hareketi (en az olmalı) ve düz kas hücrelerinin sayısı alanında dayalı bir site almak için deneyin. Parlak &#39;yapılar&#39;, görüntü algılama algoritması &#39;yanlış pozitif&#39;, yüksek bir sayı neden olabilir, bu nedenle çok sayıda (örneğin) serpiştirilmiş epitel hücreleri ve fibroblastlar siteleri kaçının. </li><li> Yüksek bir güç objektif (40x) geçin. </li><li> Düz kas hücre (ler) yatay yalanlar o kadar (yani hızlı tarama eksenine paralel) veya optik eksen sahne döndürün. </li></ol> Bölüm 5: mikroskopisi Ayrıntıları konfokal mikroskop &#39;kurmak&#39; nasıl her mikroskop türü için özeldir, amaen önemli hususlar şunlardır: hızı (en Ca 2 + transientler için gerekli minimum 5 Hz); alan çözünürlüğü ve boyutu (her ikisi de ticareti-hız). Bazı aşağıdaki protokol Leica SP2 dik konfokal mikroskop özel. Tipik bir protokol: 5 Hz (256 x 256 piksel, yaklaşık 100 x 100 mm.) Elde edilen 100 çerçeve serisi, 13.5 Hz (256 x 64 piksel, yaklaşık 100 x 25 mm). Tarama kafası iki yönlü hareket (toplama hızı en üst düzeye çıkarmak için) ve 1000 Hz&#39;de satır başına elde etmek için ayarlayın. <ol><li> Bir &#39;havadar diske&#39; iğne deliği kapatın. </li><li> Bu değeri, parlaklık ve photobleaching arasında bir trade-off; AOTF 25 ve% 35 arasında Lazer (488 nm) güç ayarlayın. (Ikincisi uzun kayıtları sırasında belirli bir sorun.) </li><li> &#39;Tedavi&#39; başına altı siteleri - site başına altı serisi, ve dört edinin. Önemli photobleaching deneyci bu sapmasına neden olsa da, aynı altı siteleri ön-ilaç (örneğin, &#39;kontrol&#39;) ve post-ilaç izlemek amacı yaygındır. </li><li> &#39;Zamanı denetimleri yapılmaktadır Ca 2 + görüntüleme gereklidir. </li></ol> Bölüm 6: analiz için hazırlanması <ol><li> Http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html: Resim J indirin ve kurun. Platforma özgü versiyonunu indirin ve sonra, http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar son imageJ.jar dosya indirirken, eski dosya yerine en son sürümüne güncelleme. Apple Mac kullanıcıları: yavaş çalışıyorsa, Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/) java sanal makinesi (JVM) en son sürümünü kullandığınızdan emin olun. </li><li> Excel_writer.jar indirin: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html ve Eklentiler [dizin]&gt; kavanoza dizin içine yüklemek. </li><li> JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class: Aşağıdaki dosyaları Eklentiler dizine kopyalayın. Eklentiler kullanarak bu scriptleri her yükleyin [Menü]&gt; Makrolar&gt; Yükle ... ImageJ fonksiyonu. </li><li> Biz yazılım görüntülenebilir içinde tek bir &#39;film&#39; gibi her serisi üretir Leica SP2 konfokal mikroskop, yazılım (Leica LCS) kullanabilirsiniz, ancak tek tek kare olarak kaydeder. Diziye çerçeveleri yeniden kurmak için: (i) &#39;kare&#39; tek bir klasörü (örneğin, &#39;DataFolder&gt; TIFF&#39;) olarak yeniden inşa için emin olun. (Ii) Eklentileri [Menü]&gt; Makrolar&gt; Leica_SP2_Stacker seçin. Kök dizini seçin (örneğin, &#39;DataFolder&#39;). Açılan listesinde (örneğin, &#39;TIFF /&#39;) istediğiniz klasörü seçiniz. Bir çıkış dizini seçin veya yeni bir (örneğin, &#39;DataFolder&gt; Yığınları&#39;) oluşturur. Komut dosyası daha sonra tek tek kareleri serisi yeniden. </li></ol> Bölüm 7: hareket için düzeltme Iyi çivileme ile görüntülü sitenin hareketini en aza indirilmeli ve eşit gergin doku olabilir rağmen, bazı düz kas organları yalnız bağlantılarını dikkatli kaldırıldı olamaz spontan kasılmaları sergilerler. Burada bir dizi içinde kare hizalar ya da eşleşen bir serbestçe kullanılabilir algoritma kullanımı açıklanmaktadır. <ol><li> &#39;StackReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ve &#39;TurboReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Eklentiler Eklentiler dizine her yükleyin&gt; Makrolar&gt; Kur ... </li><li> (Dosya&gt; Aç ...) işlenmek üzere bir yığın yükleyin ve daha sonra ilgi alanına açıkça gösteren bir çerçeve taşımak. Diğer çerçeveler bu referans çerçevesi aynı hizada olacak. </li><li> Eklentiler&gt; Yığınları&gt; StackReg. Her biri farklı &#39;Dönüşümler&#39; (yani Çeviri, Katı Cisim, Ölçekli Rotasyon, Afin) en etkili olduğunu belirlemek deneyin. (Daha fazla detay: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Bölüm 8: Parçacık algılama algoritması Her bir &#39;site&#39; görüntülü faktörler Ca 2 + transientler algılama etkileyen değişecektir. Her sitenin belirli özellikleri (&#39;parçacık parametreleri&#39; - detaylı aşağıda) ölçerek, algılama sürecini kolaylaştırdı. Ve &#39;hücre kenar eşiği&#39; Böylece her site için bir hesaplar için eşik çıkarılır &#39;,&#39; oranı için eşik &#39;. <ol><li> Eklentileri [Menü]&gt; Makrolar&gt; Kur ... ve &#39;JNCT0.08Release.ijm&#39; seçeneğini seçin. </li><li> Eklentileri [Menü]&gt; Makrolar&gt; yük yığını (kısayol: l). Bir dizi seçin ve parçacık parametreleri hesaplamak: <ol style="list-style:none;"><li> a. Için eşik çıkarılır (= arka plan) </li></ol></li><li> &#39;Arka plan&#39; olarak inandığımız üzerinde dikdörtgen bir ROI seçin. </li><li> Ölçü (kısayol: m). Aşağı Not ORTALAMA. <ol style="list-style:none;"><li> b. Oranının hesaplanması eşik </li></ol></li><li> Bir dikdörtgen seçinHücre (ler) optik düz bir alanı çevresinde ROI. </li><li> Ölçü (kısayol: m). Aşağı ortalama ve standart sapma unutmayın. </li><li> Bir iki kez daha tekrarlayın VEYA &#39;kayması&#39; tuşuna basarak bir kerede üç kutu çizebilirsiniz. </li><li> Hesaplayın ve eşik oranı için bir yere not = ortalama üç değerleri (1 + SD / ortalama) x 32 / siteler çoğaltır. <ol style="list-style:none"><li> c. Hücre kenar eşiği </li></ol></li><li> Image&gt; Yığınları&gt; Z proje ... Projeksiyon tipi seçin: &#39;Ortalama yoğunluğu&#39; </li><li> Image&gt;&gt; Eşik ayarlayın. </li><li> Siyah ve beyaz seçin. </li><li> &#39;Altında&#39; tanımlayın (üst kaydırıcıyı) limit ve karşılık gelen değeri (kaydırıcıyı sağa) bir yere not edin. Sadece siyah bölgelerde meydana gelen olaylar sayılabilir. </li><li> &#39;Reset&#39; düğmesini tıklayın. </li><li> Yığınları (2 kısayol) analiz </li><li> Bu aşamada sadece bir seri seçin, yani &#39;ilk dosya&#39; ve &#39;son dosya ile aynı olmalıdır. </li><li> &#39;Çıkarılır için eşik&#39; ve &#39;hücre kenar eşiği&#39;, &#39;oranı için eşik değerleri girin. Diğer ayarları varsayılan değerlerine bırakın. </li><li> Algoritma işlenmiş serisi sol tarafta görülen ve sağda orijinal olduğu bir çift bölmeli pencere üretecektir. Yanlış pozitif ve gözle görünür olaylar, tespit edilmemiş olduğu durumlarda sayısını dikkatli bir şekilde değerlendirmek için bu geçmesi. Ca 2 daha doğru bir algılama almak için + transientler biraz &#39;parçacık parametreleri&#39; bazı ayarlamak için gerekli olabilir. Sürecin bir &#39;küçük isabet ve kaçırmak&#39; gibi ilk girişimi olsa da, hangi parametreleri temel olarak bir hızla hissediyorum alır. </li><li> Algoritması her bir serisi için, bir Excel dosyasını üretir, tespit edilen olayın ayrıntıları özellikleri (genlik, alan ve pozisyon gibi). &#39;Yanlış&#39; - Bu Excel dosyası, el kaldırılır olabilir algoritma çıkışları (örneğin adım 8.17) bu görüntü dosyalarını inceleyerek tespit. </li></ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

Kullanılan hayvanların sayısı ve onların acıları en aza indirmek için çalışmalar yapıldı; tüm deneyler, Birleşik Krallık Animals (Scientific Procedures) Act 1986 ve Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/09/EEC uyarınca yapılmıştır.

Seçimi floresan Ca 2 + göstergesi Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 (i) diğer göstergeleri (örneğin Fluo-4 ve Kalsiyum Yeşil) 1 ile karşılaştırıldığında, parlak, çünkü AM Ca 2 + göstergesi seçildi, (ii) Ca 2 fizyolojik değişimlere duyarlıdır + konsantrasyonu (iii) yükleri çok sayıda düz kas hücreleri, düz kas hücre izlenebilir Kaplin sağlayan, hücre içi Ca 2 + konsantrasyonu [Ca 2 +] i (örneğin, vaz deferens 2) benzer büyüklükte 1 K d Ancak, Oregon Yeşil 488 BAPTA 1:00 olmayan bir ratioable Ca 2 + göstergesi, gibi kolayca mutlak belirlemek için kullanılan olamaz [Ca 2 +]. Ayrıca, Ca 2 + mevcut ise yüksek konsantrasyonlarda tampon ve [Ca 2 +] yüksek genlik değişiklikleri ile doymuş olur. Spontan kontraktilite inhibisyonu Ca 2 + kanalları + L-tipi Ca 2 üzerinden (nifedipin 3 diltiazem 4 örneğin) hareketini engelleyerek düz kas organların kendiliğinden kontraktilite gibi, farmakolojik azaltılmış olabilir. Not bu ilaçların tam hücreli Ca 2 + yanıp söner / transientler genlik büyük ölçüde azaltacaktır . Vaz daralma öncelikle purinerjik ve noradrenerjik sinir iletiminin bir arada deferens. Ancak, bu doku Odak Ca 2 + transientler noradrenerjik reseptör blokajı (örn. α 1 adrenoseptör, prazosin 5) hareketinin odak Ca 2 + transientler etkilemeden azalabilir duyarsız. Alternatif olarak, daralma wortmannin 6 miyozin hafif zincir kinaz örneğin inhibisyonu yoluyla &#39;downstream&#39; önlenmiş olabilir. Sonuçlar Mikronaltı çözünürlük Ca 2 + floresan İzleme nörotransmitter sürüm 5,7 post-junctional etkilerini incelemek ve Ca 2 + iç depolar (örneğin, &#39;kıvılcım&#39; 8) serbest bırakılması için güçlü bir tekniktir. Ca 2 + metodoloji kullanarak transientler burada özetlenen analizi piyasada bulunan görüntü analiz paketler ile karşılaştırıldığında maliyet-etkin ve ImageJ için özel yazılmış Java eklentileri yoluyla ısmarlama analiz sağlar.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Pluronic F-127 çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>DMSO içinde %20'lik çözelti</td></tr><tr><td>Leica SP2 dik konfokal mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hava tablası (&amp;#8216;titreşim izole edilmiş çalışma istasyonu&amp;rsquo;)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 elastomer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odak ca 2 +</supdüz kas> geçici algılama

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca 2 + görüntüleme düz kas membran potansiyeli değişiklikleri, iç mağazalardan Ca 2 + gibi serbest bırakılması gibi neden olmayabilir hücresel mekanizmaları içine fikir verir ve birden fazla hücreyi aynı anda izlenebilir, örneğin, değerlendirmek için izin , kaplin sinsityal doku. Hücre içi Ca 2 + transientler düz kas yaygındır, ama doğru bir şekilde ölçmek için zor bir organ bakış genellikle geniş bir alan üzerinde, kendi stokastik oluşumu kaynaklanan sorunlar nedeniyle bu sözleşme eğilimli. Bu sorunu aşmak için, biz, otomatik bir biçimde, bu tür olayların sıklığı, yeri ve genlik kazanmak ve daha sonra analiz etmek için bir dizi görüntüleme protokolleri ve analiz rutinleri geliştirdik. Bu yaklaşım, başka bağlamlarda uygulanabilir olsa da, kendi yerel purinerjik Ca 2 algılama içerir Mikronaltı çözünürlüğe sahip verici sürümü bulmak için transientler . ATP detrüsör ve vaz deferens düz kas P2X1 reseptörlerine bağlanır otonom sinirler, bir cotransmitter olarak yayınlandı. Ca 2 + purinerjik neuroeffector Ca 2 + transientler (NCTS), düz kas girer. Odak Ca 2 + transientler şekilde elektrofizyoloji üzerinden pek çok avantajı olan bir nörotransmitter serbest optik izleme izin verir. Büyük ölçüde geliştirilmiş uzaysal çözünürlük dışında, optik kayıt anda birçok ayırt sitelerinden verici sürümü kayıt sağlayan ek bir avantaja sahiptir. Ayrıca, optik odak düzlemine korumak ya da hücre içi bir keskin mikroelektrot yeniden daha uzun kayıt serisi sırasında doğru daha kolay. Özetle, bir görüntüleme Ca 2 + floresan yöntemi ana hatlarıyla hangi detaylar doku hazırlanması, veri toplama ve analizi. Biz böyle bir Ca 2 + transientler analiz için çeşitli scriptler kullanımı anahat.

Yüksek çözünürlüklü Ca Detayları yöntemleri<sup&gt; 2 +</sup&gt; Görüntüleme: izole organları, içinde düz kas doku, görüntü toplama ve veri analizi hazırlanması.

Odak Ca 2 +</supDüz kas> Geçici Algılama

Düz kaslarda Ca2+ görüntülemesi, Ca2+ salınımı gibi membran potansiyelinde değişikliklere yol açmayan hücresel mekanizmalar hakkında içgörü sağlar...

İlk olarak, bir kalsiyum yükleme solüsyonu hazırlanır, ısıtılır ve havalandırılır. İdrar kesesi diseke edilerek çıkarılır, açılır, düz bir şekilde iğnelenir ve detrusor kasından bir şerit alınır. Detrusor şeridi yükleme solüsyonuna eklenir, inkübe edilir, durulanır ve düz bir şekilde iğnelenir.Doku içindeki kalsiyum tabanı dört, lazer ışığı ile uyarılır ve yayılan ışık yakalanarak sonuçlar kaydedilir. Tekil karelerden oluşan filmler, ardışık kareler karşılaştırılarak analiz edilir. Arka plan çıkarılır.Hücre kenarı eşiği, olayların nerede bulunabileceğini belirler ve birbirini takip eden beyinler arasında bir oran alınır. Kalan olaylar önceden tanımlanmış kriterlerle eşleşirse, vurgulanır ve etiketlenir. Merhaba, ben Oxford Üniversitesi Farmakoloji Bölümü'ndeki Keith Brain ve Tom Kinane laboratuvarlarından John Young.Ben Rob Amos, ben de Brain ve Canne laboratuvarlarındayım ve benim adım da Keith Brain. Bugün John ve Rob size düz kaslarda bir kalsiyum görüntüleme tekniğini gösterecekler. Biz bunu laboratuvarımızda, otonom sinirlerden nörotransmitter salınımını ve bunun düz kas üzerindeki etkisini incelemek için kullanıyoruz.Haydi başlayalım. Kalsiyum indikatörü organ green 488 BAFTA 1:00 AM, 50 µg toz içeren 500 µL'lik flakonlar halinde sunulur. Kalsiyum indikatörünü hazırlamak için, toza 40 µL Onic F1 27 çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca nazikçe çalkalayın; ardından 460 µL fizyolojik tuzlu solüsyon (PSS) ekleyin ve 30 saniye daha nazikçe çalkalayın.10 µM Organ Green 488 BAFTA içeren nihai çözelti, her biri 125 µL olan dört alikot sağlar. İlgili dokunun diseksiyonundan önce çözeltiyi ışığa maruz bırakmaktan kaçının ve -20 °C'de saklayın.Kalsiyum indikatörünü dondurucudan çıkarın ve indikatör çözünene kadar oda sıcaklığında çözdürün. Bir deney tüpüne 1 mL PSS koyun ve tüpü 33 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Bir hava taşı aparatını tıpa yardımıyla deney tüpüne sabitleyin veya alternatif olarak parafilm kullanın; ardından saniyede yaklaşık bir kabarcık çıkacak hızda %95 oksijen ve %5 karbondioksit karışımı ile kabarcıklama yapın.Düz kas organını hayvandan çıkarın. Bu örnekte, bu organ farenin idrar kesesidir. Organı, yıkamak için yaklaşık 50 milimetre PSS içerisine yerleştirin; doku yıkandıktan sonra çevredeki adipöz dokuyu ve bağ dokusunu dikkatlice uzaklaştırın.İdrar kesesi için düz kas laureate tipine göre diseksiyonla açın. Mesane boynundan, kaudal uçtan kubbe tepesine kadar boylamsal olarak açın. Kraniyal uçta, baskın kas demetleri yönünde keserek, resserin dorsal yüzeyi boyunca altı ila sekiz milimetre uzunluğunda ve bir ila iki milimetre genişliğinde dört şerit hazırlayın.Diseke edilmiş dokuyu ve önceden ısıtılmış, havalandırılmış PSS'yi, kalsiyum indikatörünü yüklemek için 125 µL 10 µM organ green 488 B ekleyerek test tüpündeki dokuya aktarın ve karıştırmak için elle hafifçe çalkalayın. Tüpü su banyosuna geri yerleştirin. Havalandırma işlemine devam edin ve su banyosunu bir folyo tabakasıyla kapatın.Yeterli dokunun kalsiyum indikatörünü absorbe etmesi için gereken süre, dokunun boyutuna ve düz kas tabakasının kalınlığına göre değişiklik gösterir. Örneğin, fare detrusor kası ve sıçan oks kası için bu süre 70 dakikadır. Sıçan detrusor kası ve fare VA damarları için ise inkübasyonu 120 dakika boyunca gerçekleştiriyoruz.Doku kalsiyum indikatörü ile yüklendikten sonra mikroskopi için hazırlanabilir. İlk olarak, dokuyu 10 dakika boyunca kabarcıklı PSS ile yıkayın. Ardından, dokuyu S korumalı bir preparasyon kabına yerleştirin.Düz bir tabaka oluşturmak için hafifçe gerin. Dokuyu, örneğin 25 ila 50 µm çapında iki milimetrelik kısa gümüş tel parçaları kullanarak sabitleyin ve pinleri belirli bir açıyla yerleştirin.Objektifi çizebileceği için birkaç milimetreden daha uzun olan pinlerin kullanılmasından kaçının. Dokunun kendiliğinden hareket etmesini en aza indirmek ve görüntüleme için uygun bir bölgenin belirlenmesini kolaylaştırmak adına dokunun dikkatli bir şekilde sabitlenmesi önemlidir. Doku sabitlendikten sonra, preparat kabını mikroskop tablasına yerleştirin.PSS'nin kabın sil koruyucu kaplı alanının dışına çıkmamasına dikkat edin. Bu durum, geniş bir alanın PSS ile kaplanmasına yol açabilir. Demonstrasyon amaçlı süperfüzyon başladığında, aşağıdaki adımlar ışık altında gerçekleştirilecektir.Lütfen bu deneylerin normalde karanlıkta gerçekleştirildiğini unutmayın. Hazırlığı süperfüze etmek için pompayı çalıştırın. PSS ile genellikle saatte 100 mililitre'lik bir hız kullanılır.Isıtıcı ünitesini açın; giriş ve çıkış tüplerini ve sıcaklık probunu, her birini tabanındaki mıknatısla metal şeride sabitleyerek hazırlık kabına yerleştirin. Çıkış tüpünün ucunun yüksekliği, PSS derinliğini belirleyecektir. Çıkışın bazen gerçekleşmediği göz önünde bulundurularak, PSS'nin gerçekten uzaklaştırıldığından emin olmak için dikkatli olun.Başlangıçta, ısıtıcı ünitedeki sıcaklığı 33 ile 35 derece Santigrat arasında istenen sıcaklığa ulaşacak şekilde ayarlayın. Dokunun, 10 veya 20 katlık düşük güçte bir objektif ile en az 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.Düz kası görüntülemek ve izleme için uygun bir bölge belirlemek amacıyla epi-floresan mikroskobu kullanın veya mavi ışıkla uyarın. Uyarma ve aydınlatmaya maruz kalma, indikatörün fotobağlanmasına (fotobeyazlama) neden olacaktır. Bir seferde birkaç saniyeden fazla kullanmaktan kaçının.Görüntüleme algoritmasında çok sayıda yanlış pozitifle karşılaşılabileceği için parlak yapıların bulunduğu bölgelerden kaçının. Alan içinde minimum hareketin olduğu ve çok sayıda düz kas hücresinin bulunduğu bir bölge seçmeye çalışın. Görüntülenecek bölgeyi seçtikten sonra 40 x gibi daha yüksek büyütmeli bir objektife geçiş yapın.Düz kas hücresi veya hücreleri yatay konuma gelene kadar sahneyi veya optik ekseni döndürün. Bu konum, hızlı tarama eksenine paraleldir. Düz kas hücreleri artık konfokal mikroskopi ile görüntüleme için hazırdır.Bu protokolde, Leica SP iki dik konfokal mikroskop kullanıyoruz. Pinhole'u tek bir airy disk boyutuna getirin. Lazer gücünü, custo optic ayarlanabilir filtre üzerinden %25 ile %35 arasında ayarlayın.Bu değer, parlaklık ve fotobleaching arasındaki bir dengedir. Veri analizine hazırlanmak için ImageJ'i indirip kurun. Platformunuza uygun sürümü indirin ve ardından eski dosyayı değiştirmek için en güncel ImageJ jar dosyasını indirerek en son sürüme güncelleyin. Sonra, Excel writer jar dosyasını indirin ve plugins jar dizinine kurun.Bu dosyaları eklentiler dizinine kopyalayın. Bu betiklerin her birini eklenti makrolarını kullanarak yükleyin. Image J'nin yükleme işlevini kullanın. Kullandığımız Leica SP iki konfokal mikroskobunun yazılımı Leica olarak adlandırılır.LCS, her serinin tekil karelerini ayrı bir dosya olarak kaydeder. Seriyi yeniden oluşturmak için, yeniden oluşturulacak tüm karelerin tek bir klasörde olduğundan emin olun.Örneğin, data folder tiffs. Ardından, plugins macros menüsünden Leica SP two stacker makrosunu seçin. Kök dizini, bu durumda data folder'ı seçin.Açılır listeden istenen klasörü seçin. Bu durumda, tiffs için bir çıktı dizini seçin veya yeni bir tane oluşturun. Örneğin, data folder stacks.Ardından betik, hareket kaynaklı hataları düzeltmek için tekil karelerden serileri yeniden oluşturacaktır. Bir seri içindeki kareleri hizalayan veya eşleştiren, ücretsiz olarak sunulan downloads stack, rig ve turbo reg algoritmalarını kullanıyoruz. Her birine ait dosyaları stacks klasörüne kopyalayın.İşlenecek olan bir yığını yükleyin ve ardından ilgi alanını net bir şekilde gösteren bir kareye gidin. Diğer kareler bu referans kareye göre hizalanacaktır. Bundan sonra, pluginler (eklentiler) altındaki stacks (yığınlar) bölümüne gidin.Yığın Kayıt. Her bölge için en etkili olanı belirlemek amacıyla farklı transformasyonların her birini deneyin. Kalsiyum geçişlerinin tespitini etkileyen görüntülenen faktörler, her bölgenin belirli özellikleri ve partikül parametreleri ölçülerek değişiklik gösterecektir.Tespitin hassasiyeti ve özgüllüğü artırılmıştır. Bu nedenle, her bölge için oran için çıkarılmış eşik değerini ve hücre kenarı eşik değerini hesaplayacağız. Başlamak için eklentiler (plugins), makrolar (macros), yükle (install) adımlarını izleyin ve jn CTO dot oh eight release dot IJM JM dosyasını seçin. Ardından eklentiler (plugins), makrolar (macros), yığını yükle (load stack) seçeneğine gidin.Bir seri seçin ve aşağıdaki partikül parametrelerini hesaplayın. Çıkarılmış değer için eşiği hesaplamak amacıyla, arka plan ölçümü olduğuna inandığınız bir bölge üzerinde dikdörtgen bir ilgi alanı seçin. Ortalamayı not edin. Oran için eşiği hesaplamak amacıyla, düz kas hücresinin veya hücrelerinin optik olarak düz bir alanı etrafında dikdörtgen bir ilgi alanı seçin.Ortalamayı ve standart sapmayı ölçüp not edin. İşlemi iki kez daha tekrarlayın veya shift tuşuna basarak aynı anda üç kutu çizin. Oran için eşik değerini hesaplayıp not edin.Standart sapmanın ortalamaya bölünmesi ve ardından sonuca 1 eklenmesi şeklinde hesaplayın, daha sonra elde edilen sonucu 32 ile çarpın. Üç tekrardan gelen değerlerin ortalaması alındığında, önceki kareyle kıyaslandığında hiçbir değişikliğin 32 tam sayı değerine karşılık geldiği oranlama algoritmasını hesaba katmak için 32 faktörü gereklidir. Bu, orandaki artış ve azalışları tespit etmek için uygun bir dinamik aralık sağlar.Sekiz bitlik bir görüntü için, görüntü ayarlama eşiğini (image adjust threshold) seçin. Siyah ve beyazı seçin. Üst sürgü sınırının altını tanımlayın ve karşılık gelen değeri not edin.Bu, sürgünün sağındadır. Yalnızca siyah bölgelerde meydana gelen olaylar sayılacaktır. Sıfırla'ya tıklayın.Oran için çıkarılmış eşik değeri ve hücre kenarı eşik değeri hesaplandığına göre, artık görüntü yığınlarını analiz edebiliriz. Analiz edilecek yığınların konumunu belirleyin. Bu aşamada yalnızca bir seri seçin.Bu ilk dosyadır ve son dosya da aynı olmalıdır. Ardından veri dosyalarının ve yığınların (stacks) çıktıları için bir konum seçin. Örneğin, veri klasörü çıktısı.Çıkarılan eşik değeri, oran eşiği ve hücre kenarı eşiği değerlerini girin. Diğer ayarları varsayılan değerlerinde bırakın. Algoritma, işlenen serinin solda ve orijinal serinin sağda gösterildiği çift bölmeli bir pencere oluşturacaktır.Çıktı klasöründeki bu dosyayı açın ve yalancı pozitiflerin sayısını ve gözle görülebilen olayların tespit edilemediği durumları değerlendirmek için dosyayı dikkatlice inceleyin. Algoritma, her seri için tespit edilen olayın genlik alanı ve konumu gibi özelliklerini detaylandıran bir Excel dosyası oluşturur; algoritmanın çıktı olarak verdiği görüntü dosyalarının incelenmesiyle belirlenen yalancı pozitifler, bu Excel dosyasından manuel olarak silinebilir. Ancak, bunu yaparken katı kriterlere sahip olmanız gerekir.Bu, düz kaslardaki kalsiyum geçişinin bir videosudur. Bu örnekte video, beş hertz hızında elde edilen 100 ayrı kareden oluşmaktadır. Örneğin, belirli bir ilacın kalsiyum geçişi frekansı üzerindeki etkisini araştırırken deney başına bu videolardan birçok tane elde ederiz.Burada, düz kas hücrelerinde çok sayıda spontan kalsiyum geçici artışı görülmektedir. Parçacık algılama algoritmasının sonucu burada gösterilmiştir. Algoritma, her seri için tespit edilen olayın genlik alanı ve konumu gibi özelliklerini detaylandıran bir Excel dosyası oluşturur.Böylece idrar kesesi gibi düz kas organlarında kalsiyum geçişlerini görüntülemek için bir yöntem ve laboratuvarımızda geliştirdiğimiz bir algoritmayı kullanarak bu kalsiyum geçişlerini analiz etme yolunu göstermiş olduk. Hatırlanması gereken önemli hususlar, dokunun kalsiyum görüntüleme için iyi şekilde hazırlanmasıdır. Bugün gösterdiğimiz doku örneğinde bu işlem, bağ dokusunun temizlenmesini ve alanı kapatabilecek tüm yağların uzaklaştırılmasını kapsamaktadır.Dokuyu düz bir tabaka halinde sabitlemek de önemlidir. Deneylerinizde başarılar diler, izlediğiniz için teşekkür ederiz.

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak canlı hücreler yavaş akıları hızlı (mikrosaniye) kalsiyum olayları izole etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem, bir hücrede birkaç yüz piksel kayıt satırı tarar kalsiyum göstergeler floresan dalgalanmaları ölçer. Histogram analizi, bize farklı kalsiyum akıları zaman ölçeklerinde izole etmek için izin verir.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Vasküler hücre fonksiyonu, hücre içi habercilerin aktivitesine bağlıdır.  Burada tarif edilen, izole bir aortun bireysel endotel ve düz kas hücrelerinde fizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve nitrik oksit seviyelerinin ölçülmesine izin veren bir ex vivo iki foton görüntüleme yöntemidir.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Bu makale, sıçan kalbinden izole edilen kardiyak miyositlerde kasılma sırasında miyofilament Ca2+ duyarlılığındaki değişiklikleri değerlendiren bir protokolü açıklamaktadır. Kardiyak elektrofizyoloji, sistolik/diyastolik sitozol Ca2+ seviyeleri ve kasılma/gevşeme ile birlikte bu ölçüm, sağlıklı ve hastalıklı kalplerde kardiyak uyarılma-kasılma eşleşmesine aracılık eden mekanizmaların desteklenmesinde zorunludur.

Myofilament Ca Değerlendirilmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Duyarlılık temelinde Kardiyak Uyarma-kasılma Kaplin

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Bu protokol, aktif olarak kasıtlı bir kardiyak trabecula ex vivo'dansarkom, kalsiyum ve makroskopik geometrik verilerin bir koleksiyonunu sunar. Bu eşzamanlı ölçümler üç görüntüleme yönteminin entegrasyonu ile mümkün olmaktadır.

Kardiyak Trabeculae Ex Vivo'nun Eşzamanlı Brightfield, Floresan ve Optik Tutarlılık Tomografik Görüntülemesi

Protokol, kesilmiş sinirden fare motor sinir terminallerine floresan kalsiyum boyası yükleme yöntemini açıklar. Ek olarak, konfokal mikroskopi kullanarak periferik sinir uçlarındaki hızlı kalsiyum geçicilerini kaydetmek için benzersiz bir yöntem sunulmuştur.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Mevcut protokol, neredeyse in vivo bir ortamda hava yolunu ve intrapulmoner arteriyel düz kas kontraktilitesini değerlendirmek için fare hassasiyetiyle kesilmiş akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklamaktadır.

Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, protein alanı hareketlerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Bu tekniğin doğal hücrelerde uygulanması için modifikasyonu, artık murin izole iskelet kası liflerindeki voltaj kapılı Ca2 + kanallarından tek voltaj sensörü hareketlerinin tespit edilmesine ve izlenmesine izin vermektedir.

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca2+ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca2+ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Öğrenin düz kas dokusunda yüksek çözünürlüklü kalsiyum görüntüleme yöntemini. Konfokal mikroskopi ile sinir iletici etkilerini analiz edin ve düz kas fizyolojisi araştırmaları için protokolü keşfedin.

Odak Ca^{2 + Geçici Algılama}

Daha fazla video keşfet