Odak Ca ^{2 + Geçici Algılama}

İlk olarak, bir kalsiyum yükleme çözeltisi hazırlanır, ısıtılır ve havalandırılır. Üriner mesane çıkarılır, açılır, düz bir şekilde iğnelenir ve bir detrusor şeridi alınır. Detrusor şeridi yükleme çözeltisine eklenir, inkübe edilir, durulanır ve düz bir şekilde iğnelenir.

Doku içindeki kalsiyum seviyesi lazer ışığı ile uyarılır ve yayılan ışık yakalanarak sonuçlar elde edilir. Münferit karelerden oluşan videolar, ardışık kareler karşılaştırılarak analiz edilir. Arka plan çıkarılır.

Hücre kenarı eşiği, olayların nerede bulunabileceğini belirler ve ardışık beyinler arasında bir oran alınır. Kalan olaylar önceden tanımlanmış kriterlerle eşleşirse, vurgulanır ve etiketlenir. Merhaba, ben Oxford Üniversitesi Farmakoloji Bölümü'nden Keith Brain ve Tom Kinane laboratuvarlarından John Young.

Ben Brain ve Canne Laboratuvarlarından Rob Amos, benim adım da Keith Brain. Bugün John ve Rob size düz kasta bir kalsiyum görüntüleme tekniğini gösterecekler. Bunu laboratuvarımızda, otonom sinirlerden nörotransmitter salınımını ve bunun düz kas üzerindeki etkisini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Kalsiyum indikatörü organ green 488 BAFTA 1:00 AM, 50 mikrogram toz içeren 500 mikrolitrelik flakonlar şeklinde sunulmaktadır. Kalsiyum indikatörünü hazırlamak için, tozun üzerine 40 mikrolitre Onic F1 27 çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca nazikçe çalkalayın; ardından, 460 mikrolitre fizyolojik tuzlu çözelti (PSS) ekleyin ve 30 saniye daha nazikçe çalkalayın.

Final çözelti, 10 µM Organ Green 488 BAFTA 1:00 AM, her biri 125 µL olan dört alikot sağlar. Işıktan kaçının ve ilgili dokuyu diseke etmeden önce çözeltiyi -20 °C'de saklayın.

Kalsiyum indikatörünü dondurucudan çıkarın ve kalsiyum indikatörü çözünene kadar oda sıcaklığında bekletin. Bir deney tüpüne bir mililitre PSS koyun ve 33 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Bir hava taşı düzeneğini tıpaya yardımıyla deney tüpüne sabitleyin veya Alternatively olarak Parafilm kullanabilirsiniz; ardından saniyede yaklaşık bir kabarcık çıkacak şekilde %95 oksijen ve %5 karbondioksit karışımı ile havalandırın.

Düz kas organını hayvandan çıkarın. Bu örnekte, organ bir fareden alınan idrar kesesidir. Organı, yıkamak için yaklaşık 50 milimetre PSS içerisine yerleştirin; doku yıkandıktan sonra çevre yağ dokusunu ve bağ dokusunu dikkatlice temizleyin.

İdrar torbası için düz kas laurean tipine göre diseke ederek açın. Mesane boynundan, caudal uçtan kubbenin üst kısmına kadar boyuna olarak açın. Kraniyal ucu hazırlayın; resserin dorsal yüzeyi boyunca, dominant kas demetleri yönünde keserek altı ila sekiz milimetre uzunluğunda ve bir ila iki milimetre genişliğinde dört şerit hazırlayın.

Diseke edilmiş dokuyu ve önceden ısıtılmış ve havalandırılmış PSS'yi, kalsiyum indikatörünü yüklemek için 125 µL 10 µM organ green 488 B ile birlikte test tüpündeki dokuya ekleyin ve karıştırmak için elle hafifçe sallayın. Tüpü su banyosuna geri yerleştirin. Havalandırma işlemine devam edin ve su banyosunu bir folyo tabakasıyla örtün.

Yeterli dokunun kalsiyum indikatörünü absorbe etmesi için gereken süre, dokunun boyutuna ve düz kas tabakasının kalınlığına göre değişiklik gösterir. Örneğin, fare detrusor kası ve sıçan oxs için bu süre 70 dakikadır. Sıçan detrusor kası ve fare VAs deens için ise 120 dakika boyunca inkübasyon yaparız.

Doku kalsiyum indikatörü ile yüklendikten sonra mikroskopi için hazırlanabilir. İlk olarak, dokuyu 10 dakika boyunca kabarcıklı PSS ile yıkayın. Ardından, dokuyu S korumalı bir hazırlama kabına yerleştirin.

Düz bir tabaka oluşturmak için hafifçe gerdirin. Dokuyu, örneğin 25 ila 50 µm çapında gümüş telden kesilmiş iki mm'lik kısa parçalar kullanarak iğneleyin ve iğneleri açılı bir şekilde yerleştirin.

Objektifi çizebileceği için birkaç milimetreden daha uzun olan iğnelerin kullanımından kaçının. Dokunun kendiliğinden büzülmesini en aza indirmek ve görüntüleme için uygun bir bölgenin belirlenmesini kolaylaştırmak adına dokunun dikkatle iğnelenmesi önemlidir. Doku iğnelendikten sonra, hazırlık kabını mikroskop tablasına yerleştirin.

PSS'nin kabın sil korumalı alanının dışına çıkmamasına dikkat edin. Aksi takdirde geniş bir alan PSS ile kaplanabilir. Gösterim amaçlı superfüzyon başladığında, aşağıdaki adımlar ışık altında gerçekleştirilecektir.

Lütfen bu deneylerin normalde karanlıkta gerçekleştirildiğini unutmayın. Hazırlığı süperfüze etmek için pompayı çalıştırın. PSS ile genellikle saatte 100 mililitre hız kullanılır.

Isıtıcı üniteyi açın; giriş ve çıkış tüpleri ile sıcaklık probunu, tabanlarındaki mıknatıslarla metal şeride sabitleyerek hazırlık kabına yerleştirin. Çıkış tüpü ucunun yüksekliği, PSS derinliğini belirleyecektir. Çıkışın bazen gerçekleşmediği göz önüne alınarak, PSS'nin gerçekten uzaklaştırıldığından emin olmaya dikkat edin.

Başlangıçta, ısıtıcı ünitedeki sıcaklığı 33 ile 35 °C arasındaki istenen sıcaklığa ulaşacak şekilde ayarlayın. Dokunun 10x veya 20x düşük güçlü bir objektif altında en az 10 dakika boyunca dengelenmesini sağlayın.

Düz kası görüntülemek ve izlemek için uygun bir bölge belirlemek amacıyla epi-floresans veya mavi ışık uyarımı kullanın. Uyarma ışığına maruz kalma, indikatörün fotobeyazlamasına neden olacaktır. Bir seferde birkaç saniyeden fazla kullanmaktan kaçının.

Görüntüleme algoritmasında yüksek sayıda yalancı pozitifliğe neden olabilecekleri için parlak yapıların bulunduğu alanlardan kaçının. Minimal hareketin olduğu ve görüş alanında çok sayıda düz kas hücresinin bulunduğu bir bölge seçmeye çalışın. Görüntülenecek bölgeyi seçtikten sonra 40 x gibi daha yüksek büyütmeli bir objektife geçin.

Düz kas hücresi veya hücreleri yatay konuma gelecek şekilde sahneyi veya optik ekseni döndürün. Bu konum, hızlı tarama eksenine paraleldir. Düz kas hücreleri artık konfokal mikroskopi ile görüntüleme için hazırdır.

Bu protokolde, bir Leica SP iki dik konfokal mikroskop kullanıyoruz. Pinhole'u bir airy disk olacak şekilde kapatın. Lazer gücünü custo optic ayarlanabilir filtre üzerinde %25 ile %35 arasında ayarlayın.

Bu değer, parlaklık ve fotobezme (photo bleaching) arasındaki bir dengedir. Veri analizine hazırlanmak için ImageJ'i indirip kurun. Platforma özel sürümü indirin ve ardından eski dosyayı değiştirmek için en güncel ImageJ jar dosyasını indirerek en son sürüme güncelleyin. Sonrasında, Excel writer jar dosyasını indirin ve plugins jar dizinine kurun.

Bu dosyaları eklentiler (plugins) dizinine kopyalayın. Bu betiklerin her birini eklenti makrolarını kullanarak yükleyin. ImageJ'in yükleme fonksiyonunu kullanın. Kullandığımız Leica SP2 konfokal mikroskobun yazılımı Leica olarak adlandırılmaktadır.

LCS, her serinin tekil karelerini ayrı bir dosya olarak kaydeder. Seriyi yeniden oluşturmak için, yeniden oluşturulacak tüm karelerin tek bir klasörde olduğundan emin olun.

Örneğin, data folder tiffs. Ardından, eklentiler (plugins) makrolar (macros) menüsünden Leica SP two stacker makrosunu seçin. Kök dizin olarak bu örnekte data folder'ı seçin.

Açılır listeden istenen klasörü seçin. Bu durumda, tiffs bir çıktı dizini seçin veya yeni bir tane oluşturun. Örneğin, veri klasörü yığınları.

Ardından betik, hareketten kaynaklanan hataları düzeltmek için tekil karelerden serileri yeniden oluşturacaktır. Bir seri indirme yığındaki kareleri hizalayan veya eşleştiren, ücretsiz olarak sunulan rig ve turbo reg algoritmalarını kullanıyoruz. Her birine ait dosyaları stacks klasörüne kopyalayın.

İşlenecek bir yığını yükleyin ve ardından ilgi alanını net bir şekilde gösteren bir kareye geçiş yapın. Diğer kareler bu referans kareye göre hizalanacaktır. Bundan sonra, eklentiler (plugins) altındaki yığınlar (stacks) sekmesine gidin.

Yığın Kayıt. Her bölge için neyin en etkili olduğunu belirlemek amacıyla farklı transformasyonların her birini deneyin. Kalsiyum geçişlerinin tespitini etkileyen görüntüleme faktörleri, her bölgenin belirli özelliklerini ve partikül parametrelerini ölçerek değişkenlik gösterecektir.

Saptamanın duyarlılığı ve özgüllüğü artırılmıştır. Bu nedenle, her bir bölge için oran çıkarılmış eşik değerini ve hücre kenarı eşik değerini hesaplayacağız. Başlamak için eklentiler (plugins), makrolar (macros), yükle (install) sekmesine gidin ve jn CTO dot oh eight release dot IJM JM dosyasını seçin. Ardından eklentiler (plugins), makrolar (macros), yığını yükle (load stack) kısmına gidin.

Bir seri seçin ve aşağıdaki partikül parametrelerini hesaplayın. Çıkarma işlemi için eşik değerini hesaplamak amacıyla, arka plan ölçümü olduğunu düşündüğünüz alanda dikdörtgen bir ilgi alanı seçin. Ortalama değeri not edin. Oran için eşik değerini hesaplamak amacıyla, düz kas hücresinin veya hücrelerinin optik olarak düz bir alanı çevresinde dikdörtgen bir ilgi alanı seçin.

Ortalamayı ve standart sapmayı ölçüp not edin. İşlemi iki kez daha tekrarlayın veya shift tuşuna basarak aynı anda üç kutu çizebilirsiniz. Oran için eşik değerini hesaplayıp not edin.

Standart sapmanın ortalamaya bölünmesi ve sonuca bir eklenmesi şeklinde hesaplayın, ardından elde edilen sonucu 32 ile çarpın. Üç tekrardan gelen değerlerin ortalaması alındığında, önceki kareye göre hiçbir değişikliğin 32 tam sayı değerine eşlendiği oranlama algoritmasını hesaba katmak için 32 çarpanı gereklidir. Bu işlem, orandaki artış ve azalışları tespit etmek için iyi bir dinamik aralık sağlar.

Sekiz bitlik bir görüntü için, görüntü ayarla eşik değerini (image adjust threshold) seçin. Siyah ve beyazı seçin. Üst sürgü sınırının altını tanımlayın ve karşılık gelen değeri not edin.

Bu, sürgünün sağ tarafındadır. Yalnızca siyah bölgelerde meydana gelen olaylar sayılacaktır. Sıfırla'ya tıklayın.

Oran için çıkarılmış eşik ve hücre kenarı eşiği hesaplandığına göre, görüntü yığınlarını analiz edebiliriz. Analiz edilecek yığınların konumunu belirleyin. Bu aşamada yalnızca bir seri seçin.

Bu ilk dosyadır ve son dosya da aynı olmalıdır. Ardından veri dosyalarının ve yığınların çıktısı için bir konum seçin. Örneğin, veri klasörü çıktısı.

Çıkarılan eşik için eşik değerlerini, oran için eşiği ve hücre kenarı eşiğini girin. Diğer ayarları varsayılan değerlerinde bırakın. Algoritma, işlenmiş serinin solda ve orijinalin sağda gösterildiği çift panelli bir pencere oluşturacaktır.

Bu dosyayı çıktı klasöründen açın ve yanlış pozitiflerin sayısını ve gözle görülebilen olayların tespit edilemediği durumları değerlendirmek için dikkatle inceleyin. Algoritma, her seri için tespit edilen olayın genlik alanı ve konumu gibi özelliklerini detaylandıran bir Excel dosyası oluşturur; algoritmanın çıktı olarak verdiği görüntü dosyalarının incelenmesiyle belirlenen yanlış pozitifler, bu Excel dosyasından manuel olarak silinebilir. Ancak, bunu yaparken katı kriterlere sahip olmalısınız.

Bu, düz kaslarda kalsiyum geçiciliğinin bir videosudur. Bu örnekte video, beş hertz hızında elde edilmiş 100 ayrı kareden oluşmaktadır. Örneğin, belirli bir ilacın kalsiyum geçici hızı üzerindeki etkisini araştırırken, deney başına bu videolardan çok sayıda elde ederiz.

Burada, düz kas hücrelerinde çok sayıda spontan kalsiyum geçişi görülmektedir. Partikül tespit algoritmasının sonucu burada gösterilmiştir. Algoritma, her seri için tespit edilen olayın genlik alanı ve konumu gibi özelliklerini detaylandıran bir Excel dosyası oluşturur.

Böylece, idrar kesesi gibi düz kas organlarında kalsiyum geçişlerinin görüntülenmesi için bir yöntem ve bu kalsiyum geçişlerini laboratuvarımızda geliştirdiğimiz bir algoritma kullanarak analiz etme yolunu göstermiş olduk. Hatırlanması gereken önemli hususlar, dokunun kalsiyum görüntülemesi için iyi şekilde hazırlanmasıdır. Bugün gösterdiğimiz doku örneğinde bu işlem, bağ dokusunun temizlenmesi ve alanı kapatabilecek tüm yağların uzaklaştırılmasıdır.

Dokuyu düz bir tabaka halinde iğnelemek de önemlidir. Deneylerinizde başarılar dileriz, izlediğiniz için teşekkürler.