Zebra balığı Lens Nakli ve Göz Mutants Analizi Uygulaması

Zebrafish GFP ekspresyonlu transgenik donörlerde ve yabani tip alıcı konaklarda lens transplantasyonuna başlamak için, balıklar önce kalsiyumsuz zebrafish ringer çözeltisi içeren ayrı petri kaplarında 30 dakika boyunca inkübe edilir. Ardından balık larvaları, düşük erime noktalı agros içerisinde iki paralel hat şeklinde gömülür. Hat A donörler, Hat B ise konaklar içindir. Konaklar için, donörün tüm gözü çıkarılırken, konaktan sadece lens çıkarılır.

Donör lensi konağın gözüne yerleştirmeden önce lensi çevreleyen dokular uzaklaştırılır. Transplantasyon sonrası balıklar etiketlenmiş 24 kuyucuklu plakalarda saklanır. Transplant edilen lens, konakta GFP floresanını göstermelidir.

Doğal olarak, konakçının kontralateral gözüne operasyon yapılmamıştır ve GFP eksprese etmez. Merhaba, ben Yj. Ben de Kaya McCullough; Harvard Tıp Okulu Oftalmoloji Bölümü'ndeki Dr. Yma Maki'nin laboratuvarından geliyoruz. Bugün size, yabanıl tip zebrafish Danio rerio'da lens transplantasyonu prosedürünü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, lensleri vahşi tip hayvanlardan mutant hayvanlara ve tersine nakletmek için bu prosedürü kullanıyoruz. Bu işlem, mutant genlerin lenste otonom veya non-otonom olarak işlev görüp görmediğini belirlememize olanak tanır. Öyleyse başlayalım.

Zebrafish suşları, standart balık tesisi koşullarında, 28.5 °C'de, 14 saat ışık ve 10 saat karanlık döngüsünde tutulur; planlanan deneyden önceki akşam, erkek ve dişiler birbirlerinden ayırmak için bölmeli bir tanka yerleştirilir. Bu balıkların genotipi, GFP ekspresyonuna ve hedeflenen mutasyona sahip yavrular vermelidir. Paralel olarak, aynı prosedürü kullanarak bir saat içinde transgenik olmayan vahşi tip hayvanlar arasında çaprazlamalar gerçekleştirin.

Sabah ışıklar yandıktan sonra, balıkların çiftleşmesine izin vermek için bölmeleri çıkarın. 15 ila 30 dakika sonra, embriyoları toplamak için tank suyunu bir süzgece dökün ve ardından bir yıkama şişesinden yumurta suyu püskürterek bunları 100 x 15 mm'lik bir Petri kabına yıkayın. Daha sonra, döllenmiş embriyolar üzerindeki detritusları ve tüm kalıntıları pipetle çekerek yumurtaları temizleyin.

Eski yumurta suyunu yeni yumurta suyu ile değiştirin. Embriyolar, lens transplantasyonu öncesinde 28.5 °C'lik bir inkübatörde saklanabilir. Transplantasyon işlemine geçmeye hazır olduğunuzda, koriyonu manuel olarak temizleyerek embriyoları hazırlayın.

Metal bir prob ve bir pens yardımıyla, dekorasyon kaplı embriyolar şimdi kalsiyum içermeyen ZFR içindeki %0,2 EDTA'da 30 dakika boyunca inkübe edilmelidir. İnkübasyon sırasında, disseksiyon için gerekli iğneler hazırlanabilir. Transplantasyon prosedürü, lensi çevreleyen dokuları kesmek için bilenmiş bir iğne ve agros'tan alınan Woolies embriyolarını gerektirir.

Ayrıca, donör lensi hareket ettirmek ve konakçıya yerleştirmek için küt uçlu bir iğne gereklidir; bu iğnenin her birini hazırlamak için önce bir Pasture pipetinin ucunu elmas bıçakla kesin. Ardından, uzunluğunun yaklaşık yarısı içeride kalacak şekilde bir cam kılcal boruyu Pasture pipeti ucuna yerleştirin. Bir alev kullanarak, ince bir tungsten teli kılcal borunun açık ucundan dikkatlice yerleştirin.

Camı tel üzerinde eritin; metal tel ile cam ucunu sabit tutarken iğnenin diğer ucunu döndürün. Yumuşayan cam, metali kavrayarak onun etrafında sarmal oluşturmalıdır. Bu işlem, sivriltilmiş bir iğne oluşturmak için küt bir iğne meydana getirir.

Tungsten teli, metal yanana kadar 1 ila 1,5 dakika boyunca alev üzerinde tutun. Böylece çok ince bir uç oluşturulur. Ucun kalitesini mikroskopi ile kontrol edin.

İyi bir uç bükülmemeli veya kıvrılmamalıdır ve çapı 50 mikrometreden büyük olmayan ince bir uca doğru düzgünce daralmalıdır. Prosedüre başlamadan önce her iki iğneyi de alevde birkaç saniye sterilize edin ve soğumasını bekleyin; plastik bir santrifüj tüpü içerisinde, su banyosunda 40 °C'ye ön ısıtma yapılmış %1,2 düşük erime noktalı agar ve kalsiyumsuz ZFR hazırlayın. İstenen aşamada, donör embriyoları bir pastoral pipetle alın ve yavaşça agar içeren santrifüj tüpüne aktarın. Yumurtaları agar içerisinde yaklaşık beş saniye inkübe edin.

Embriyoları pipetle alın ve yavaşça ve dikkatlice pipetleyerek yüz milimetrelik polistiren bir Petri kabına sıra halinde dizin; embriyoların çoğu, gözü yukarı bakacak şekilde yan yatacaktır. Şimdi bu işlemi konak yumurtalarıyla tekrarlayın ve agar katılaşmadan önce onları donör yumurtalara paralel bir sıra halinde dizin. Agar katılaştıktan sonra, yanlış konumlanmış embriyoları, gözü yukarı bakacak şekilde döndürmek için küt uçlu iğneyi kullanın.

Üzerini %0,2 düşük erime noktalı agar çözeltisi ile kaplayın. Sivrilmiş bir iğne kullanarak, gözlerin etrafındaki agarları temizleyin ve yüzen donör gözün tamamını çok dikkatli bir şekilde kesip çıkarın. Ardından, lensi gözden ayırın.

Bu işlem, iğnenin göz dokusu boyunca alttan üste doğru çekilmesiyle gerçekleştirilir. Sadece konakçı için uygulanır. Lens, sivriltilmiş bir iğne ile küçük darbelerle, lensi yırtmadan mümkün olduğunca yakından kesilerek çıkarılır.

Konak gözün geri kalanından çok fazla doku almaya dikkat edin. Serbest kaldığında lensler ortamda yüzecektir. Kör uçlu iğneyi kullanarak, donör lensi dikkatlice konak lensin konumunun hemen üzerine itin ve ardından kör uçlu iğne ile olması gereken konuma doğru aşağıya itin.

Konak mercek atılabilir. Donör ve konak embriyolarını 30 ila 60 dakika boyunca %1,2 Aros içinde bekletin. Embriyo besiyeri yara iyileşmesine yardımcı olacaktır.

Ardından, sivritilmiş metal iğne kullanarak onları agrozdan kurtarın. Embriyoları, embriyo medyumu içeren 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Her bir embriyo ayrı bir kuyucukta yer almalıdır.

Lens transfer işlemi tamamlandıktan sonra hangi konakçının hangi donöre karşılık geldiğinin net olması için kuyucukları uygun şekilde etiketlediğinizden emin olun. Embriyoların istenen süreye kadar 28.5 °C'de gelişmesine izin verin. Fenotipik gözlem için genellikle bir ila iki gün içinde lens farklılaşmasını inceleriz.

Donör kaynaklı lens, konak gözle transplantation sonrası GFP ekspresyonunu korumalıdır. Eğer mutant fenotip yabani tip ortamda düzeltilemiyorsa, bu durum fenotipin otonom olduğunu gösterir. Ancak, eğer düzeltiliyorsa, fenotip non-otonom kabul edilir.

Ve bunun, altta yatan genin işleyişi üzerinde önemli etkileri vardır. Size zebra balığı embriyosunda lens transplantasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, iğneleri nasıl şekillendirdiğiniz ve lensin kendisini nasıl diseke ettiğiniz konusunda çok dikkatli olmanız önemlidir.

Ayrıca, transplantasyon tamamlandıktan sonra yumurtaların yuvarlanması gerçekleşmeden önce embriyolar hızlıca düzenlenmelidir. Embriyoların, sekizli ahşap iyileştirme düzeneğindeki ortama eklemeyi unutmayın. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.