Zebra balığı Lens Nakli ve Göz Mutants Analizi Uygulaması

Zebra balığında lens transplantasyonuna başlamak için, transgenik donörleri ve vahşi musluk alıcılarını eksprese eden GFP, konakçılar önce kalsiyum içermeyen zebra balığı zil çözeltisi içeren ayrı evcil hayvan kaplarında 30 dakika kuluçkaya yatırılır. Balık larvaları daha sonra düşük erime noktalı agroslarda iki paralel çizgiye gömülür. Bir satır A donörler içindir ve diğer B için konakçılar için, donör gözünün tamamı çıkarılırken konakçıdan sadece lens çıkarılır.

Lens konak göze yerleştirilmeden önce donör lensi çevreleyen dokular çıkarılır. Transplantasyondan sonra, fi'ler etiketli 24 oyuklu plakalarda saklanır. Nakledilen lens, konakta GFP floresansını göstermemelidir.

Doğal olarak, konağın kontralateral gözü ameliyat edilmemiştir ve GFP ifade etmemektedir. Merhaba, ben Yj.Ve ben Kaya McCullough ve Harvard Tıp Fakültesi Oftalmoloji Bölümü'ndeki Dr.Yma Maki'nin laboratuvarındanız. Bugün size vahşi tip zebra balığı Daniel Rio'da lens nakli için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarımızda, lensleri vahşi türden mutant hayvanlara nakletmek için kullanıyoruz ve bunun tersi de geçerli. Bu, mutant genlerin lenste özerk mi yoksa özerk olmayan bir şekilde mi işlev gördüğünü belirlememizi sağlar. Öyleyse başlayalım.

Zebra balığı türleri, standart balık tesisi koşullarında, planlanan deneyden önceki akşam 14 saatlik ışık, 10 saatlik karanlık döngüde 28,5 ° C'de tutulur ve bu deney, erkek ve dişileri birbirlerinden ayırmak için bir bölücü ile bir tankta oynar. Bu balıkların genotipi, GFP ekspresyonu ve ilgilenilen herhangi bir mutasyon ile döl vermelidir. Paralel olarak, bir saat içinde nont transgenik vahşi tip hayvanlar arasında çaprazlamalar ayarlamak için aynı prosedürü kullanın.

Sabahları ışık yandıktan sonra, balığın çiftleşmesine izin vermek için bölücüleri çıkarın. 15 ila 30 dakika sonra, embriyoları toplamak için tank suyunu bir süzgecin içine dökün ve daha sonra bir yıkama şişesinden yüz x 15 milimetrelik Petri kabına bir yumurta suyu fışkırtarak yıkayın. Daha sonra döllenmiş embriyolar ve herhangi bir kalıntı üzerine detto pipetleyerek yumurtaları temizleyin.

Eski yumurta suyunu yeni yumurta suyu ile değiştirin. Embriyolar lens naklinden önce 28.5 derece C'lik bir inkübatörde saklanabilir. Transplantasyona devam etmeye hazır olduğunuzda, corion'u manuel olarak çıkararak embriyoları hazırlayın.

Metal bir prob ve bir çift forseps ile, dec kaplı embriyolar şimdi 30 dakika boyunca kalsiyum içermeyen ZFR'de% 0.2 EDTA'da inkübe edilmelidir. İnkübasyon sırasında diseksiyon için gerekli iğneler hazırlanabilir. Transplantasyon prosedürü, lensi çevreleyen dokuları ve agros'tan Woolies embriyolarını kesmek için keskin bir iğne gerektirir.

Ayrıca, donör merceği hareket ettirmek ve her iki iğnenin de önce bir elmas bıçak kullanarak bir mera pipetinin ucunu kesmesini sağlamak için konakçıya yerleştirmek için künt bir iğne gerektirir. Daha sonra, mera kavalcı ucuna, uzunluğunun yaklaşık yarısı içinde olacak şekilde bir cam kılcal yerleştirin. Bir alev kullanarak kılcal damarın açık ucuna ince bir tungsten tel dikkatlice yerleştirin.

Camı forseps ile telin üzerinde eritin, iğnenin diğer ucunu bükerken cam ucunu metal bir tel ile sabit tutun. Yumuşatılmış cam, metalin etrafında sarmal hale getirilmeli ve yerine oturtulmalıdır. Bu, keskin bir iğne oluşturmak için künt bir iğne yapar.

Tungsten telini metali yakarak bir ila 1,5 dakika alev üzerinde tutun. Böylece çok ince bir uç oluşturulur. Mikroskopi ile ucun kalitesini kontrol edin.

İyi bir uç bükülmemeli veya kıvrılmamalı ve çapı 50 mikrometreden büyük olmayan ince bir noktaya kadar düzgün bir şekilde sivrilmelidir. Her iki iğneyi de alevde birkaç saniye sterilize edin ve işleme başlamadan önce plastik bir santrifüj tüpünde soğumalarını bekleyin, istenen aşamada bir su banyosunda %1.2 düşük erime noktalı aros ve 40 derece C'ye önceden ısıtılmış kalsiyum içermeyen ZFR hazırlayın, donör embriyoları bir mera pipetine alın ve yavaşça aros içeren santrifüj tüpüne atın. Yumurtaları aros içinde yaklaşık beş saniye kuluçkaya yatırın.

Embriyoları pipetle çıkarın ve yavaş ve dikkatli bir şekilde pipetleyerek yüz milimetrelik poli stiren Petri kabına arka arkaya yerleştirin, çoğu embriyo gözleri yukarı bakacak şekilde yan yatacaktır. Şimdi bu işlemi konakçı yumurtalarla tekrarlayın ve agros katılaşmadan önce donör yumurtalara paralel bir sıra halinde düzenleyin. Yanlış yönlendirilmiş embriyoları, aros katılaştığında göz yukarı bakacak şekilde döndürmek için künt iğneyi kullanın.

% 0.2 düşük erime noktalı aro çözeltisi ile kaplayın. Keskin bir iğne kullanarak, göz çevresindeki arosları çıkarın ve yüzecek olan tüm donör gözü çok dikkatli bir şekilde kesin. Önümüzdeki. Lensi gözden ayırın.

Bu, iğneyi göz dokusu boyunca aşağıdan yukarıya doğru sürükleyerek yapılır. Yalnızca ana bilgisayar için. Lens, keskin bir iğne ile küçük darbeler kullanılarak kesilir, lense yırtılmadan mümkün olduğunca yakın kesilir.

Ana gözün geri kalanından çok fazla doku çıkarmaktan kaçının. Bir kez serbest lensler ortamda yüzecektir. Künt iğneyi kullanarak, donör lensi dikkatlice konakçı lensin bulunduğu yerin hemen üzerine itin ve ardından künt bir iğne ile yerine itin.

Ana bilgisayar merceği atılabilir. Donör ve ev sahibi embriyoları 30 ila 60 dakika boyunca% 1.2 Aros'ta bırakın. Embriyo ortamı yara iyileşmesine yardımcı olacaktır.

Daha sonra keskinleştirilmiş metal iğneyi kullanarak bunları agrostan serbest bırakın. Embriyoları embriyo ortamı ile 24 oyuklu bir plakaya aktarın. Her embriyo ayrı bir tane işgal etmelidir. Kuyu.

Lens transferi tamamlandıktan sonra hangi konağın hangi donöre karşılık geldiğini net bir şekilde belirlemek için kuyuyu düzgün bir şekilde etiketlediğinizden emin olun. Embriyoların istenen zamana kadar 28.5 derece C geliştirmesine izin verin. Fenotipik gözlem için genellikle bir ila iki gün içinde lens farklılaşmasını inceleriz.

Donörden türetilen lens, konak göze transplantasyondan sonra GFP ekspresyonunu korumalıdır. Vahşi tip ortamda mutant bir fenotip kurtarılmazsa, bu fenotipin özerk olduğunu gösterir. Bununla birlikte, kurtarılırsa, fenotip özerk olmayan olarak kabul edilir.

Ve bunun altta yatan genin işlevi üzerinde önemli etkileri vardır. Zebra balığı embriyosunda lens naklinin nasıl yapıldığını size az önce gösterdik. Bu prosedürü yaparken, iğneleri nasıl şekillendirdiğinize ve lensin kendisini nasıl incelediğinize çok dikkat etmek önemlidir.

Ayrıca, transplantasyon tamamlandıktan sonra yumurta ruloları gerçekleşmeden önce embriyolar hızlı bir şekilde düzenlenmelidir. Odun iyileşmesinde orta ila sekiz embriyo eklemeyi unutmamak için. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.