Fare Sinir Doku Hücre Tek Cezalar Üretimi

Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku aggitation için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS Dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında, nerual doku bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.

Sinir sistemi içinde. Yüzlerce nöronal glial hücre tipi tanımlanmıştır. Beyin veya omurilikteki her spesifik hücre tipi, tanımlanabileceği ve karakterize edilebileceği hücre yüzeyi molekülleri veya moleküler belirleyicilerden oluşan bir repertuara sahiptir.

Şu anda, sağlam hücre tanımlama ve ayırma teknolojileri, aynı anda hücre ölümünü ve karakteristik yüzey proteininin yok edilmesini sınırlarken tek hücre preparatlarının üretilmesini gerektirmektedir. Nazik maksimum birleştirici, tripsin veya pepan bazlı ayrışma kitleri ile kombinasyon halinde kullanıldığında, hücre kaybını sınırlamada antijen epitoplarını korurken beyin dokusunu etkili ve nazikçe ayrıştırabilir. Bir kez üretildikten sonra, tek hücreli süspansiyonlar, nöro progenitörleri tanımlayan veya miyelin çıkarma boncukları kullanılarak daha da saflaştırılan anti belirgin bir mikro boncuk gibi monoklonal konjugatlarla tedavi edilebilir.

Merhaba, benim adım Sandra PeNAT. Burada, bagaj Gabert, Almanya'da bulunan Mil Biotech'te nörobilim ürünleri için proje yöneticisiyim. Bugün size genix dis associator kullanarak fare beyin dokusundan tek hücreli bir süspansiyonun nasıl hazırlanacağını göstereceğim.

Genix dis associator, kapalı steril bir ortamda çeşitli doku tiplerini ayrıştırabilen bir cihazdır ve bu nedenle sıkıcı manuel mekanik ayrışma ihtiyacını ortadan kaldırır. Öyleyse başlayalım. İlgilenilen antijen epitopuna bağlı olarak, sonraki uygulamalarda papain bazlı nöral doku ayrışma kitini veya tripsin bazlı nöral doku ayrışma kitini kullanın.

Bugünün deneyi için, belirgin pozitif hücreleri anti belirgin bir mikroboncuk kullanarak izole etmek istediğimiz için nöro doku ayrışma kiti P'yi tercih ediyoruz. Belirgin olan ne pepane ne de tripsine duyarlıdır ve böyle bir durumda nöro doku ayrışma kiti P daha iyi bir seçimdir. Protokol başlatılmadan önce, bu kit için reaktifler ve çözeltiler hazırlanmalıdır.

Elinizde kendi Hank'in denge tuzu çözeltisi stoğunuzu bulundurun: Kalsiyum iyonları ve magnezyum iyonları içermeyen HBSS, kalsiyum ve magnezyum iyonları içeren HBSS ve beni kapto ışınlayın. Etanol ikinci çözeltiyi, dördüncü çözeltiyi ve ardından birinci enzim karışımını hazırlayarak başlar. İlk olarak, ikinci çözeltiye 0.067 milimolar nihai konsantrasyona kadar betta me capto etanol ekleyin.

Çözelti artık dört santigrat derecede saklandığında bir aya kadar stabildir. Daha sonra, liyofilize tozu ve flakon etiketli bir çözeltiyi çözün. Dört. 0,7 mililitre depolama tamponu kullanarak hafifçe karıştırın ve girdap yapmayın.

Şimdi 1900 mikrolitre çözelti iki, 50 mikrolitre çözelti bir tanesini bir C tüpüne pipetleyerek enzim karışımını hazırlayın. Bu, 400 miligram dokuyu ayırmak için yeterli bir çözeltidir, bu nedenle daha fazlası ayrışacaksa, ek enzim karışımı bir tane hazırlayın. Bir C tüpünde en fazla 1600 miligram beyin dokusu işlenebilir.

C tüpündeki enzim karışımı daha sonra 37 santigrat derecede 10 ila 15 dakika inkübe edilir. Ayrışmaya başlamak için, tüpe kalsiyum ve magnezyum iyonları içermeyen bir mililitre HBSS pipetleyin. Tüpü bir teraziye koyun, beyin dokusunu ekleyin ve kütlesini kaydedin.

Bu P dört fare beyni yaklaşık 0.2 gram ağırlığındadır. Yetişkin bir beyin, 400 miligramdan daha az olan tüm doku örnekleri için yaklaşık 0.4 gram ağırlığında olacaktır. Bugün kullanacağımız çözüm hacimleri yeterlidir.

Dokunuzun ağırlığı 400 miligramdan fazlaysa, tüm reaktif hacimlerini buna göre ölçeklendirin, bir C tüpünde 1600 miligrama kadar doku işlenebilir. Fare beynini, 1.950 mikrolitre önceden ısıtılmış ve enzim içeren hazırlanmış C tüpüne aktarın. Birini karıştırın ve kapağı sıkıca kapatın.

Şimdi C tüpünü, kapağı aşağı bakacak şekilde gen max ilişkilendiriciye yerleştirin ve dokunun stator bölgesinde bulunduğundan emin olun. MCO brain O one programını seçin ve programı çalıştırın. Bu, program bittiğinde ayrışma üzerinde çalıştıracağınız üç programdan ilkidir.

C tüpünü çıkarın ve numuneyi yavaş sürekli dönüş altında 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Maksimum karışım tüpü döndürücüyü kullanarak, cihazın çalışma modu dört RPM'ye karşılık gelir. İlk inkübasyondan sonra, tüpü baş aşağı dissosiyasyona geri koyun ve M beyin O2 programını çalıştırın. Bir sonraki birleşme sırasında, 20 mikrolitre çözelti, üç ila 10 mikrolitre çözelti dört ekleyerek 400 miligram doku başına iki 30 mikrolitre enzim karışımı hazırlayın.

İkinci birleştirici döngü 30 mikrolitrede sona erdiğinde, enzim karışımı, kapağın ortasındaki septum sızdırmaz açıklıktan doğrudan C tüpüne karıştırın. Steriliteyi sağlamak için, karıştırmak için C tüpünü hafifçe ters çevirin ve girdap yapmayın. Daha sonra C tüpünü maksimum karışım tüpü döndürücüsüne geri koyun ve numuneyi dört RPM karıştırma ile 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra CTU, üçüncü ve son kez nazik maksimum dis ilişkilendiriciye geri döndürülür ve M beyin oh üç programı çalıştırılır. Üçüncü program tamamlandığında, C tüplerini döndürücüye koyun ve 37 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin. Şimdi tüpün altındaki hücreleri toplamak için numuneyi kısa bir süre santrifüjleyin.

Artık hücreleri filtrelemeye hazırız. İlgilendiğiniz hücre türünün boyutuna göre bir hücre süzgeci seçin. Toplamak istediğiniz hücreler, kinji hücreleri gibi çap olarak 30 mikrometreden büyükse, gözenek boyutu bu çaptaki hücre gövdelerini geçecek kadar büyük olmalıdır.

Belirgin bir pozitif hücre için 30 mikrometrelik bir filtre işe yarayacaktır. C tüpü kapağındaki septum sızdırmaz açıklıktan geçen 1000 mikrolitrelik pipet uçları kullanarak ayrışmış dokuyu C tüpünden çıkarın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir toplama tüpü üzerine yerleştirilmiş pres ayırma filtresine uygulayın.

Daha büyük numune boyutları için 50 mililitrelik tüp gerekebilir. Hücre süspansiyonunun filtreden geçmesine izin verin. Daha sonra kalsiyum ve magnezyum iyonları ile 10 mililitre HBSS çözeltisi ekleyerek filtreyi yıkayın.

400 miligramdan daha büyük doku miktarlarıyla çalışırken, filtrenin yıkanması için kalsiyum ve magnezyum iyonları içeren 30 mililitreye kadar HBSS kullanın. Şimdi toplama tüpündeki hücreleri, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 Gs'de santrifüjleme ile peletleyin, süpernatı tamamen aspire edin ve hücre peletini tamponunuzda veya tercih ettiğiniz ortamda yeniden süspanse edin. Bu noktada, hücre izolasyonunu ve antikor lekelenmesini bozabileceği için herhangi bir miyelin kalıntısını çıkarmayı seçebilirsiniz.

Miyelin kalıntılarını gidermek için miyelin çıkarma boncukları kullanmanızı öneririz. Aksi takdirde, hücreler daha fazla uygulama için hazırdır. Promidyum iyodür boyamaya dayalı bu nokta grafiği, bu videoda oluşturulan süspansiyon gibi ev fare burkulmasından kaynaklanan tek hücreli bir süspansiyonda bulunan hücrelerin %97'sinin uygulanabilir olduğunu gösterir.

Bu hücreler, maksimum nöro ortamda kültürlendiğinde, B 27 plus ile desteklendiğinde, bu nokta grafiklerinde nöroküreler oluşturabilen nöronal progenitörler elde etmek için belirgin olmayan mikro boncuklar kullanılarak daha da saflaştırılabilir. Süspansiyonların miyelin çıkarma boncukları ile işlenmesinin yararı gözlenmiştir. Nöronal progenitörleri eksprese eden belirgin olanın önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesi, tek hücreli bir süspansiyondan miyelin tükenmesini takiben maksimum ayırma ile elde edilir.

Az önce size geniks ayrışması ve nöral doku ayrışma kitini kullanarak fare beyin dokusundan tek hücre süspansiyonunun nasıl hazırlanacağını gösterdim. Bu prosedürü yaparken, nöral doku ayrışma kiti, T veya P'nin doğru seçimi için tüm solüsyonların uygun şekilde hazırlanması önemlidir. Bu yöntem kullanılarak embriyonik ve D doku kesitleri veya tüm beyin steril koşullar altında zaman kazandıran ve standardize edilmiş bir şekilde işlenebilmektedir.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneyleriniz için iyi şanslar.