Fare Sinir Doku Hücre Tek Cezalar Üretimi

Sinir sistemi içerisinde yüzlerce nöronal glial hücre tipi tanımlanmıştır. Beyin veya spinal korddaki her bir spesifik hücre tipi, kendisinin tanımlanmasını ve karakterize edilmesini sağlayan bir hücre yüzey molekülü veya moleküler belirleyici repertuvarına sahiptir.

Günümüzde, sağlam hücre tanımlama ve ayırma teknolojileri, hücre ölümünü ve karakteristik yüzey proteinlerinin yıkımını aynı anda sınırlarken tek hücre hazırlıklarının oluşturulmasını gerektirmektedir. Gentle max associator, tripsin veya pepsin tabanlı disosiyasyon kitleri ile kombine edildiğinde, hücre kaybını sınırlayıp antijen epitoplarını koruyarak beyin dokusunu etkili ve nazik bir şekilde disosiye edebilir. Oluşturulan tek hücre süspansiyonları, nöral progenitörleri tanımlayan anti-prominin-1 microbeads gibi monoklonal konjugatlar ile işlenebilir veya miyelin uzaklaştırma boncukları kullanılarak daha fazla saflaştırılabilir.

Merhaba, benim adım Sandra PeNAT. Almanya'nın baggage Gabert şehrindeki Mil Biotech'te nörobilim ürünleri proje yöneticisiyim. Bugün size, Genix Dissociator kullanarak fare beyin dokusundan tek hücreli süspansiyonun nasıl hazırlanacağını göstereceğim.

Genix dis associator, çeşitli doku türlerini kapalı ve steril bir ortamda disosiye edebilen bir cihazdır; böylece zahmetli olan manuel mekanik disosiyasyon ihtiyacını ortadan kaldırır. Öyleyse başlayalım. Sonraki uygulamalarda ilgilenilen antijen epitopuna bağlı olarak, ya papain tabanlı nöral doku disosiyasyon kitini ya da tripsin tabanlı nöral doku disosiyasyon kitini kullanın.

Bugünkü deney için, anti prominent one mikroboncuklarını kullanarak belirgin pozitif hücreleri izole etmek istediğimizden neuro tissue dissociation kit P'yi tercih ediyoruz. Prominent one ne pepane'ye ne de tripsine duyarlıdır ve böyle bir durumda neuro tissue dissociation kit P daha iyi bir seçimdir. Protokol başlatılmadan önce, bu kit için gereken reaktifler ve solüsyonlar hazırlanmalıdır.

Kalsiyum ve magnezyum iyonları içermeyen Hank's dengeli tuz çözeltisi (HBSS), kalsiyum ve magnezyum iyonlu HBSS ve beta-mercaptoethanol stoklarınızı hazır bulundurun. Öncelikle çözelti iki, çözelti dört ve ardından enzim karışımı bir'i hazırlayarak başlayın. İlk olarak, çözelti iki'ye nihai konsantrasyonu 0.067 millimolar olacak şekilde beta-mercaptoethanol ekleyin.

Çözelti, dört santigrat derece sıcaklıkta saklandığında bir aya kadar stabil kalır. Ardından, liyofilize tozu ve "solution.Four" etiketli flakonu çözün. Bunun için 0,7 mililitre saklama tamponu kullanarak nazikçe karıştırın ve vortekslemeden.

Şimdi, 1900 µL çözelti iki ve 50 µL çözelti biri bir C tüpüne pipetleyerek enzim karışımı bir'i hazırlayın. Bu miktar, 400 mg dokuyu disosiye etmek için yeterli çözeltidir; dolayısıyla daha fazla doku disosiye edilecekse, ek enzim karışımı bir hazırlayın. Bir C tüpünde maksimum 1600 mg beyin dokusu işlenebilir.

C tüpündeki bir numaralı enzim karışımı daha sonra 37 °C'de 10 ila 15 dakika boyunca inkübe edilir. Disosiyasyona başlamak için tüpe kalsiyum ve magnezyum iyonları içermeyen bir mililitre HBSS pipetleyin. Tüpü bir terazi üzerine yerleştirin, beyin dokusunu ekleyin ve kütlesini kaydedin.

Bu P dört fare beyni yaklaşık 0.2 gram ağırlığındadır. Erişkin bir beyin yaklaşık 0.4 gram ağırlığında olacaktır; 400 miligramın altındaki tüm doku örnekleri için bugün kullanacağımız solüsyon hacimleri yeterlidir.

Dokunuz 400 miligramdan daha ağırsa, tüm reaktif hacimlerini buna göre artırın; tek bir C tüpünde 1600 miligram dokuya kadar işlem yapılabilir. Fare beynini, 1.950 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim içeren hazırlanan C tüpüne aktarın. Karıştırın ve kapağı sıkıca kapatın.

Şimdi C tüpünü, kapağı aşağıya gelecek şekilde gen max associator üzerine yerleştirin ve dokunun stator alanında olduğundan emin olun. MCO brain O one programını seçin ve programı çalıştırın. Bu, disosiasyon sırasında çalıştıracağınız üç programın ilkidir; program sona erdiğinde.

C tüpünü çıkarın ve örneği 37 °C'de, yavaş ve sürekli rotasyon altında 15 dakika inkübe edin. Max mix tüp rotatörü kullanırken, cihazın çalışma modu dört RPM'ye karşılık gelmelidir. İlk inkübasyonun ardından, tüpü tekrar disosyasyon cihazına ters şekilde yerleştirin ve M brain O2 programını çalıştırın. Bir sonraki asosyasyon sırasında, 20 µL çözelti üç ve 10 µL çözelti dört ekleyerek, 400 mg doku başına 30 µL enzim karışımı iki hazırlayın.

İkinci karıştırıcı döngüsü sona erdiğinde, kapağın merkezindeki septumla mühürlenmiş açıklıktan doğrudan C tüpüne 30 µL enzim karışımı iki ekleyin. Sterilitenin sağlanması için C tüpünü nazikçe ters çevirerek karıştırın ve vortekslemeden kaçının. Ardından C tüpünü tekrar max mix tüp rotatoruna yerleştirin ve örneği 37 °C'de, 4 RPM karıştırma ile 10 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından CTU, üçüncü ve son kez gentle max dis associator cihazına yerleştirilir ve M brain oh three programı çalıştırılır. Üçüncü program tamamlandığında, C tüpleri rotatora yerleştirilir ve 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edilir. Şimdi, hücreleri tüpün dibinde toplamak için örneği kısa süreliğine santrifüjleyin.

Şimdi hücreleri filtrelemeye hazırız. İlgilendiğiniz hücre tipinin boyutuna göre bir hücre süzgeci seçin. Toplamak istediğiniz hücreler, kinji hücreleri gibi çapı 30 µm'den büyükse, gözenek boyutu bu çaptaki hücre gövdelerinin geçebileceği kadar büyük olmalıdır.

Belirgin tek pozitif hücreler için 30 µm'lik bir filtre uygun olacaktır. Ayrıştırılmış dokuyu, C tüpü kapağındaki septum sızdırmaz açıklıktan geçebilen 1000 µL'lik pipet uçlarını kullanarak C tüpünden çıkarın. Hücre süspansiyonunu, 15 mL'lik bir toplama tüpü üzerine yerleştirilmiş pres ayırma filtresine uygulayın.

Daha büyük örnek boyutları için 50 mililitrelik tüpler gerekebilir. Hücre süspansiyonunun filtreden geçmesine izin verin. Ardından filtreyi, kalsiyum ve magnezyum iyonları içeren 10 mililitre HBSS çözeltisi ekleyerek yıkayın.

400 miligramdan fazla doku miktarlarıyla çalışırken, filtrenin yıkanması için kalsiyum ve magnezyum iyonları içeren 30 mililitreye kadar HBSS kullanın. Şimdi, hücreleri toplama tüpünde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 Gs'de santrifüj ederek çöktürün, süpernatantı tamamen aspire edin ve hücre peletini tercih ettiğiniz tampon veya ortamda yeniden süspanse edin. Bu aşamada, hücre izolasyonunu ve antikor boyamasını engelleyebileceği için varsa miyelin kalıntılarını uzaklaştırmayı seçebilirsiniz.

Miyelin kalıntılarını uzaklaştırmak için miyelin giderme boncuklarının kullanılmasını öneririz. Aksi takdirde, hücreler ileri uygulamalar için hazırdır. Propidyum iyodür boyamasına dayalı bu nokta grafiği, bu videoda oluşturulan süspansiyona benzer şekilde, ev fare burkulması kaynaklı tek hücreli süspansiyonda bulunan hücrelerin %97'sinin canlı olduğunu göstermektedir.

Bu hücreler, nöronal progenitörler elde etmek için anti-prominin mikroboncukları kullanılarak daha fazla saflaştırılabilir; bunlar, B 27 plus ile desteklenmiş max neuro ortamında kültüre edildiğinde, bu nokta grafiklerinde görüldüğü üzere nörosferler oluşturabilirler. Süspansiyonların miyelin uzaklaştırma boncukları ile işlenmesinin faydası gözlemlenmektedir. Tek hücre süspansiyonundan miyelin tüketimini takiben max ayrıştırma ile, prominin 1 eksprese eden nöronal progenitörlerin anlamlı derecede daha yüksek bir yüzdesi elde edilir.

Genix disosiasyon ve nöral doku disosiasyon kiti kullanarak fare beyin dokusundan tek hücre süspansiyonunun nasıl hazırlanacağını size gösterdim. Bu prosedürü uygularken, seçilen nöral doku disosiasyon kitine (T veya P) uygun tüm çözeltilerin uygun şekilde hazırlanması önemlidir. Lütfen NDK uygulama notuna veya veri sayfasına başvurun. Bu yöntem kullanılarak, embriyonik doku kesitleri veya tüm beyin, steril koşullar altında, zaman tasarrufu sağlayan ve standartlaştırılmış bir şekilde işlenebilir.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.