Name: Çiftleşme ve tetrad Ayırma Chlamydomonas reinhardtii Genetik Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Öğrenin Chlamydomonas reinhardtii'de gametogenez, çiftleşme ve tetrad ayırma yöntemlerini. Bu protokoller genetik analiz için araştırmacılara kolaylık sağlar ve model organizmada kalıtsal çalışmalara olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokol, Institut de biologie fiziko-Chimique, Paris, Fransa&#39;da Francis-André Wollman laboratuvarda öğrenilen teknikleri dayanmaktadır. Yazarların aslında Chlamydomonas genetik teknikleri DBS tanıttı Jacqueline Girard-Bascou, şükran borçluyuz. Yazarların laboratuar Chlamydomonas araştırma, Ulusal Bilim Vakfı ödülü MCB-0646350 tarafından destekleniyor .

Bölüm 1: gametogenezis için suşlarının Hazırlık Not: Tüm manipülasyonlar oda sıcaklığında yapılmalıdır. Yüksek veya düşük sıcaklıklarda Zigot çimlenme hızını etkileyebilir ve canlılığını olumsuz yönde etkileyebilir. Önemli göz: evlendirilmeyecek suşları sağlam büyüyen ve kirlenmesine neden olan mantar veya bakteri olduklarını şarttır. Suşları düzenli olarak devredilmiştir varsa, zengin ortamda geçişi gamet nesil önce gerekir. <ol><li> Evlendirilmeyecek Suşlarının TAP levhalar (100 × 15 mm), plaka başına 1-2 suşları üzerine aktarılır. Hücreler, yaklaşık 1 cm genişlikte konsantre bir şerit büyüdü olmalıdır. </li><li> Sağlam büyüyen hücreleri kalın bir tabaka kadar TAP plakalar üzerinde Kuluçka gerekirse ara transferleri ile devam etmelidir. Düzenli kullanım yabani tip suşlar, bir kaç gün ve hiçbir geçişleri sadece sürebilir ancak son zamanlarda geçişli henüz Suşlarının, bir geçit ve 1 hafta olmak üzere toplam gerekebilir. Işığa duyarlı Mutants ek süre isteyebilir. </li><li> Azot eksikliği vardır ve gametogenezis ikna etmek için başlayacak N10 tabak, TAP plakalar tüm hücreleri aktarın. TAP plaka üzerine kadar kalın bir levha gibi hücrelerin aktarın. Bu hücrelerin daha sonraki toplama kolaylaştıracaktır. N10 3 gün sonra, hücreleri gametogenezis geçmesi hazırlanmıştır. Hücre bölünmesi N10 yavaş olur, ancak hücreleri koyu yeşil kalmalıdır. Canlı zigot elde olmayacak gibi herhangi bir kontamine suşları atılmalıdır. </li></ol> Bölüm 2: Çiftleşme <ol><li> Her suş 50 ml erlen aktarılır ve yaklaşık 2,5 ml steril distile su ile yeniden süspanse. Bu, ya bir tel döngü ya da steril bir sopa kullanarak yapılabilir; neyin önemli olduğunu, hücrelerin yığınlarda iyi askıya değildir bu. Kesin su hacmi göz tarafından ölçülür hücre konsantrasyonu, her bir suş için yaklaşık aynı şekilde ayarlanmalıdır. </li><li> Hücreler 2 saat boyunca kuvvetli ışık altında (1.260 μ E / m 2 / sn) telaşlı, heyecanlı, hareketli gamet hücreleri olacak ve bu süre boyunca. Motilite ışık mikroskobu altında kontrol edilmelidir. Gamet kötü yüzme iseniz, çiftleşme verimsiz olması muhtemeldir. Ancak, kötü hareketli suşlar bile daha düşük bir frekans arkadaşı. </li><li> Sonraki eşit hacimleri mt + ve mt-gamet tek bir 50 ml ölçülü balona birleştirilir. Gamet ajitasyon olmadan güçlü ışık (1.260 μ E / m 2 / sn) altında bırakılır. </li><li> Çiftleşme ışık mikroskobu altında hemen kontrol edilebilir. Gametlerin çiftleri hızla formu ve hızlı hareket eden hücreler kamçı olarak katıldı görünecektir. Çiftleşme son derece hızlı olması belirirse, örnekler zigot bir nesil için 30 dakika -1 saat içinde alınması gerekmektedir. Eğer değilse, bu isteğe bağlı olduğu halde, çiftleşme, her saat başı kontrol edilebilir. Zigot optimal yoğunluk vererek kez haç arasında yaygın olarak değişecektir, 1 saat, 2 saat, 3 saat ve 4 saat sonra gametler, örneğin birleştirerek sonra farklı zamanlarda çiftleşme karışımı hacimde almak en iyisidir. Plaka başına 3-4 noktalar; 300 mcL örnekleri TAP-3% Difco agar 60 × 15 mm plakalar aktararak yapılır. Bu çiftleşme çiftleri bozabilir çiftleşme karışımı karıştırma dikkatli olun. Düşük fiyatlı agars daha az kirletici maddeler ve mikroskop altında zigot görmek için daha kolay olacaktır çünkü Difco agar kullanılır. Kullanılmayan çiftleşme karışımı bir gecede balonuna sol ve çiftleşme tepki kalitesi ertesi gün açık olacak. Çiftleşme verimli, zigot balonun veya duvar dibine uyacaktır ve orta net görünecektir. Hatta balonun ajitasyon zigot çıkarmak için başarısız olacaktır. Hiçbir karışımı makul canlılığı ile çalkalanır cam çubukları, daha sonra çiftleşme verimsiz veya yer almadı. </li><li> Çiftleşme karışımı içeren TAP Difco plakaları, her yüzeyde sıvı emilmiş kadar aralık kapaklı, steril bir kaput kurutulur. Zygospore olgunlaşma sadece karanlıkta gerçekleşecek bu yana plakalar genellikle, daha sonra folyoya sarılı, 18 saat ışık (700 nE / m 2 / sn) bırakılır. Suşları, saat ve tarih çiftleşme plakaları ve folyo hem yazılı, geçti. Zigot çimlenme verimliliği giderek azalır rağmen Tabaklar, 5 ila 7 gün saklanır ve daha uzun tutulabilir. </li></ol> Bölüm 3: tetrad Diseksiyon <ol><li> Vejetatif hücreler bir neşter gibi sıkıcı bir bıçak kullanarak çiftleşme karışımı kuru noktalar, kazınmalı. Bıçak% 3 agar sıkıca sadık olacaktır zigot bir alan ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu adım, genellikle zigot Ertesi sabah çimlenmiş var ki, öğleden sonra yapılır, ama bir ikinci, vejetatif bölünme uğramamış8 döl verimi. Chlamydomonas biyologlar hızla vejetatif hücreler daha büyük ve siyah bir taslak veren kalın bir zygospore duvar özelliği bu yana, mikroskop altında zigot tanımayı öğrenin. Zygospores genellikle sarı görünür ama aynı zamanda biraz yeşil olabilir. Vejetatif hücreler kolayca kenara taşınır en önemli karakteri, agar sopa. Ancak, plakalar halinde aşırı Bu durumda olmayacak kuru. Ayrıca, çiftleşme karışımı çok yoğun ise, zigot bireysel zigot transferi zor veya imkansız hale getirecek bir minder kurabilir. Uygun yoğunlukları adım 2.1 &#39;de kurulan ve tecrübesi ile hızlı bir şekilde öğrenmiş olacak. </li><li> Cam iğneler zigot toplama ve tetrad döl ayıran için hazırlanmıştır. Bu kopmuş olabilir, uzun, ince bir iplik üretmek için küçük bir alev 3 mm cam çubuklar çekerek hazırlanmıştır. Bu sivri uçları ipuçları, kancalar, düşük alev (örneğin alkol ya da yanan bir maç) kısa süreli ısıtma düzeltti veya bükülmüş. Özellikle deneyimsiz kullanıcılar için oldukça kolay kırılabilir, 3 veya daha fazla cam iğneler hazırlayın. </li><li> Zigot küçük bir kazık içine bir bardak iğne kullanılarak% 3 TAP Difco plaka üzerinde toplanmıştır. Zigot içeren agar bir kare (0.5 cm kadar 2) oluşan ve sıkıcı bir neşter kullanılarak eksize edilir. Sonra agar bloğu, 15 mm,% 1.5 TAP-Difco plaka üzerine yüzü aşağı gelecek şekilde yerleştirilir ve zigot dağıtmak için, yaklaşık 1,5 cm plakasının üst yatay bir çizgi boyunca kaydırdı. Üst yatay çizgi, ızgara, yaklaşık 1,5 cm yatay ve 0,5 cm dikey aralık ile plakaların arkasına kazınmış. Grid (ızgara da diseksiyon gün kazınacak) tetrad döl ayırmak için bir kılavuz olarak ertesi gün kullanılacaktır. Son olarak, bireysel zigot plaka başına 20-30 zigot, her bir dikey çizgi ile üst yatay çizgilerin kesişmeleri taşıyın. Disseke sadece 12 ya da olacak her zigot filizlenir değil, ve bazı patlama önce iki kez böleceğiz rağmen, bu kadar ekstra zigot ihtiyaç vardır. </li><li> Dağıtarak sonra yanlışlıkla% 3 agar plaka devredilmiştir zigot ve vejetatif hücreleri kloroform (1-2 mm) ince bir tabaka içeren bir cam tabak üzerinde 30 saniye boyunca ters plaka teşhir ederek öldürdü. Plaka ve kloroform arasındaki mesafe yaklaşık 5 cm olmalıdır. Çok kloroform kullanıldığında ise mesafe çok küçük ya da büyük olup olmadığını, ya da bir riskleri ya zigot öldürme, ya da vejetatif hücreleri öldürerek değil. Zygospores seçiciliği sağlamak için, çimlenme plaka dağıtılmıştır sonra kloroform tedavi hemen yapılmalıdır. </li><li> Çimlenme suşlarının çoğu 16-20 saat sürer, ancak genotip ve zigot yaşı ile değişecektir. Çimlenme için, plakalar düşük ışık (239 nE / m 2 / sn) altında yerleştirilir, ya da orta ışığında bir doku ile plaka kapsayan soluk . </li><li> Çimlendirilmiş zigot, içlerinde kızı hücreleri ile şişmiş ya da bazen patlama hücreler olarak mikroskop altında tespit edilebilir. Zygospore rüptüre değilse çimlenme meydana varsa, bir cam iğne ile hafifçe dokunarak duvarı kıracak. Kızı hücreleri hafifçe zigot altındaki grid noktaları sürüklenebilir. Agar serbest cam iğne basıncı ile sıvı bir ortamda küçük bir miktar hücre yakalama ve iğne arkasında bu &quot;su birikintisi&quot; sürükleyerek bunu kolayıdır. &quot;Sigorta&quot;, tek bir zigot ve iki kez bölünmüş olan bir vejetatif hücre disseke olduğu bir form dışında dört kızı hücreleri, zygospore duvar &quot;deri&quot; olarak kalacaktır. </li><li> Sonraki analiz için görünür clonies alınabilir kadar disseke döl uygun koşullar altında yetiştiriliyor. Tabaklar kirlenme günlük olarak takip edilmelidir. </li></ol> Not: vejetatif diploitler nesil burada ele, ama aslında her iki ebeveyn suşu büyümeyi desteklemek orta çiftleşme karışım kaplama içerir, ancak büyüme diploid (örneğin iki farklı auxotropic belirteçleri) destek verecek değildir. Tabaklar, zigot oluşumunu önlemek için ışık tutulur.

<ol><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Genetik analiz Chlamydomonas basit, ama özellikle teknikleri gamet ve ayrı tetrad döl oluşturmak için gereklidir. Sağlıklı soylarının teknikleri kolayca elde edilir. Bazı mutant suşları ile bir sanat daha fazla olur ve okuyucular, tarihsel notlar ve pratik ipuçları yakın zamanda yayınlanan Chlamydomonas Kaynak Kitabı, Cilt 1 bakmalıdır. Ayrıca, bu temel tema çok varyasyon Zigot dağıtım ve diseksiyon desen, indükleyici gametogenezis yöntemi arasında değişen, yukarıda açıklanan olduğunu belirtmek gerekir...

<table><tbody><tr><td>CC-125</td><td>Çiftleşme tipi &lt;em&gt;plus&lt;/em&gt; suşu</td><td>Chlamydomonas Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CC-124</td><td>Çiftleşme tipi &lt;em&gt;minus&lt;/em&gt; suşu</td><td>Chlamydomonas Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Asetat-Fosfat (TAP)</td><td>Büyüme besiyeri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N10</td><td>Büyüme besiyeri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Difco agar</td><td>Reaktif</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Paslanmaz Çelik Bıçaklar</td><td>Araçlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5B</td><td></td></tr><tr><td>BD Cerrahi Bıçak Sapları</td><td>Araçlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-914-5</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Metal Skalpel</td><td>Araçlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-920A</td><td></td></tr></tbody></table>

Çiftleşme ve tetrad ayırma chlamydomonas reinhardtii genetik analiz

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Tek hücreli yeşil alg<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;), Basit bir yaşam döngüsü nedeniyle, hücre biyolojisi ve genetik çeşitli alanlarda araştırma için popüler bir organizma haline gelmiştir, genetik analiz, genomik kaynakları ve çekirdeğinde, transformability ve her iki organelleri büyüme ve manipülasyon kolaylığı. Çiftleşme suşlarının genetik yaklaşımlar kullanıldığında yaygın bir uygulamadır<em&gt; Chlamydomonass</em&gt; Hâkimiyet analizi için vejetatif diploitler oluşturmak ya da tespit nükleer vs organel miras tetrad diseksiyonu aşağıdaki allelism test etmek, epistasy analiz etmek veya harita tabanlı klonlama amaçlı nüfus oluşturmak için. Ayrıca, genetik haçlar rutin organel genotipleri özellikle nükleer genotipleri ile birleştirmek için kullanılır. Burada gametogenezis, çiftleşme, zigot çimlenme ve tetrad ayrılması için standart yöntemler göstermektedir. Bu protokol daha az aşina olan bilim adamları genetik yaklaşımlar müsait hale getirecek adımların takip edilmesi kolay bir serisi<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. Temel parametreleri ve sorunlu noktalar açıklanmıştır. Son olarak, daha fazla bilgi ve alternatif yöntemleri için kaynaklar sağlanmaktadır.

Çiftleşme ve tetrad ayrılması genetik analiz için gerekli olan<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. Burada gametogenezis, çiftleşme, zigot çimlenme ve tetrad diseksiyon için standart yöntemler göstermektedir. Bu protokol daha az aşina olan bilim adamları genetik yaklaşımlar müsait hale getirecek adımların takip edilmesi kolay bir serisi<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

Çiftleşme ve tetrad Ayırma Chlamydomonas reinhardtii Genetik Analiz

Tek hücreli yeşil alg *Chlamydomonas reinhardtii* (*Chlamydomonas*), hücre biyolojisinin çeşitli alanlarında ve ... araştırmaları için popüler bir organizma haline gelmiştir.

Chlamydomonas, ideal büyüme koşulları altında eşeysiz olarak bölünen tek hücreli yeşil bir algdir. Koşullar kötüleştiğinde, organizma eşeyli üreme döngüsüne girer. Gametogenez, suşların TAP agar ortamından azot bakımından fakir ortama aktarılmasıyla indüklenebilir; ardından 10^6 hücre yeniden süspande edilir ve modal MT artı ve MT eksi gametler oluşturmak için güçlü ışık altında ajite edilir. Bu gametler daha sonra çiftleşme için tek bir flaskta birleştirilir; örnekler TAP agar plağına damlatılır ve ışığa maruz bırakılır, ardından zigotların olgunlaşması için folyoya sarılır.Beş ila yedi gün sonra, zigotlar açığa çıkarılarak ve burguya sıkıca tutunmuş durumdayken vejetatif hücreler kazınır. Bunlar, çimlendirme için TAP DCO plaklarına aktarılır. Ardından, düşük ışık altında tetratlar ayrılır ve uygun koşullarda büyütülür.Görünür klonlar ortaya çıkana kadar, bunlar sonraki analizler için seçilebilir. Merhaba, ben Boy Thompson Bitki Araştırmaları Enstitüsü başkanı David Stern. Bugün size model yeşil alg olan Chlamydomonas reinhardtii için çiftleşme ve tetra diseksiyon prosedürlerini göstereceğiz.Birçok laboratuvar; dominans analizleri yapmak veya çekirdek kalıtımı ile organel kalıtımı

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Tarif edilen karşılaştırmalı nicel proteomik yaklaşım, farklı koşullar altında multiprotein komplekslerinin bileşimi içine bir bakış açısı elde etmeyi amaçlamaktadır ve genetik olarak farklı suşların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Kantitatif analiz için bir sükroz yoğunluk gradyanı farklı fraksiyonların eşit hacimleri kütle spektrometresi ile analiz edilir ve karıştırılır.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

Tetradların Barkod Etkin Sıralama (BEST), izole bozan ve tetradların aralanması manuel süreçleri değiştirir. İYİ, agar plakaları üzerine sıralama floresan-aktive edilmiş hücre tarafından iki baştan izole cam boncuklar ile çalkalama ile sporlar ayırır ve rasgele dizilmiş koloniler moleküler barkod ile aynı orijinal tetrat türetildi belirler.

İYİ: tetradların Barkod Etkin Sıralama

Sıcaklığa duyarlı (ts) ölümcül mutantlar, temel işlevleri tanımlamak ve analiz etmek için değerli araçlardır. Burada, yüksek verimde ölümcül mutantları üretme ve sınıflandırma yöntemlerini açıklıyoruz.

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Arındırmak ve centrioles farklı yönelimleri Süper çözünürlük mikroskobu ve tek-parçacık ortalama için mükellef içinde çok sayıda resim için bir strateji geliştirdik.

Yalıtım ve floresan görüntüleme Chlamydomonas Centrioles tek-parçacık yeniden inşası için

Çoklu biyomoleküllerin sistem çapında analiz biyolojik süreçlere işlevsel ve mekanik anlayışlar elde etmek için çok önemlidir. Bu konuda geniş bir protokol, senkronize Chlamydomonas kültüründen toplanan tek bir örnekten lipidler, metabolitler, proteinler ve nişasta yüksek verimlilik ekstraksiyonu için tanımlanmıştır.

Yeşil Alga Chlamydomonas reinhardtii eşitlenmiş kültürlerin derinlemesine analizi için Multi-Omics ekstraksiyon yöntemi

Hareketli hücrelerin in vitro reaktivasyonu, hücre hareketliliğinin mekanizmalarını anlamada çok önemli bir deneydir. Protokol, kirpikler / flagella'yı incelemek için bir model organizma olan Chlamydomonas reinhardtii'nin demembrane edilmiş hücre modellerinin yeniden aktive edilmesini açıklar.

Chlamydomonas reinhardtii'de Demembrane Hücre Modellerinin Reaktivasyonu

Çoğu yüzme fotoototrofik organizması, foto-kaynaklı davranış değişiklikleri (fotodavranış) gösterir. Mevcut protokol, Chlamydomonas reinhardtii model organizmasında söz konusu fotodavranışı gözlemlemektedir.

Chlamydomonas reinhardtii'de Fotodavranışın Gözlemlenmesi

Öğrenin Chlamydomonas reinhardtii'de gametogenez, çiftleşme ve tetrad ayırma yöntemlerini. Bu protokoller genetik analiz için araştırmacılara kolaylık sağlar ve model organizmada kalıtsal çalışmalara olanak tanır.

Çiftleşme ve tetrad Ayırma Chlamydomonas reinhardtii Genetik Analiz

Daha fazla video keşfet