Name: İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin, insülin üretimini geri kazandıran pankreas adacık izolasyonu ve saflaştırma yöntemini. Bu otomatik teknik, diyabet tedavisinde yüksek kaliteli adacıklar elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Adacık Hücre Kaynak Merkezi NIH hibe (RFA-RR 05-003), Christopher Vakfı Efroymson Vakfı ve Tellabs Vakfı olarak, Chicago Illinois Üniversitesi kurucu olarak tarafından desteklenen.

1. Adacık saflaştırılması <ol><li> Adacık arıtma işlemi başlatmak için, COBE çanta yüklemek yeşil tüp hariç tüm tüpler kelepçe ve 0 1.500 için hızını ayarlamak ve süper. </li><li> Kaputun pompa ve degrade bardak kurma ve toplama boru yeşil tüpüne bağlamak. </li><li> : &quot;Spin&quot; sonra ön behere 110 ml Ficoll 1.100 itin ve COBE çanta yüklemek için pompa start Şimdi Ficoll 1.100 yükleme başlayabilirsiniz. Ficoll yüklü olduğundan, süper dışarı basın durdurmak pompa, pompa kafası çözülme ve 100 süper çıkış hızını ayarlamak. </li><li> Ficoll beher ulaşır ve boru, pompa başında yeniden-klemp tüm hava dışarı atılır. 3.000 spin hız ve süper çıkış hızı 0 olarak ayarlayın. </li><li> Şimdi ön behere ağır degrade dökerek gradyanlar yüklemek için hazırlar. Hafif herhangi bir havayı çıkarmak için iki bardak arasındaki kelepçe bırakın. Sonra ışık degrade arka behere dökün. </li><li> Manyetik karıştırıcı açın, COBE makine &quot;spin&quot; tuşuna basın, iki bardak bağlayan tüp kelepçe kaldırmak ve görsel olarak, ağır ve hafif gradyanlar karıştırma olduğundan emin olun. </li><li> Gradyanlar karıştırma başladıktan sonra, santrifüj açmak. Bir dakika bekleyin ve sonra karıştırma gradyanlar yüklemek için pompa açın. </li><li> Doku degrade ön beher düşük çalıştırmak yük, ancak hava yükleme tüp girmek için yetecek kadar düşük, daha sonra bardak bağlayan tüp reclamp ve doku yüklemek için. </li><li> Dokusunun geri kalanını eklemeye devam edin. Daha sonra 50 ml yıkama solüsyonu ile doku düzenlenen tüp yıkama ve ön beher yıkamak için kullanın. </li><li> Doku son çanta girerken, aynı anda, pompa durdurmak pompa başındaki çözülme ve yastığının üzerine boru kelepçe. 5 dakika santrifüj devam edin. </li><li> Santrifüj devam ederken, kaput için 12 toplama tüpleri getirmek ve onların kapakları gevşetin. Sarı tüp toplama boru takın ve steril toplama ucu konik tüp 1 içine yerleştirin. Sonra sarı tüp çözülme ve yeşil tüp kelepçe. </li><li> Spin sona erdiğinde, yavaş yavaş 100 Superout yükseltmek. 1 tüp 150 ml toplayın. Sonra (200-230 ml) 30 ml tüpler 2-12 toplamak. </li><li> Koleksiyonu tamamlamak, COBE &quot;DUR&quot; itin. Şimdi bu arıtma sona erdi, adacıklar değerlendirilmeli ve kültür olabilir. </li></ol> 2. Örnekleme ve kültür <ol><li> Saflaştırılmış adacıklar kesirler topladıktan sonra, her biri 12 toplama tüpleri bir örnek çıkarın ve Dithizone ile leke. Boyama katmanları düşük saflık adacıklar yüksek saflıkta adacıklar vs katmanları içeren gösterecektir. </li><li> Yüksek ve düşük saflıkta doku ve havuz her bir araya toplayın. </li><li> Spin ve iki kez yıkayın. Final Yıkama medya ile ikinci yıkamadan sonra, her birinin hacmi 250 ml getirmek. </li><li> Değerlendirmek için toplanmış fraksiyonları düşük havuzlanmış kesirler ve bir 1 ml örnek yüksek iki 1 ml örnek alarak başlar. Her 1 ml örnek 9 ml yıkama solüsyonu içeren konik bir tüp içine aktarın. </li><li> Daha sonra, her 15 ml tüp sayma çanak 1 ml transfer. Hücrelerin mikroskop altında incelemek ve saymak. </li><li> (Ondalık adacıklar toplam EIN / saflık) / (şişesi ortalama 30.000 EIN): hücreler, kültür, aşağıdaki formül kullanılarak adacıklar için gerekli şişe sayısını hesaplamak sayımından sonra. Örneğin, 100.000 adacıklar% 90 saflıkta 4 şişeler kültür. </li><li> 37 T175 matara ve kültür adacıkları transfer ˚ C ve% 5 CO 2 inkübatör. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

Insan adacık izolasyon teknikleri konusunda önemli gelişmeler olmasına rağmen, adacık verimi son derece değişken ve öngörülemez kalır. Arıtma sindirilir pankreas dokusu nakli başarılı enzimatik sindirim sonra yeterli bir isle kütlesi kurtarmak için çok önemlidir. Bu yöntemi kullanarak, son derece saf bir insan adacıklar üstün bir kurtarma gösterildi, çünkü UIC arıtma yöntemi tavsiye edilir. Ayrıca, 50 ml kadar sindirilmiş doku böylece insan adacıklar iskemi ile ilişkili yaralanma izolasyon kullanılan toplam süre kısalta...

<table><tbody><tr><td>Santrifüj</td><td>ekipman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Cobe 2991 Hücre İşlemcisi</td><td>ekipman</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>adacık saflaştırma</td></tr><tr><td>MZ6 İnverted Mikroskopi TLBD4.1</td><td>ekipman</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Izgaralı Hücre Kültür Kabı</td><td>ekipman</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>adacık sayımı</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>ekipman</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>COBE torbası</td><td>tek kullanımlık ekipman</td><td>O.R. Solution</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>T175 kültür flaskı</td><td>tek kullanımlık ekipman</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>University of Wisconcin (UW) solüsyonu</td><td>reaktif</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Tamponlu Tuz Solüsyonu (HBSS)</td><td>reaktif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>reaktif</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>M199 besiyeri (yıkama solüsyonu)</td><td>reaktif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Final yıkama/Kültür Besiyeri</td><td>reaktif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyon</td><td>reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan pankreas adacık İzolasyonu: bölüm ii: İnsan islets saflaştırılması ve kültür

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Tip 1 diyabet Yönetimi, yıl içinde 100 milyar dolar maliyet, hem birey ve toplum, külfetli. Glikoz izleme ve yeni insülin formülasyonları yaygın kullanımına rağmen birçok kişi hala yıkıcı ikincil komplikasyonlar gelişir. Pankreas adacık nakli, diyabetik hastalarda normal glukoz kontrolü yakın geri yükleyebilirsiniz<sup&gt; 1</sup&gt;, Yoğun insülin tedavisi ile ilişkili ciddi hipoglisemik atakların riski olmadan. Başarılı adacık nakli için yeterli adacık kitle sağlanması önemlidir. Ancak, donör özellikleri, organ temini ve korunması izolasyon sonucunu etkileyebilecek<sup&gt; 2</sup&gt;. University of Illinois at Chicago (UIC), gelişmiş bir arıtma degrade ile başarılı bir izolasyon protokolü geliştirdi<sup&gt; 3</sup&gt;. Bu program, 2004 yılı Ocak ayında başlayan ve 300&#39;den fazla izolasyonların Kasım 2008&#39;de yapıldı. Pancreata (UW, Wisconsin veya HTK Üniversitesi, Histidin-Triptofan Ketoglutarate), soğuk muhafaza çözümleri gönderildi<sup&gt; 4-7</sup&gt; Hücre İzolasyonu Laboratuvar adacık izolasyonu için UIC. Pankreas adacık Ricordi tarafından tanımlanan yöntem değiştirilmiş bir versiyonu olan UIC yöntemi ile izole edildi<em&gt; Ve ark.</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Olarak Bölüm: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon, insan pankreas, kesilmiş delikli, perfüze ve sindirilmiş oldu. Toplama ve UW çözüm inkübasyon en az 30 dakika sonra, arıtma için doku hücre ayırıcı (2991 COBE, COBE, Lakewood, CO) yüklenmiş<sup&gt; 3</sup&gt;. Ardından arıtma, adacık verim (adacık benzerleri, iEQ olarak ifade), doku hacmi ve saflık standart yöntemlere göre belirlenir.<sup&gt; 9</sup&gt;. İzole adacıklar CMRL-1066,% 1.5 insan albümini,% 0.1 &#39;lik insülin transferrine selenyum (ITS) Siprofloksasin, 5 ml 1M Hepes, 1 ml ile desteklenen medya (Mediatech, Herndon, VA), ve 14.5 ml kültüre edildi T175 şişeler 7.5% Sodyum Bikarbonat, 37 ° C gecede kültür adacıkları nakledilen veya araştırma için kullanılan önce.

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu (Bölüm II: insan adacıklar arıtma ve kültür) için prosedürleri değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanarak.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Tip 1 diyabet yönetimi, hem birey hem de toplum için yük oluşturmakta ve yıllık 100 milyar doların üzerinde maliyete yol açmaktadır. ... yaygın kullanımına rağmen

Bu videoda, daha önce izole edilmiş ve sindirilmiş pankreas dokusu, nihayetinde transplantasyona kadar doku kültürü flasklarında kültüre edilebilen saflaştırılmış bir pankreatik adacık fraksiyonu elde etmek amacıyla fial gradyan saflaştırmasına tabi tutulmaktadır. Merhaba, ben University of Illinois at Chicago Cerrahı Bölümü'ndeki Human Eyelets Program Laboratuvarı'ndan American Chief. Merhaba, benim adım Barbara Barbero, ben de Human Eyelet Program'dayım.Bugün size insan pankreas adacıklarının izolasyonuyla ilgili bir prosedür göstereceğiz. Klinik kullanım için yüksek kaliteli insan adacıkları elde etmek amacıyla tesisimizde bu prosedürü uyguluyoruz. Hadi başlayalım.Kuşgözü (eyelet) saflaştırma prosedürüne başlamak için COBE torbasını yükleyin, yeşil olan dışındaki tüm tüpleri sıkıştırın ve davlumbazda hızı 1500'e, "super out" değerini ise sıfıra ayarlayın. Pompayı ve gradyan beherlerini hazırlayın ve toplama tüplerini yeşil tüpe bağlayın. Artık FI yüklemesi başlayabilir, döndürme (spin) düğmesine basın.Ardından, ön behere 110 mililitre fi ekleyin. COBE torbasını doldurmak için pompayı çalıştırın. FI çağrısı yüklenirken, super out düğmesine basın.Pompayı durdurun, pompa başlığında

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu için prosedürler: değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanılarak (bölüm I sindirim ve pankreas dokusu toplanması).

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

Araştırma için tip 2 diyabetik adacık kaynağı yetersiz. Burada kısmi pankreatektomi geçiren hastalardan izole adacıklar için protokol paylaşın. Bu yaklaşım, tip 2 diyabetik adacıklar elde etmek için eşsiz bir mekan temsil eder ve temel ve klinik çalışmalar için yeterli sayıda non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu.

Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu

Langerhans Adacıkları olarak da adlandırılan pankreas adacıkları, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik işlevler için hormonlar üreten bir endokrin hücre kümesidir. Bu protokol, ekzokrin pankreas dokusunu sindirmek için önce Ampulla of Vater yoluyla kollajenaz perfüze ederek pankreas adacıklarını izole etmek için bir yöntemi ve adacıkları farelerden saflaştırmak için basitleştirilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüjünü açıklar.

Kollajenaz Perfüzyonu ile Pankreas Adacıkları İzolasyonu: Pankreas Adacığı Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzimatik Bir Yöntem

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Burada, paralel sirkadiyen biyolüminesansı ve insan adacık hücrelerinin ve birincil miyotüplerin salgı aktivitesini izlemek için ayarları açıklıyoruz. Bunun için, bir lusiferaz çekirdek saat raportörünün lentiviral gen iletimini, ardından in vitro senkronizasyonu ve sürekli hücre perifüzyonu ile çıkış ortamının toplanmasını kullandık.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Burada, bir damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisini kullanarak izole insan pankreatik izletden tek hücrelerin yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Bu protokol, adacık izolasyonu ve saflaştırılması için bir domuz pankreasının satın alınması için adım adım bir kılavuz sağlar.

Adacık izolasyonu için domuz pankreasının cerrahi perfüzyonu ve izolasyonu

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Öğrenin, insülin üretimini geri kazandıran pankreas adacık izolasyonu ve saflaştırma yöntemini. Bu otomatik teknik, diyabet tedavisinde yüksek kaliteli adacıklar elde etmeyi sağlar.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Daha fazla video keşfet