In vivo Ca ^{2 +} - Bal Arısı Koku Öğrenme sırasında Mantar Vücut Nöronlar Görüntüleme

Arılar iştahlı bir koku alma öğrenme paradigması (PER-condition) klimalı olabilir. Uyaranlara gibi kokular kullanarak, aynı anda Kalsiyum Görüntüleme koku uyarılmış mantar vücut nöron aktivitesini ölçmek için kullanılır kaydedilir hangi davranış bir yöntem kurdu

Bu prosedür, arının bir kayıt odasına sabitlenmesiyle başlar. Beyindeki seçilen yapıları boyamak için kafa kapsülünden bir parça kütikül çıkarılır. Lekeli nöronlardaki kalsiyum sinyalleri, geniş alan görüntüleme kurulumu kullanılarak in vivo olarak kaydedilir.

Görüntüleme sırasında, arı antene kokular veya sakaroz iletimi ile uyarılabilir. Bu şekilde, arı bir kokuya tepki olarak hortumu uzatmaya şartlandırılabilir. Hortum ekstansiyon yanıtı, M 17 kasından alınan elektromiyogram kayıtları kullanılarak izlenir.

Görüntüleme deneyinden sonra, konfokal bir mikroskop kullanılarak lekeli yapıların daha yakından incelenmesi için beyin disseke edilir. Merhaba, ben rdo Mansel'in Laboratuvarı'ndan Melanie. Merhaba, ben de Mansel Lab'den Anya.

Bugün size in vivo kalsiyum görüntüleme ve bal arısı mantarı gövdesi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, bal arısı beynindeki koku alma kodlamasını incelemek ve ilgili plastisiteyi öğrenmek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Kovan girişinde bir bal arısı toplayıcısı yakalayarak başlayın ve ardından buz üzerinde soğutarak hareketsiz hale getirin. Ardından, arıyı bir pleksiglas kayıt odasına monte edin. Gözleri ve göğüs kafesini duvara sabitlemek için düşük erime noktalı sert balmumu kullanın.

Hepsi 10 mikronluk bir çap elde etmek için uçta bir cam kılcal damarı kırar. Kılcal damarın ucunu 10'a bir oranında URA, iki dekstrin ve sabitlenebilir Rodin dekstrin karışımından oluşan d macunu ile örtün. Hazırlanan kılcal damar boyama için kullanılacaktır.

Boyama işlemine başlamak için önce anteni bir koane ile hareketsiz hale getirin. Bir parça kütikül çıkararak ve bezleri ve trakeayı yanlara doğru iterek beynin üzerindeki kafa kapsülünü açın ve mantar gövdesine erişim sağlayın. Kafa kapsülünün içindeki hemo lenfleri emmek için bir parça kağıt kullanın.

Mantar vücut nöronlarını boyamak için, kılcal damarı nöronların soma veya dendritik bölgesine enjekte edin. Ardından kütikül parçasını kafa kapsülüne geri takın ve anteni gevşetin. Son olarak, arıyı %30 sükroz solüsyonu ile besleyin ve ıslak bir mutfak havlusu ile kaplı strafor bir kutuda en az dört saat veya gece boyunca 20 santigrat derecede saklayın.

B hazırlığı tamamlandıktan sonra in vivo görüntülemeye başlayabiliriz. Başlamak için, arının hareket etmesini önlemek için kayıt odasına bağlı bir sünger kullanın ve karnına doğru bastırın. Şimdi yemek borusunun pompalanması nedeniyle beynin hareket etmesini önlemek için arının antenlerini bir iyoan ile sabitleyin.

Labrumun üzerindeki kütiküle küçük bir kesi kesin ve yemek borusunu ve çevresindeki katı yapıları dikkatlice dışarı çekin ve bunları iki bileşenli silikonla kaplayın. Daha sonra, labiumun iletki kasından elektrogramları kaydetmek için kullanılan tel elektrotların yerleştirilmesi için delikler açmak için bir iğne kullanın. Kütikül parçasını, trakeayı ve beynin üzerindeki bezleri çıkarın.

M 17'den elektrogramları kaydetmek için kafa kapsülünün içindeki hemoyu emmek için bir parça kağıt kullanın. Ağız kısımlarına yakın kas içine bakır bir tel enjekte edin. Göze bir toprak elektrodu enjekte edin.

Şimdi kafa kapsülünü iki bileşenli silikonla doldurun. Beynin tamamen kaplandığından emin olun. Arıyı mikroskop tablasına yerleştirin ve silikonun yüzeyine bir damla su damlatın.

Mikroskobun daldırma objektifini damlacığa daldırın ve ardından aşama nöronlarına odaklanın. İn vivo görüntüleme hazırlığı tamamlandıktan sonra, artık koku stimülasyonunu ve sinyal kaydını tanımlayabiliriz. Arıya koku uyaranları iletmek için, koku maddelerini sabit bir hava akımına seyreltmek için bilgisayar kontrollü özel yapım bir olfaktometre kullanıyoruz.

Antene yönlendirilen koku stimülasyonu, üç saniyelik bir koku darbesi olan doymuş havadan oluşur. Kalsiyum görüntüleme için, görüntüleri oda sıcaklığında beş hertz örnekleme hızıyla kaydetmek için bir zes floresan mikroskobuna monte edilmiş bir til fotonik görüntüleme kurulumu kullanıyoruz. Kalsiyum sinyalleri, Ango CCD kameralı bir X 60 0,9 W Olympus daldırma Objektifi aracılığıyla kaydedilir, her ölçüm 10 saniye sürer.

Kas potansiyelleri bir çim amplifikatörü ile yükseltilir ve bir analog dijital dönüştürücü ile kaydedilir ve sayısallaştırılır. M 17'den alınan kayıtlar, sinyal kaydı tamamlandıktan sonra öğrenmeyle ilgili davranışsal tepkileri izlemek için kullanılır, şimdi morfolojik analiz ve yeniden yapılandırmaya geçebiliriz. Çünkü dolgu sırasında kullanılan her iki boya da aynı molekül ağırlığına sahiptir.

Nöronlarda birlikte bulunurlar. Geniş alan görüntülemenin sınırlı uzamsal çözünürlüğü vardır, bu nedenle lekeli yapıları araştırmak için konfokal tarama mikroskobu kullanıyoruz. Deneyden sonra, önce beyni inceleyin ve ertesi gün dört santigrat derecede% 4 formaldehit içinde gece boyunca sabitleyin, PBS'de durulayın ve daha sonra etanol adımlarında 10 dakika% 50% 90% 99 ve iki kez 10 dakika% 100'de kurutun Beyni bir damla metil salisilat kapağı ile yivli bir nesne slaytına yerleştirin, kaydırın ve ardından konfokal taramalı mikroskobun mikroskop aşamasına yerleştirin.

Beyni bir hava objektifi lensi ve dört mikrometre optik bölümde 1.1 ila 1.2 dijital yakınlaştırma ile tarayın. Burada, mantar gövdesi dış nöronlarının, 60 x objektif aracılığıyla kaydedilen ve yanlış renklerde görselleştirilen antenlerin koku uyarımına verdiği tepkiyi görüyoruz. Soldaki kırmızı kare, koku uyaranının kalıcılığını temsil eder.

Deneyden sonra beyin diseke edilir ve leke yapıları 20 x büyütmede konfokal mikroskop kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenir. Bu yüzden, Koku alma öğrenimi sırasında bal arısındaki mantar vücut nöronlarını nasıl görüntüleyeceğinizi size gösterdik. Bu prosedürü yaparken, ışığa duyarlı boyaları içeren deneylerin karanlıkta yapılması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar. Hoşça kal.