Name: In vivo Ca 2 + - Bal Arısı Koku Öğrenme sırasında Mantar Vücut Nöronlar Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Keşfedin bal arılarında koku öğrenmesi sırasında mantar vücut nöronlarının kalsiyum görüntüleme yöntemiyle canlı aktivitesini. Bu teknik davranışsal nörobilim araştırmalarında sinirsel mekanizmaları anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma DFG tarafından finanse edilmektedir.

Arı Hazırlık ve Geri dolgu <ol><li> Immobilizasyon için buz üzerinde kovanı ve soğuk bal arısı yem yakalayın. </li><li> Pleksiglas odaları 3 kayıt Dağı. Gözleri ve göğüs düşük erime noktası sabit balmumu ile kayıt odasının duvarları sabitleyin. </li><li> Elektrofizyoloji için yaygın olarak kullanılan cam kılcal damarların çekin ve yaklaşık bir ucu çapını elde etmek için ucunda kırmak. 10μm. Kapak boya macun ile kılcal ucu. Boya yapıştırın Fura-2 dekstran ve lizin tamir edilebilir tetramethylrhodamine dekstran 10:01 karışımından oluşur. </li><li> Boyama işlemi için önemsiz ayrıntılar veya n-eicosane antenler hareketsiz. Beyin yukarıda manikür bir parça çıkarın ve mantar vücut erişimine izin vermek yan bezleri ve trakea itin. </li><li> Soma veya mantar vücut nöronların aksonal bölge içine kılcal damarların enjekte edilir. Bu serbest elle yapılan veya mikro manipülatör kullanarak olabilir. Sonra baş kapsül kütikula parça geri ve antenler gevşetin. </li><li> % 30 sukroz solüsyonu ile arılar Yem nemlendirilmiş bir durumda onları en az dört saat süreyle saklamadan önce ya da gece boyunca 20 ° C </li></ol> In vivo Görüntüleme <ol><li> Karın karşı bastırdı ve kayıt odasına bir klip veya bant ile sabit küçük bir parça sünger ile arı, örneğin hareketleri engelleyin. </li><li> Labrum yukarıdaki manikür, yemek borusu pompa kaynaklanan beyin hareketi önlemek için, içine küçük bir kesi kesme ve yemek borusu dikkatlice dışarı çekin ve çevresindeki sağlam yapılar, yemek borusuna 4 zarar vermeden gerilim altında koymak. Iki bileşenli silikon ile kaplayın. </li><li> Bir iğne ile delik açın ve M17 kayıt için tel elektrotlar eklemek. </li><li> Kütikula parça, trakea ve beyin üzerinde bezleri çıkarın. Bir kağıt parçası ile baş kapsül içinde heamolymph Suck. </li><li> Iki bileşenli silikon ile baş kapsül doldurun. Beyin üstünün tamamen kapalı olduğundan çok önemlidir. </li><li> Mikroskop sahne arı ve damlacık içine mikroskop daldırma amacı batırmayın silikon yüzey üzerinde bir damla su yerleştirin. Lekeli nöronlar odaklanın. </li></ol> Koku uyarılması ve kayıt sinyallerin Olfactometer: Biz bir bilgisayar kontrollü, özel olarak inşa stimülasyon cihazı veya Galizia ve Vetter 3 tarafından daha önce açıklandığı gibi &quot;olfactometer&quot; kullanın. Kokular antenler yönelik sürekli bir hava akışı içine seyreltilir. Herhangi bir uyaran bir 3s koku darbe 0.2ml koku doymuş hava oluşur. Stimülasyon protokolü kayıt yazılımı TILLVision ayarlanabilir. Mikroskop ve Görüntüleme set-up: Biz Zeiss bir floresan mikroskop kullanıyoruz. Görüntüler 25 ° C mikroskop üzerine monte edilmiş bir KADAR-Fotonik görüntüleme cihazı kullanarak 5 Hz&#39;lik bir örnekleme hızı ile kaydedilir. Kalsiyum sinyalleri bir X60, 0.9 W Olympus Imago CCD kamera (640x480 piksel, 160x120 piksel çip üzerinde binned 4X) daldırma amacı ile kayıt altına alınmaktadır. Fura-2 monokromatik 340 oranlı metrik ölçümleri için ışık ve 380nm dalga boyu ile heyecanlı. Floresan 410 dikroik ayna ve 440nm uzun geçiren filtre ile tespit edilir. Kayıt yazılımı kayıt için parametreler ayarlanır. Her ölçüm iki dalga boylarında ve pozlama süresi 10s her hazırlık boyama yoğunluğu ayarlanabilir sürer. M17 kayıt: labium (M17) iletki kas öğrenme ile ilgili davranışsal tepkilerin izlemek için ekstraselüler kaydedilir BAŞINA 5, 6, yani. Bakır tel ağız parçaları yakın kas içine enjekte edilir. Toprak elektrot göz içine enjekte edilir. Kas potansiyelleri, özel bir yapı pre-amplifikatörü ile amplifiye sayısallaştırılmış ve bir bilgisayarda depolanır. Stimulus başlangıçlı olfactometer tarafından tetiklenir. Veri Analizi <ol><li> Deney sırasında bir bilgisayar içine kalsiyum sinyal kayıtları beslenir ve saklanır. Kayıt yazılımı TILLVision dalga boylarında (340nm/380nm) ve deltaF (bazal çıkarma) hesaplanması arasındaki oranın hesaplanması gibi, sinyallerin bir ilk denetim sağlar. </li><li> Görüntü işleme IDL özel yazılmış programlar ile yapılır. Ca 2 + 340nm gelen sinyalleri ve her piksel için 380nm ölçüm oranını hesaplayın. Uyaran önce kare ortalama eşiğe (F) belirlemek ve oranlı metrik sinyali (deltaF) çıkarmak. </li><li> Faiz (ROI) Bölge tanımlamak için: uyaran sırasında kare ortalama ve bir alçak geçiren filtre (3X3px) uygulamak hesaplayın. Yanlış renk skalası gri ölçekli dönüştürün. Sahte renkli görüntüler faaliyet lekeler olarak nöronal yapılardaki aktiviteyi belirleyin ve yatırım getirisi olarak tanımlamak. </li><li> Herhangi bir filtreleme veya düzeltme olmadan tüm kareleri üzerinde yatırım getirisi piksellerin ortalamasını alarak aktif olan bölgelerin geçici dinamikleri hesaplayın. </li></ol> Fura-2 dekstran ile birlikte biz tamir edilebilir boya rodamin dekstran (&quot;mini yakut&quot;) ile nöronların doldurun. Her iki boyalar aynı moleküler ağırlığa sahip nöronlar birlikte yer almalıdır. Geniş açılı görüntüleme, sadece çok sınırlı uzaysal çözünürlüğü sağlar, bu nedenle konfokal tarama mikroskobu kullanılarak deney sonra lekeli yapılarını araştırmak için tavsiye edilir. <ol><li> Fizyolojik ölçümler sonrası, beyin incelemek ve sabitleşmek. </li><li> PBS ve kademeli dihidrat etanol ve metil salycilate net durulayın. </li><li> Konfokal mikroskobi için metil salycilate beyin gömün. </li><li> Biz Leica TCS SP2 mikroskop kullanıyoruz. Dalgaboyu 543nm. </li><li> Biz bir hava veya yağ daldırma amacı ile beyin tarama ve lekeli yapıların görüntüleme verileri ile karşılaştırmak. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Boyama ve hazırlık başarılı olursa, yanlış renk skalası sinyal, mantar vücut alfa lob ekstrensek nöronlar Örneğin, Şekil 1 gibi görünebilir. (PER) ve davranışsal tepki, uyarana (Şekil 2) önce uyaran eksi başak frekans sırasında başak frekans olarak hesaplanabilir. Lekeli yapılar, konfokal mikroskop kullanılarak (Şekil 3) daha ayrıntılı araştırılması olabilir. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure1_new.png" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Kalsiyum Temsilcisi Görüntüleme sinyalleri (heptanal ile stimülasyon). A: arı beyni görüntülenmistir bölge. B: 380nm dalgaboyu X20 daldırma amacı ile görüldüğü gibi ham floresan görüntü, mantar vücudun alfa-lob mor özetlenen. Boya ekstrensek nöronlar leke alfa-lobların ventro-lateral kenarı içine enjekte edildi. C: üç ikinci uyaran sırasında ortalama sinyali deltaF (340/380), türetilmiş Yanlış renkli görüntü; mor belirtilen alfa-lob, seçilen ROI siyah sıraladı. D: koku stimülasyon, C. E belirtildiği gibi ilgi bölgeden ortalama sinyal yanıt Geçici kalsiyum sinyal dinamikleri: ROI sırasıyla sukroz uyarılması IPSI ve kontra-lateral anten yanıt kalsiyum sinyal Geçici dinamikleri, C. içinde <img src="/files/ftp_upload/1353/figure2_new.png" alt="" /> Şekil 2: M17 yanıt Temsilcisi. Koku alma Klima sonra arı koku ödül olmadan burnumun uzanır. Kırmızı çizgi, koku uyaran gösterir. Ankastre: balarısı, PER. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure3_new.png" alt="" /> Şekil 3: Temsilci görüntü yığını. Sonra beyin görüntüleme deney disseke edildi. Şekil 1 nöron mor belirtilen bir X20 immersiyon yağı amacı, alfa-lob ile konfokal bir mikroskop kullanılarak taranır.

<ol><li>Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representations+of+odors+and+odor+mixtures+visualized+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain.</a> Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).</li>
<li>Rehder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+honeybee%27s+proboscis+reflex+by+electromyiographic+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings.</a> J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).</li>
<li>Mauelshagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+olfactory+learning+paradigms+in+an+identified+neuron+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain.</a> J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).</li>
<li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene+Apis+mellifica%2C+Hokaido+Univ%5BTitle%5D)+AND+%22Zool.+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ.</a> Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera.</a> Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).</li>
</ol>

Bu sunumda, balarısı in vivo kalsiyum sinyallerini araştırmak için tüm adımları aracılığıyla gitti . Biz mantar vücut nöronlar için bu tekniği uygulanabilir, ancak bir boyama tekniği kurulacak olan bütün nöronlar üzerinde görüntüleme yapılabilir. Biz bal arısı koku yol nöronların odaklanmıştır. Deneyleri bir karanlık oda yapılır. Kurmak arı optik algılama aralığı yalan ve boyalar heyecanlandırmak değil uzun dalga boyundaki ışık ile aydınlatılır. Örneğin silikon hava kabarcıkları, herhangi bir flüoresan bozulmal...

<table><tbody><tr><td>düşük erime noktalı sert mum Deiberit 502</td><td>Dr. B&amp;#246;hme Sch&amp;#246;ps Dental GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FURA-2 dekstran potasyum tuzu, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>F-3029</td><td>Işıktan koruyunuz.</td></tr><tr><td>tetrametilrodamine dekstran 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D-3312</td><td>Işıktan koruyunuz.</td></tr><tr><td>n-eikosan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21, 927-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Sil Yapıştırıcı</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>KWIK SIL</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme Sistemi</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Imago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CED</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo ca 2 + - bal arısı koku Öğrenme sırasında mantar vücut nöronlar görüntüleme

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Antennal lob 1 in vivo ve yarı-Kalsiyum görüntüleme için in vivo hazırlık Joerges, Kuttner ve Galizia laboratuarımızda geliştirilmiştir üzerinden on yıl önce, koku uyarılmış aktivitesini ölçmek için. O andan itibaren, sürekli olarak rafine edilmiş ve arı beyni farklı neuropiles uygulanır. Burada henüz bir dekstran birleştiğinde kalsiyum duyarlı boya (Fura-2) kullanarak mantar vücut nöron aktivitesini ölçmek için laboratuarda kullanılan hazırlık açıklar. Biz retrograd mantar vücut nöronların aksonları ya da soma bölge içine boya enjekte edilerek leke. Biz klima BAŞINA kullanarak arı yetiştirmek için hala mümkün olduğu bir hazırlık elde etmek için, invazivlik azaltarak odaklanmak. PER (M17) 2 kontrol eden kas elektro-myograms kayıt davranışsal tepki ölçmek ve izlemek mümkün. Fizyolojik deney sonra görüntülü yapılar nöronların kimlik adresine konfokal tarama mikroskobu kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenmiştir.

Arılar iştahlı bir koku alma öğrenme paradigması (PER-condition) klimalı olabilir. Uyaranlara gibi kokular kullanarak, aynı anda Kalsiyum Görüntüleme koku uyarılmış mantar vücut nöron aktivitesini ölçmek için kullanılır kaydedilir hangi davranış bir yöntem kurdu<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo Ca 2 + - Bal Arısı Koku Öğrenme sırasında Mantar Vücut Nöronlar Görüntüleme

Kalsiyum görüntüleme için in vivo ve yarı in vivo hazırlıklar, on yılı aşkın bir süre önce laboratuvarımızda Joerges, Küttner ve Galizia tarafından ... amacıyla geliştirilmiştir.

Bu prosedür, arının bir kayıt odasına sabitlenmesiyle başlar. Beyindeki seçili yapıları boyamak için baş kapsülünden bir parça kütikül çıkarılır. Boyanan nöronlardaki kalsiyum sinyalleri, geniş alan görüntüleme düzeneği kullanılarak in vivo olarak kaydedilir.Görüntüleme sırasında, arı antene verilen kokularla veya sükrozla uyarılabilir. Bu şekilde arı, bir kokuya yanıt olarak proboscisini uzatmaya koşullandırılabilir. Proboscis uzatma yanıtı, M 17 kasından alınan elektromiyogram kayıtları kullanılarak izlenir.Görüntüleme deneyinden sonra, boyanmış yapıların konfokal mikroskop kullanılarak daha yakından incelenmesi için beyin diseke edilir. Merhaba, ben Mansel Laboratuvarı'ndan Melanie. Merhaba, ben de Mansel Laboratuvarı'ndan Anya.Bugün size in vivo kalsiyum görüntüleme ve bal arısı mantar cisimciği için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, bal arısı beynindeki koku kodlamasını ve öğrenmeyle ilişkili plastisiteyi incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Kovan girişinden bir bal arısı foragerını yakalayarak başlayın ve ardından arıyı buz üzerinde soğutarak hareketsiz hale getirin. Sonrasında, arıyı pleksiglas bir kayıt odasına yerleştirin. Gözleri ve tor

in-vivo-ca2-imaging-mushroom-body-neurons-during-olfactory-learning

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz yaşam antennal lobda koku uyarılmış kalsiyum yanıtları ölçmek ve analiz etmek için kurulmuş bir tekniği...

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

Bu videoda, GCaMP kullanılarak Drosophila nöronlarında in vivo kalsiyum görüntüleme açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol klibi, bir koku alma koşullandırma deneyi sırasında mantar vücut nöronlarından GCaMP floresansındaki değişikliklerin nasıl kaydedileceğini gösterir.

Drosophila In Vivo Kalsiyum Görüntüleme: Nöronal Aktivitenin Fonksiyonel Görüntülenmesi İçin Bir Yöntem

Bu videoda, sineklerde sinaptik olarak lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemi gösterilmektedir. Sinekleri mikroskopi için hazırlamak, koku alma koşullandırması yapmak ve koku kaynaklı kalsiyum akışını görselleştirmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de Sinaptik Lokalize Kalsiyum Sensörleri Kullanılarak Kalsiyum Görüntüleme

Bu video, mutant Drosophila beyinlerinin mantar cisimciklerindeki fenotipik kusurları görselleştirmek için ayrıntılı bir immün boyama protokolünü göstermektedir. Protokol, mantar gövdesinin uygun morfolojik ve fonksiyonel gelişimini kolaylaştıran aksonal rehberlikte yer alan bir protein olan Fas2'ye karşı antikorların kullanılmasını içerir.

Drosophila Beyinlerindeki Mantar Vücut Nöronlarının İmmün Boyama ile Görüntülenmesi

İki farklı beyin neuropiles veya iki farklı anatomik yolları eşzamanlı dışı uzun süreli kayıtları arıları kuruldu. Bu kayıtlar farklı beyin bölgelerinde tek nörona yanı sıra davranıyor hayvanda topluluk düzeyinde karşısında nöronal işleme zamansal açıdan soruşturma izin.

Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Bal arısı beyin farklı bölgelerinde farmakolojik ajanların inhibitör etkileri Fosfolifaz C (PLC) üzerinde test etmek için biz bu bölgelerde PLC etkinliği ölçmek için biyokimyasal bir tahlil mevcut. Bu tahlil PLC etkinlik dokular arasında hem de farklı davranışlar sergileyen arılar arasında karşılaştırmak için yararlı olabilir.

Balarısı üzerinden beyin Homogenate Fosfolifaz C aktivite tespiti

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Burada, Drosophila juvenil beynindeki anten lobu sinaptik glomerüllerinin koku alma deneyimine bağlı yeniden şekillenmesini indükleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz.

Erken Yaşamın Kritik Bir Döneminde Juvenil Beyin Koku Alma Duyusal Nöron Sinaptik Bağlantısının Deneyime Bağlı Yeniden Modellenmesi

Öğrenme ve hafıza gibi bilişsel süreçler sırasında hücresel aktiviteyi incelemenin önündeki önemli bir engel, in vivo görüntüleme hazırlığı için anesteziklerin kullanılmasıdır. Anestezi, Drosophila  da dahil olmak üzere birçok modelde kısa süreli hafızayı ve bilişi bozar.Bu çalışma, yetişkin Drosophila'yı anestezi olmadan in vivo görüntüleme için hazırlamak için benzersiz bir yöntem sunmaktadır.

In vivo (İn canlı) Anestezi Uygulanmamış Drosophila Yetişkin Sineklerde Nöral Aktivitenin Görüntülenmesi

İmmobilizasyon için topikal bir doku yapıştırıcısı kullanarak bir Drosophila larva koku alma nöronu için kalsiyum görüntüleme protokolleri sunuyoruz. Bu yöntem stabiliteyi artırarak güvenilir in-vivo ve ex-vivo deneyleri kolaylaştırır. Özel R komut dosyaları kalsiyum sinyallerini analiz ederek ayrıntılı nörofizyolojik araştırmalar için etkili bir platform sağlar.

Üçüncü Dönem Drosophila melanogaster Larvasında Bir Koku Alma Devresi Nöronunun İn-vivo ve Ex-vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Keşfedin bal arılarında koku öğrenmesi sırasında mantar vücut nöronlarının kalsiyum görüntüleme yöntemiyle canlı aktivitesini. Bu teknik davranışsal nörobilim araştırmalarında sinirsel mekanizmaları anlamaya yardımcı olur.

In vivo Ca ^{2 +} - Bal Arısı Koku Öğrenme sırasında Mantar Vücut Nöronlar Görüntüleme

Daha fazla video keşfet