Name: İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Öğrenin, periferik kan mononükleer hücrelerinden insan CD40 aktive B hücreleri üretmeyi. CD40 ligandı ve interlökin-4 ile uyarım, antikor dışı işlevleri ve otoimmün hastalıklardaki rolleri keşfetmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PBMC insan CD40 aktive B hücreleri üretimi için protokol iki bölüme ayrılmıştır: Kısım A plaka bağlı besleyici hücreler olarak kullanılacaktır NIH/3T3 hücreleri, CD40 ligand ifade hazırlanmasında gösteriyor. Bölüm B, gerçek CD40-B kültür açıklar. A. besleyici hücreler Hazırlama (tCD40L NIH/3T3) TCD40L NIH/3T3 tamamen konfluent haline asla yapışkan bir fare fibroblast hücre hattı,. Hücreler bu nedenle haftada iki kez parçalı. Daha fazla 6 hafta içinde Kültürleme tavsiye edilmez. <ol><li> Steril bir pipet ile primer kültür eski orta çıkarın ve 10 ml 1x PBS ile yıkayın hücreleri. PBS ile yıkandıktan sonra aspire. </li><li> 37 °, 5-10 dakika için 75 cm 2 balon 4 ml tripsin / EDTA ° C Hücreleri ayırmak için hafif dokunarak kullanın. </li><li> Vahşi tip orta 10 ml ekleyin ve hafifçe dönebilen. </li><li> Hücre süspansiyonu steril bir pipet yardımıyla 50 ml tüp içine aktarın ve 5 dakika boyunca 225 xg&#39;de hücreleri aşağı döndürün. </li><li> Süpernatantı ve vahşi tip orta 10 ml pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısı sayın ve uygun sayıda hücre ile üç 50 ml tüpler hazırlamak: <ol><li> Alt kültüre için 1.5 x 10 6 hücre </li><li> 0.2 x 10 6 hücre / CD40 B hücre kültürü için kullanılan ışınlama </li><li> dondurmak için geri kalan (gerekirse). </li></ol></li><li> 5 dakika boyunca 225 xg&#39;de hücreleri aşağı spin. </li><li> Süpernatantı. <ol><li> Alt kültüre için tekrar süspansiyon 75 cm 2 hücre kültürü şişesi 10 ml vahşi tip orta (hücre yoğunluğu 1.5 x 10 5 hücre / ml) 1.5 x 10 6 hücre, G-418 [0.7 mg / ml] ve hücrelerin inkübe % 5 CO 2 ile 37 ° C. Haftada iki kez hücreleri bölün. </li><li> CD40 B hücre kültürü için bir adet 6-plaka için 1.2 x 10 6 hücre gerekir. 0.1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğu vahşi tip orta hücrelerin yeniden süspanse edin ve 78 Gy ışın tedavisi. Yanı sıra, her 37 ° inkübe ° C ile% 5 CO 2 hücre süspansiyonu Plaka 2 mL. TCD40L NIH/3T3 hücreleri yapışık B-hücre uyarılması için hazırlanmış tabak kullanın (en az 4 saat: mikroskop ile bağlılık kontrol edin; B-hücre stimülasyon başlatmak için 24 saat daha beklemek gerekmez). (B. devam) </li></ol></li></ol> B. CD 40-B hücre kültürü CD40 stimülasyon (gün 0) PBMC&#39;ler I. Hazırlık: Lütfen dikkat: besleyici hücreler yapışık olduğu tespit devam etmeden önce. Interlökin-4 ve siklosporin besi kullanımdan hemen önce taze çözümler her zaman ekleyin. <ol><li> , Taze veya uygun bir şekilde çözülmüş ya PBMC&#39;ler alın. Süspanse edin, iki kez yıkayın ve ilk kez 7 dakika ve diğer hücreleri çıkarmak için ikinci kez 7 dakika süreyle 190 xg&#39;de 265 xg&#39;de aşağı spin 50ml 1x PBS PBMC&#39;ler. Süpernatant atın ve 20 ml PBS hücrelerin tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısını belirler. </li><li> 5 dakika boyunca 225 xg&#39;de hücrelerin gerekli miktarda aşağı spin. 6 plaka 4 x 10 6 hücre / kuyu, böylece plaka başına 24 x 10 6 hücre ihtiyaç vardır. </li><li> T-hücrelerinin büyüme faktörü ve 0,63 mg / ml siklosporin gibi bir akıbet önlemek için 1 x 10 6 hücre / ml taze interlökin-4 50 U / ml ile desteklenmiş CD40-B kültür ortamı PBMC tekrar süspansiyon süpernatantı (Verilen konsantrasyonları bir ml kültür ortamı bakın!). </li><li> Süpernatantı 6-plaka ön tCD40L NIH/3T3 hücreleri ile inkübe. </li><li> 2 ml PBS başına ilk ve CD40-B yıkama orta 2 mL ikinci bir adımda yapışık tCD40L NIH/3T3 hücreleri yıkayın. </li><li> 6-plaka Her iyi yavaşça PBMC süspansiyon 4 ml (1 x 10 6 hücre / ml) ekleyin. </li><li> 37 hücreleri inkübe ° C ile% 5 CO 2. </li><li> 7 gün, hücreleri (3.2 ile devam edin.) Reculture. </li></ol> II. CD40-B hücreleri (7 gün ve daha sonra her 3-4 gün) Recultivation: <ol><li> 50 ml tüp içine 10 ml pipet ve havuz onları resuspending 6-plaka CD40-B hücreleri Harvest kümeleri. </li><li> 7 dakika boyunca 225 xg&#39;de Spin ve süpernatant tamamen CD40-B yıkama orta yerine. Bir kısım hücre miktarını sayma, 5 dakika boyunca 225 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. 1 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon CD40-B kültür ortamında süspanse edin CD40-B hücreleri. </li><li> 50 U / ml konsantrasyonu ve 0.63 mg / ml orta siklosporin A interlökin-4 taze çözümler ekleyin. </li><li> 6 plaka tCD40L NIH/3T3 hücreleri önceden inkübe süpernatantı. </li><li> 2 ml PBS başına ilk ve CD40-B yıkama orta 2 mL ikinci bir adımda yapışık hücrelere yıkayın. </li><li&gt; yavaşça 4 mL, 6-plaka her kuyuya CD40-B süspansiyon (1 x 10 6 hücre / ml) . </li><li> 37 ° plakaları inkübe ° C,% 5 CO 2 . </li><li> Altkültür hücreleri yeniden her 3-4 günde bir toplam 14 gün sonra son derece saf bir insan CD40 aktive B hücreleri ile sonuna kadar. </li></ol> C. Sorun Giderme - CD40-B hücreleri büyümek yoksa? <ol><li> Besleyici hücreler CD40 ligand ifade için kontrol ettiniz? </li><li> Plaka bağlı uyarılması için kullanılan besleyici hücreler 24 saat daha büyük olması gerekmez mi? </li><li> Mycoplasma mümkün olan bir kirlenme mi? </li><li> Interlökin-4 çözüm takviyesi için kullanılan, taze çözülmüş ve uygun biyolojik aktivite vardı? </li><li> Siklosporin A doğru konsantrasyon eklendi? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">burada</a> Şekil 1&#39;de bir büyük versiyonu için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">buraya tıklayın</a> Şekil 2 daha büyük bir versiyonu için.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li>
<li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li>
</ol>

A. Medya Hazırlanışı: <table border="1"cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Besleyici hücre vahşi tip orta </td><td colspan="2"> Besleyici hücre seçimi orta </td></tr><tr><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon </td><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> DMEM-Ham / F12 </td><td></td><td> DMEM-Ham / F12 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 365 mg / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 365 mg / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 10 </td><td> FBS </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 10 mM </td><td> Hepes </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> 15 mcg / mL </td><td> Gentamisin </td><td> 15 mcg / mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> G-418 </td><td> 0,7 mg / ml </td></tr></table><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> CD40-B yıkama orta </td><td colspan="2"> CD40-B kültür ortamı </td></tr><tr><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon </td><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td> </td><td> IMDM </td><td> </td></tr></tbody><tbody><tr><td> L-Glutamine </td><td> 584 mg / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 584 mg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> Hepes </td><td> 25 mM </td><td> Hepes </td><td> 25 mM </td></tr></tbody><tbody><tr><td> Gentamisin </td><td> 15 mcg / mL </td><td> Gentamisin </td><td> 15 mcg / mL </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> rh Transferrin </td><td> 50 mcg / mL </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> rh İnsülin </td><td> 5 mg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> AB-Humanserum </td><td> % 10 </td></tr></tbody></table> B. Çeşitli Reaktifler: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Hiçbir sipariş </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / Ham Kullanıcı F12 </td><td> PAA </td><td> Cat No: E15-813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 21980-032 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Kedi No H15-011 </td></tr><tr><td> AB-İnsan Serum </td><td> Invitrogen </td><td> Kedi yok 34005100 </td></tr><tr><td> Holo-Transferrin insan </td><td> Sigma </td><td> Kedi yok T0665 </td></tr><tr><td> İnsülin insan </td><td> Sigma </td><td> Kedi yok I2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td> Delta seçin </td><td> Art No 7395800 </td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan İnterlökin-4 </td><td> Immunotools </td><td> Kedi yok 11130045 </td></tr><tr><td> Bir Siklosporin </td><td> Novartis </td><td> Kedi yok NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Lonza </td><td> Kedi yok DE14-802C </td></tr><tr><td> Hepes Tampon </td><td> PAA </td><td> Kedi yok S11-001 </td></tr><tr><td> G-418 Sülfat </td><td> PAA </td><td> Kedi No P02-012 </td></tr><tr><td> Tripsin / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 15400-054 </td></tr></tbody></table> C. Çeşitli Sarf Malzemeleri: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Hiçbir sipariş </td></tr><tr></tr><tr><td> Steril pipet uçları </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-plaka </td><td> Nunc </td><td> Kedi yok 140.675 </td></tr><tr><td> 50ml konik tüp </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Kedi yok 352.070 </td></tr><tr><td> Doku kültürü şişesi </td><td> Sarstedt </td><td> Kedi yok 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

İnsan cd40 aktive b hücreleri üretilmesi

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-aktive B hücreleri (CD40-B hücreleri) immüno-uyarıcı antijen sunan hücreler (APC), kanser immünoterapi için 1-3 alternatif bir kaynak olarak tespit edilmiştir . CD40-B hücreleri birkaç farklı biyolojik ve teknik özellikleri Dendritik hücreler (DH), en iyi karakterize APC ile karşılaştırıldığında. DC&#39;ler benzer şekilde, B hücreleri MHC ve co-uyarıcı moleküller (Fig.1b) artmış ekspresyonu, interlökin-4 ve CD40 ligand (CD40L) ile stimülasyon sonra, güçlü bir göçmen kapasite ve mevcut antijen sunumu T hücrelerinin verimli sergilerler. Ancak, olgunlaşmamış ya da olgun DC&#39;ler aksine, CD40-B hücreleri CD62L, CCR7/CXCR4 oluşan tam bir lenf nodu homing üçlüsü ifade ve ikincil lenfoid organlara homing gerekli lökosit fonksiyon antijen-1 (LFA1, CD11a/CD18) (Fig.1a) 3 CD40-B hücreleri, periferik kanda çok az miktarda daha yüksek saf CD40 B hücreleri sağlıklı donörlerden (&gt; 10 9 hasta başına hücreleri) yanı sıra kanser çok büyük miktarda in vitro açılabilir zorluklar olmadan oluşturulabilir hasta (Fig.1c d) 1,4. Bu protokol, insan hücre tamamen aktif CD40-B hücreleri nasıl elde göstermektedir. Hücre kültürü için anahtar moleküller CD40 ligand, interlökin-4 (IL-4) ve siklosporin A (CsA), 3-4 günde bir kültür döngüsü yenileniyor. Laboratuvar amaçları için CD40 stimülasyon, rekombinant insan CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5 ifade NIH/3T3 hücreleri tarafından sağlanmaktadır . -Transfekte olmayan hücreleri ile kirlenmesini önlemek için, transfektanları insan CD40 ligand ekspresyonu (Şekil 2) düzenli olarak kontrol edilmelidir. 14 gün sonra CD40 B hücre kültürleri fazla% 95 saf B hücreleri CD40-B hücreleri ve 65 gün içinde bir genişleme sık fonksiyonu 1, 4 herhangi bir kayıp olmaksızın mümkün oluşur. CD40-B hücreleri verimli, süreç kadar sürebilir ve T hücrelerinin mevcut antijenler 6. Sadece başbakan naϊve değil, aynı zamanda bellek T hücreleri 7,8 genişletmek. CD40 ile aktive olan B hücreleri, B-hücre aktivasyonu, farklılaşma ve fonksiyon çalışma için kullanılabilir. Ayrıca, tümörler 9 karşı tedavi veya önleyici aşı için umut verici bir aracı temsil eder.

Bu video mevcut<em&gt; Ex vivo</em&gt; Insan CD40 aktive B hücreleri, CD40 ligand ve interlökin-4 ile stimülasyon periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) üretimi ve genişleme (CD40-B).

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

CD40-aktive edilmiş B hücreleri (CD40-B hücreleri), kanser için immünostimülatör antijen sunan hücrelerin (APC) alternatif bir kaynağı olarak tanımlanmıştır...

Merhaba, ben Alexander Shiku Van Hagen. Köln Üniversite Hastanesi'ndeki İmmünoloji ve Transplantasyon İmmünolojisi Laboratuvarı'nın bir üyesiyim. Bu videoda, periferik kan mononükleer hücrelerinden insan CD 40 aktive edilmiş B hücrelerini nasıl üretebileceğimizi size göstereceğiz.Laboratuvarımızın temel ilgi alanlarından biri, B hücrelerinin antikor bağımsız fonksiyonlarının incelenmesidir. Antikor üreticisi rollerinin ötesinde, B hücreleri hem fizyolojik koşullar altında hem de otoimmün hastalıklarda antijen sunan hücreler olarak önemli bir role sahiptir. Aktivasyon sonrası B hücreleri, özellikle CD 40 aracılığıyla aktive olduklarında, güçlü antijen sunma ve immunostimülatuar kapasiteler kazanabilirler.CD 40. Aktive edilmiş B hücreleri, dendritik hücrelerle karşılaştırıldığında çeşitli avantajlara sahiptir. Kanser hastalarından bile, periferik kanın küçük miktarlarından nispeten düşük maliyetle kolayca çoğaltılabilirler.Şimdi doktora öğrencimiz Tanya Leic ve teknisyenimiz LER, periferik kandan insan CD 40 aktive edilmiş B hücrelerinin nasıl üretileceğine dair size adım adım bir giriş yapacaklar. Merhaba, benim adım Tanya Livi. Doktora öğrencisiyim ve size insan CD 40 aktive edilmiş B hücrelerinin nasıl üretileceğini göstermek istiyorum.Bu prosedür laboratuvarımızda optimize edilmiştir. Ana adımlar şunlardır; öncelikle besleyici hücrelerin hazırlanması. Bu amaçla, 78 gray radyasyona maruz bırakılan ve altı kuyucuklu plakalara ekilen, insan CD 40 ligandı transfekte edilmiş N IH 33 hücreleri kullanıyoruz.İkinci olarak, saflaştırılmış PBMC'den elde edilen ve insan interlökin 4 ile siklosporin A ile muamele edilen insan CD 40 aktifleşmiş B hücrelerinin kültürüne başlanır; bu hücreler daha sonra altı kuyucuklu plakalarda feta hücrelerinin üzerine ekilir. Bu işlem yedinci günde ve ardından hücre kültürünün 14. gününe kadar her üç ila dört günde bir tekrarlanır. Yüksek saflıkta insan CD 40 aktifleşmiş B hücreleri elde etmek için, CD 40 aktifleşmiş B hücrelerinin üretimine taze saflaştırılmış veya uygun şekilde çözülmüş insan PBMC ile başlanır.İlk olarak, PBMC'leri iki kez yıkarız; bunun için hücreleri 50 mL PBS içerisinde yeniden süspanse ederiz. PBMC'leri 260 ×g'ye karşılık gelen 1300 RPM'de yedi dakika boyunca santrifüj ederiz. Ardından, süpernatantı uzaklaştırır ve hücreleri tekrar 50 mL PBS içerisinde süspanse ederek, 190 ×g'ye karşılık gelen 1100 RPM'de yedi dakika boyunca yeniden santrifüj ederiz. Hücre sayımının belirlenmesi için süpernatantı tekrar uzaklaştırırız.PBMC'leri 20 mililitre PBS içinde süspande edin, hücreleri vorteksleyerek iyice karıştırın ve hücre sayısını belirleyin. CD 40 B kültürü için gerekli miktardaki PBMC'yi 1200 RPM (220 5G'ye karşılık gelir) hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Altı kuyucuklu bir plaka kullanarak, kuyucuk başına 4 x 10⁶ hücre ve plaka başına toplam 24 x 10⁶ hücreye ihtiyacınız vardır.Ardından PBMC'leri, CD 40 B kültür ortamında 1×10⁶ hücre/mL olacak şekilde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, stimülasyon için 50 U/mL konsantrasyonunda taze insan IL-4 ve T-hücre büyümesini inhibe etmek için 0,63 µg/mL konsantrasyonunda siklosporin A ile destekleyin. Artık PBMC süspansiyonu, CD 40 ligandı ile stimülasyon için hazırdır.Bildiğimiz kadarıyla, şu an için fonksiyonel GMP kalite SOMAL CD 40 ligandı mevcut değildir. Bu nedenle, NIH 3T3 hücre hattı kültürde birkaç ay boyunca hayatta kalabildiği için hücre sağkalımı, farklılaşması ve proliferasyonunu stimüle etmek amacıyla insan CD 40 ligandı ile transfekte edilmiş NIH 3T3 hücrelerini kullanıyoruz. CD 40 ligandı ekspresyon kaybının düzenli olarak kontrol edilerek dışlanması gerekmektedir.CD 40 ligand transfekte edilmiş, NIH 3T3, 0,7 mg/mL konsantrasyonunda G 4 1 8 ile desteklenmiş seçici ortamda, 37 °C'de ve %5 CO2 altında kültüre edilen bir adherent hücre hattıdır. Bu adherent fibroblast hücre hattı asla tamamen konfluen hale getirilmemeli ve haftada iki kez pasajlanmalıdır. Adherent hücreleri pasajlamak için ortamı aspire edin, 10 mL PBS ile bir kez yıkayıp nazikçe çalkalayın. Ortamı tekrar aspire edin ve 75 cm²'lik bir flaska 4 mL tripsin EDTA ekleyin.Balonu inkübatörde 37 °C'de beş ila 10 dakika inkübe edin. Balonu tekrar dışarı çıkarın. Hücreleri plastikten ayırmak için hafifçe vurma yöntemini kullanın.Ardından 10 mL yabani tip ortamı ekleyin, nazikçe çalkalayın ve hücreleri 50 mL'lik bir tüpe aktarın. NA83T3 hücrelerini, 1200 RPM'e (125g'ye) karşılık gelen hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Pelet halindeki hücreleri 10 mL yabani tip ortamında dikkatlice yeniden süspande edin.N IH 33 alt kültürü için hücre sayısını belirleyin ve 1,5 × 10⁶ feeder hücresini 10 mL wildtype medyumu içerisinde yeniden süspande edin. Hücreleri 75 cm²'lik bir flaska aktarın ve neomisin direnç genlerini taşıyan transfekte hücreleri seçmek için 0,7 mg/mL konsantrasyonda G 418 ekleyin. Son olarak, feeder hücrelerini CD 40 B stimülasyonu için 37 °C'de, %5 CO2 ortamında inkübe edin.Kalan NI 8 3 3 hücrelerini alın ve proliferasyonlarını durdurmak için onları 78 Gy ile letal düzeyde ışınlayın. Işınlanmış feeder hücrelerini, hücre yoğunluğu 0.1 × 10⁶ hücre/mL olacak şekilde wire tipi besiyerinde seyreltin ve altı kuyucuklu bir plakadaki kuyucuk başına 2 mL olacak şekilde ekleyin. CD 40 ligandı ile B lenfositlerin stimülasyonunda feeder hücre olarak kullanmadan önce, hücrelerin altı kuyucuklu plakalarda tekrar yapışkan hale gelmeleri için onları 37 °C ve %5 CO2 ortamında 24 saat boyunca inkübe edin.Bir gün önce ekilen feeder hücrelerin yapışıp yapışmadığını mikroskop altında kontrol edin. Feeder hücreler yapışmışsa, her kuyucuktaki SUP natini uzaklaştırın ve kuyucukları hızlıca iki kez yıkayın. İlk olarak her kuyucuğu iki mililitre PBS ile, ikinci olarak ise iki mililitre ile yıkayın.PBMC süspansiyonunun stimülasyonu için CD 40 B yıkama medyumu. Besleyici hücreler için mililitrede 1x10⁶ hücre yoğunluğunda, hemen öncesinde hazırlanmış. Bunun için, her birine hücre süspansiyonundan nazikçe 4 mL aktarın.Yedinci günde plak 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edilecektir. CD 40 B hücreleri, yedinci gündeki aktive edilmiş B hücreleri için ilk pasajda ve sonraki pasajlarda her üç ila dört günde bir alt kültürle çoğaltılabilir.Kümelenmiş hücreleri, 10 mililitrelik bir pipetle süspanse ederek altılı 12'li plakadan nazikçe toplayın. CD 40 B hücrelerini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. CD 40 B hücrelerini 1200 RPM'de (220 5G'ye tekabül eder) yedi dakika boyunca santrifüjleyin.Besiyerini CD 40 B yıkama besiyeri ile değiştirin ve CD 40 aktive edilmiş B hücrelerinin hücre sayısını belirleyin. CD 40 B hücrelerini, CD 40 B kültür besiyerinde 1 × 10⁶ hücre/mL olacak şekilde yeniden süspande edin.Ardından, stimülasyon için hücre süspansiyonunu 50 units/mL konsantrasyonunda taze insan IL-4 ve 0.63 µg/mL konsantrasyonunda siklosporin A ile takviye edin. Bir gün önceden hazırlanan ışınlanmış feeder hücreleri ekleyin. Elbette, ışınlanmış feeder hücrelerinin adezyonu, kullanımden hemen önce mikroskop altında tekrar kontrol edilmelidir.Hücreler yapışmışsa, besleyici hücreleri daha önce olduğu gibi iki kez hızlıca yıkayın; bir kez PBS ile, diğer kez ise CD 40 B yıkama medyası ile. Ardından, altı kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa, mililitrede 1×10⁶ hücreye ayarlanmış CD 40 B süspansiyonundan dikkatlice 4 mL ekleyin. Kültürün 14. gününde yüksek saflıkta insan CD 40 aktive B hücresi kümeleri elde etmek için, alt kültür işlemi üç ila dört gün sonra haftada iki kez aynı şekilde tekrarlanır.Bu aşamada, CD 40 B hücreleri CD 80, CD 86, CD 83 MHC molekülleri gibi ko-stimülatör moleküllerin yanı sıra CD 62 ligandı, CCR 7 ve LFA 1'den oluşan ve lenf noduna yönelim üçlüsü olarak adlandırılan molekülleri eksprese eder; bunlar üretim sırasında akış sitometrisi (flow cytometry) ile kontrol edilebilir. Sorun giderme işlemleri için lütfen bu protokolün metin versiyonuna başvurun. Gelecekte CD 40 aktive edilmiş B hücrelerinin kanser immünoterapisi için önemli bir araç olacağını umuyoruz.Deneylerinizde başarılar dileriz.

generation-of-human-cd40-activated-b-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, CD40 aktivasyonu ve dokunulmazlık indüksiyonu eğitim için bir model antijen sunan hücre (APC) olarak da kullanılabilir C57BL / 6 farelerin dalak, fare B hücreleri genişleme prosedürü göstermektedir.

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Bir gen yapısı ve fonksiyonu analizi verimli bir...

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

Bu videoda, yaygın lenfoid progenitör hücrelerden (CLP'ler) plazmositoid dendritik hücreler (pDC'ler) oluşturmak için bir in vitro test gösterilmektedir. Saflaştırılmış CLP'lerin Fms benzeri tirozin kinaz-3 ligandı (FL) varlığında γ ışınlanmış besleyici hücrelerle birlikte kültürlenmesi üzerine, CLP'ler, varlığı akış sitometrisi kullanılarak doğrulanan yapışmayan pDC'lere farklılaşır.

Ortak Lenfoid Progenitörlerden Plazmasitoid Dendritik Hücrelerin İn Vitro Üretimi

Bu video, tümör antijenine özgü indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi CD8αβ+ T Hücreleri oluşturmak için bir testi göstermektedir. Tümör antijenine özgü iPSC'ler, stromal hücreli bir tek tabaka üzerinde büyütülür ve hematopoietik progenitör hücrelere (HPC'ler) farklılaşır. HPC'ler, bir farklılaşma ortamı kullanılarak CD4 + CD8 + çift pozitif T hücrelerine farklılaştırılır. Bu hücreler daha sonra CD8 eksprese eden tek pozitif T hücreleri oluşturmak üzere uyarılır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Tek Pozitif CD8 T Hücrelerinin Üretilmesi

Bu makale, tanımlanmış bir alloantijene spesifik olarak yanıt veren insan T hücresi klonlarının üretilmesi ve yayılması için bir yöntemi açıklar. Bu protokol, çeşitli peptit-MHC ligandlarına özgü insan T hücrelerinin klonlanması için uyarlanabilir.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

Bu yazıda, mevcut bir TCR'nin TCRα ya TCRβ eşleştirme periferal T hücresi reseptör repertuvarının tamamlayıcı hemichain ile, ilgi konusu antijen spesifikliğini sahip antijen-spesifik T hücre reseptörleri (TCR'ler) oluşturmak için yeni bir metot açıklamaktadır. De novo oluşturulan TCRler afiniteye değişen antijen spesifikliğini muhafaza eder.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

Burada, insan anti-pıhtılaşmış kanının yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra periferik kan mononükleer hücrelerinden manyetik boncuk ayrılması ile monositlerin nasıl izole edildiğini gösteriyoruz. 5 günlük inkübasyonun ardından, insan monositleri olgunlaşmamış dendritik hücrelere ayrılır ve klinik olmayan bir ortamda deneysel prosedürler için hazır hale gelir.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Çok adımlı kültür sistemleri kullanarak, biz in vitro bir B hücre plazma hücre farklılaşması modeli için rapor.

Uzun ömürlü plazma hücreleri insan Normal bellek B hücrelerine vitro farklılaştırma modelinde

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Öğrenin, periferik kan mononükleer hücrelerinden insan CD40 aktive B hücreleri üretmeyi. CD40 ligandı ve interlökin-4 ile uyarım, antikor dışı işlevleri ve otoimmün hastalıklardaki rolleri keşfetmenizi sağlar.

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

Daha fazla video keşfet