İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

Merhaba, ben Alexander Shiku Van Hagen. Köln Üniversite Hastanesi'ndeki İmmünoloji ve Transplantasyon İmmünolojisi Laboratuvarı'nın bir üyesiyim. Bu videoda, periferik kan mononükleer hücrelerinden insan CD 40 aktive edilmiş B hücrelerini nasıl üretebileceğimizi size göstereceğiz.

Laboratuvarımızın temel ilgi alanlarından biri, B hücrelerinin antikor bağımsız fonksiyonlarının incelenmesidir. Antikor üreticisi rollerinin ötesinde, B hücreleri hem fizyolojik koşullar altında hem de otoimmün hastalıklarda antijen sunan hücreler olarak önemli bir role sahiptir. Aktivasyon sonrası B hücreleri, özellikle CD 40 aracılığıyla aktive olduklarında, güçlü antijen sunma ve immunostimülatuar kapasiteler kazanabilirler.

CD 40. Aktive edilmiş B hücreleri, dendritik hücrelerle karşılaştırıldığında çeşitli avantajlara sahiptir. Kanser hastalarından bile, periferik kanın küçük miktarlarından nispeten düşük maliyetle kolayca çoğaltılabilirler.

Şimdi doktora öğrencimiz Tanya Leic ve teknisyenimiz LER, periferik kandan insan CD 40 aktive edilmiş B hücrelerinin nasıl üretileceğine dair size adım adım bir giriş yapacaklar. Merhaba, benim adım Tanya Livi. Doktora öğrencisiyim ve size insan CD 40 aktive edilmiş B hücrelerinin nasıl üretileceğini göstermek istiyorum.

Bu prosedür laboratuvarımızda optimize edilmiştir. Ana adımlar şunlardır; öncelikle besleyici hücrelerin hazırlanması. Bu amaçla, 78 gray radyasyona maruz bırakılan ve altı kuyucuklu plakalara ekilen, insan CD 40 ligandı transfekte edilmiş N IH 33 hücreleri kullanıyoruz.

İkinci olarak, saflaştırılmış PBMC'den elde edilen ve insan interlökin 4 ile siklosporin A ile muamele edilen insan CD 40 aktifleşmiş B hücrelerinin kültürüne başlanır; bu hücreler daha sonra altı kuyucuklu plakalarda feta hücrelerinin üzerine ekilir. Bu işlem yedinci günde ve ardından hücre kültürünün 14. gününe kadar her üç ila dört günde bir tekrarlanır. Yüksek saflıkta insan CD 40 aktifleşmiş B hücreleri elde etmek için, CD 40 aktifleşmiş B hücrelerinin üretimine taze saflaştırılmış veya uygun şekilde çözülmüş insan PBMC ile başlanır.

İlk olarak, PBMC'leri iki kez yıkarız; bunun için hücreleri 50 mL PBS içerisinde yeniden süspanse ederiz. PBMC'leri 260 ×g'ye karşılık gelen 1300 RPM'de yedi dakika boyunca santrifüj ederiz. Ardından, süpernatantı uzaklaştırır ve hücreleri tekrar 50 mL PBS içerisinde süspanse ederek, 190 ×g'ye karşılık gelen 1100 RPM'de yedi dakika boyunca yeniden santrifüj ederiz. Hücre sayımının belirlenmesi için süpernatantı tekrar uzaklaştırırız.

PBMC'leri 20 mililitre PBS içinde süspande edin, hücreleri vorteksleyerek iyice karıştırın ve hücre sayısını belirleyin. CD 40 B kültürü için gerekli miktardaki PBMC'yi 1200 RPM (220 5G'ye karşılık gelir) hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Altı kuyucuklu bir plaka kullanarak, kuyucuk başına 4 x 10⁶ hücre ve plaka başına toplam 24 x 10⁶ hücreye ihtiyacınız vardır.

Ardından PBMC'leri, CD 40 B kültür ortamında 1×10⁶ hücre/mL olacak şekilde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, stimülasyon için 50 U/mL konsantrasyonunda taze insan IL-4 ve T-hücre büyümesini inhibe etmek için 0,63 µg/mL konsantrasyonunda siklosporin A ile destekleyin. Artık PBMC süspansiyonu, CD 40 ligandı ile stimülasyon için hazırdır.

Bildiğimiz kadarıyla, şu an için fonksiyonel GMP kalite SOMAL CD 40 ligandı mevcut değildir. Bu nedenle, NIH 3T3 hücre hattı kültürde birkaç ay boyunca hayatta kalabildiği için hücre sağkalımı, farklılaşması ve proliferasyonunu stimüle etmek amacıyla insan CD 40 ligandı ile transfekte edilmiş NIH 3T3 hücrelerini kullanıyoruz. CD 40 ligandı ekspresyon kaybının düzenli olarak kontrol edilerek dışlanması gerekmektedir.

CD 40 ligand transfekte edilmiş, NIH 3T3, 0,7 mg/mL konsantrasyonunda G 4 1 8 ile desteklenmiş seçici ortamda, 37 °C'de ve %5 CO2 altında kültüre edilen bir adherent hücre hattıdır. Bu adherent fibroblast hücre hattı asla tamamen konfluen hale getirilmemeli ve haftada iki kez pasajlanmalıdır. Adherent hücreleri pasajlamak için ortamı aspire edin, 10 mL PBS ile bir kez yıkayıp nazikçe çalkalayın. Ortamı tekrar aspire edin ve 75 cm²'lik bir flaska 4 mL tripsin EDTA ekleyin.

Balonu inkübatörde 37 °C'de beş ila 10 dakika inkübe edin. Balonu tekrar dışarı çıkarın. Hücreleri plastikten ayırmak için hafifçe vurma yöntemini kullanın.

Ardından 10 mL yabani tip ortamı ekleyin, nazikçe çalkalayın ve hücreleri 50 mL'lik bir tüpe aktarın. NA83T3 hücrelerini, 1200 RPM'e (125g'ye) karşılık gelen hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Pelet halindeki hücreleri 10 mL yabani tip ortamında dikkatlice yeniden süspande edin.

N IH 33 alt kültürü için hücre sayısını belirleyin ve 1,5 × 10⁶ feeder hücresini 10 mL wildtype medyumu içerisinde yeniden süspande edin. Hücreleri 75 cm²'lik bir flaska aktarın ve neomisin direnç genlerini taşıyan transfekte hücreleri seçmek için 0,7 mg/mL konsantrasyonda G 418 ekleyin. Son olarak, feeder hücrelerini CD 40 B stimülasyonu için 37 °C'de, %5 CO2 ortamında inkübe edin.

Kalan NI 8 3 3 hücrelerini alın ve proliferasyonlarını durdurmak için onları 78 Gy ile letal düzeyde ışınlayın. Işınlanmış feeder hücrelerini, hücre yoğunluğu 0.1 × 10⁶ hücre/mL olacak şekilde wire tipi besiyerinde seyreltin ve altı kuyucuklu bir plakadaki kuyucuk başına 2 mL olacak şekilde ekleyin. CD 40 ligandı ile B lenfositlerin stimülasyonunda feeder hücre olarak kullanmadan önce, hücrelerin altı kuyucuklu plakalarda tekrar yapışkan hale gelmeleri için onları 37 °C ve %5 CO2 ortamında 24 saat boyunca inkübe edin.

Bir gün önce ekilen feeder hücrelerin yapışıp yapışmadığını mikroskop altında kontrol edin. Feeder hücreler yapışmışsa, her kuyucuktaki SUP natini uzaklaştırın ve kuyucukları hızlıca iki kez yıkayın. İlk olarak her kuyucuğu iki mililitre PBS ile, ikinci olarak ise iki mililitre ile yıkayın.

PBMC süspansiyonunun stimülasyonu için CD 40 B yıkama medyumu. Besleyici hücreler için mililitrede 1x10⁶ hücre yoğunluğunda, hemen öncesinde hazırlanmış. Bunun için, her birine hücre süspansiyonundan nazikçe 4 mL aktarın.

Yedinci günde plak 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edilecektir. CD 40 B hücreleri, yedinci gündeki aktive edilmiş B hücreleri için ilk pasajda ve sonraki pasajlarda her üç ila dört günde bir alt kültürle çoğaltılabilir.

Kümelenmiş hücreleri, 10 mililitrelik bir pipetle süspanse ederek altılı 12'li plakadan nazikçe toplayın. CD 40 B hücrelerini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. CD 40 B hücrelerini 1200 RPM'de (220 5G'ye tekabül eder) yedi dakika boyunca santrifüjleyin.

Besiyerini CD 40 B yıkama besiyeri ile değiştirin ve CD 40 aktive edilmiş B hücrelerinin hücre sayısını belirleyin. CD 40 B hücrelerini, CD 40 B kültür besiyerinde 1 × 10⁶ hücre/mL olacak şekilde yeniden süspande edin.

Ardından, stimülasyon için hücre süspansiyonunu 50 units/mL konsantrasyonunda taze insan IL-4 ve 0.63 µg/mL konsantrasyonunda siklosporin A ile takviye edin. Bir gün önceden hazırlanan ışınlanmış feeder hücreleri ekleyin. Elbette, ışınlanmış feeder hücrelerinin adezyonu, kullanımden hemen önce mikroskop altında tekrar kontrol edilmelidir.

Hücreler yapışmışsa, besleyici hücreleri daha önce olduğu gibi iki kez hızlıca yıkayın; bir kez PBS ile, diğer kez ise CD 40 B yıkama medyası ile. Ardından, altı kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa, mililitrede 1×10⁶ hücreye ayarlanmış CD 40 B süspansiyonundan dikkatlice 4 mL ekleyin. Kültürün 14. gününde yüksek saflıkta insan CD 40 aktive B hücresi kümeleri elde etmek için, alt kültür işlemi üç ila dört gün sonra haftada iki kez aynı şekilde tekrarlanır.

Bu aşamada, CD 40 B hücreleri CD 80, CD 86, CD 83 MHC molekülleri gibi ko-stimülatör moleküllerin yanı sıra CD 62 ligandı, CCR 7 ve LFA 1'den oluşan ve lenf noduna yönelim üçlüsü olarak adlandırılan molekülleri eksprese eder; bunlar üretim sırasında akış sitometrisi (flow cytometry) ile kontrol edilebilir. Sorun giderme işlemleri için lütfen bu protokolün metin versiyonuna başvurun. Gelecekte CD 40 aktive edilmiş B hücrelerinin kanser immünoterapisi için önemli bir araç olacağını umuyoruz.

Deneylerinizde başarılar dileriz.