Horseshoe Yengeç kullanarak, Limulus Polyphemus'un Vizyon Araştırma

Merhaba, ben Chris Paglia, Boston Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'ndeki Görsel Bilgi İşleme Laboratuvarı'nın direktörüyüm. Merhaba, ben Dr. Paglia'nın laboratuvarında doktora öğrencisi olan Jacque Liu. Laboratuvarımızın araştırma çalışmaları, hayvanların görmesini sağlayan nöral hesaplamaları anlamaya yöneliktir.

Bu araştırma için, yeryüzündeki en eski canlılardan biri olan Amerikan nal yengecini kullanıyoruz. Bu hayvanlar yaşayan fosiller olabilir; ancak biyomedikal araştırmalarda vazgeçilmez bir rol oynamaya devam etmektedirler.

Kanları, bilim insanlarının ilaçlarımızdaki bakteri toksinlerini tespit etmek için kullandıkları özel hücreler içermenin yanı sıra, gözleri de görme sistemimizin nasıl çalıştığına dair pek çok bilgi sağlayan bir sinir ağına sahiptir. Işık adaptasyonu ve lateral inhibisyon gibi süreçlerin hücresel temelleri ilk olarak hayvanın bileşik lateral gözleri üzerine yapılan çalışmalarda ortaya çıkarılmıştır ve bu öncü çalışma nedeniyle Dr. Keffer Hartline 1967 yılında Nobel Ödülü almıştır. At Nalı Yengeç, bir omurgasız için büyük ve dayanıklı olması, retinal nöronlarının iri ve kolayca erişilebilir olması nedeniyle görme araştırmaları için cazip bir model olmaya devam etmektedir.

Görsel sistemi kompak olup kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır ve görsel davranışı iyi tanımlanmıştır. Ayrıca, gözlerin yapısı ve işlevi, hayvanın beynindeki sirkadiyen bir saat tarafından günlük olarak modüle edilir. Kısacası, at nalı yengeçlerinin görsel sistemi, anlaşılacak kadar basit ancak ilgi çekici olacak kadar karmaşıktır.

Bu videoda, bu klasik hayvan modeliyle in vivo olarak gerçekleştirilebilen, görmenin nörolojik temelini araştırmak için kullanılan üç deneysel paradigmayı örneklendireceğiz. Görme araştırmaları için bunlar; elektroretinogram kaydı, optik sinir kaydı ve intraretinal kayıttır. At nalı yengeçleri, düzenli bir ışık-karanlık döngüsüne maruz bırakılan bir odada, havalandırılmış tuzlu su tanklarında tutulmaktadır.

Bu kayıt tekniklerinden herhangi birine başlamadan önce, hayvanlar yaklaşık 10 dakika boyunca buz kovasında soğutulmuş ve ardından pro soma kısmına iki, EPIs soma kısmına ise iki paslanmaz çelik vida yerleştirilerek ahşap bir platforma sabitlenmiştir. Platformun altına, suyun içinde batmasını sağlamak için granit ağırlık konulmuştur. Göz hassasiyetini zaman içinde izlemek için elektroretinogram veya ERG kullanılır.

Gözdeki tüm hücrelerin toplam elektriksel yanıtını ölçer. Işık çakması uygulaması için bu prosedürde gerekli olan araçlar arasında bir tornavida, vazelin, ringer çözeltisi, bir pipet, bir LED, bir kayıt odası, paslanmaz çelik vidalar ve bir pamuklu çubuk yer alır. ERG ölçümü için kendi yapımımız olan bir kayıt odası kullanıyoruz.

Gövde, gözle temas halinde bir salyine rezervuarı tutacak şekilde tasarlanmıştır. Kapak, iletken çözeltiyi bir amplifikatöre bağlamak için gümüş klorür tel ve ekleme öncesinde bir LED'in yerleştirilebileceği boyutta küçük bir delik içerir. Haznenin alt tarafı vazelin ile kaplanmıştır.

Ardından, At nalı yengeci gözü üzerine iki vida ile sabitlenen odacıklar salin ile doldurulur ve kapakları kapatılır. Hayvan, solungaçları suyun altında kalacak şekilde deniz suyuyla dolu bir tanktaki ışık sızdırmaz bir kafese yerleştirilir. LED kablosu odacık kapağına yerleştirilir.

Sinyal kablosu oda teline, referans kablosu ise implante edilen vidalardan birine takılır ve her iki kablo, sinyal amplifikasyonu ve gürültü filtreleme için yüksek empedanslı bir diferansiyel amplifikatörün baş aşamasına bağlanır. Ardından, oda ışığının hayvana ulaşmasını engellemek için kafes kapatılır. AD aşaması amplifikatöre bağlanır ve amplifikatör filtreleri yaklaşık 10 hertz altındaki frekansları geçirecek şekilde ayarlanır.

Buradan sinyal, görüntüleme için osiloskopa ve bilgisayarla analiz ve depolama için bir veri toplama kartına aktarılır; LED'den ışık stimülasyonları sağlamak ve ERG sinyalini kaydetmek için LabVIEW ile yazılmış özel bir program kullanıyoruz. LED, her 10 dakikada bir 5 V'luk 100 milisaniyelik bir darbe ile tetiklenir. Solda, her bir ışık flaşına verilen ERG dalga formu görüntülenmiş; sağda ise göz hassasiyetindeki zamanla meydana gelen değişiklikleri izlemek için ardışık flaş dalga formlarının tepe-tepe genliği çizilmiştir.

ERG kayıtları ile ışık adaptasyonunun ve sirkadiyen nöral modülasyonun etkileri incelenebilir. Göz, görsel mesajları ve optik sinir liflerinin spike yanıtlarını beyne iletir. Kodlanmış mesajlar, tekil sinir liflerinden hücre dışı kayıtlar alınarak çalışılabilir.

Bu yöntemle, göze geri beslenen sirkadiyen saat mesajları da incelenebilir. Bu prosedür için gerekli araçlar arasında bir tornavida, ring çözeltisi, makaslar, bir kayıt odası, kavisli pensler, ince bir iğne prob, küt bir bistüri, cerrahi makaslar ve seksiyonel bir elektrot yer alır. Siniri yerleştirmek için bir dile sahip kayıt odaları tasarlanmıştır; 20 mililitre kan, menteşe kasları ile kalbe doğru 16 gauge bir iğne yerleştirilerek attan boşaltılabilir.

Kan boşaltma gerekli değildir, ancak hayvan platforma sabitlendiğinde optik sinir dissection işlemini kolaylaştırır. Optik sinirin konumu, lateral ve median gözler arasında karpus üzerine hafif kavisli bir çizgi çizilerek tahmin edilir. Daha sonra, karpus üzerinde bir refin ile dairesel bir delik açılır.

Delik, oda tabanıyla aynı çapta olur. Deliğin merkezi, lateral gözün yaklaşık iki santimetre anteriorunda ve sinirin oda tabanının ventral kısmı boyunca uzanacağı şekilde çizginin hafifçe dorsalinde yer alır; bağ dokuyu örten kısım, sinirin tam uzunluğu görünene kadar temizlenir ve açığa çıkan sinir, çevresindeki ve altındaki dokulardan serbestleştirilir. Bir iplik parçası sinirin etrafından geçirilerek tabandaki yarım daire şeklindeki açıklıktan oda içerisine çekilir.

Aynı açıklık aracılığıyla, ipe çekilerek sinir nazikçe kamaraya yönlendirilir. Sinir kamaraya girerken, sinir üzerindeki gerilmeyi minimize etmek amacıyla kamara tabanı deliğe doğru itilir. Ardından kamara iki vida ile sabitlenir ve Ringer solüsyonu ile doldurulur.

Kamber takıldıktan sonra hayvan, solungaçların üzerinde kalacak şekilde deniz suyuyla doldurulmuş bir tanktaki hafif sıkı bir kafese yerleştirilir. Kamber içi stereoskop altında görüntülenir ve kamber içine kan sızıntısını, kamberden ise Ringer çözeltisi sızıntısını önlemek için alt açıklığın etrafı pamukla desteklenir. Kamber, taze Ringer çözeltisi ile yeniden doldurulur.

Kalıntı dokular ince kavisli makas ve pensetler yardımıyla temizlenir. Siniri çevreleyen kılıfta küçük bir kesi yapılır ve sinir, ince bir iğne probu ile kılıftan ayrılır. Kılıf, sinir boyunca boyuna kesiler yapılarak kademeli olarak açılır ve çıkarılır.

Ardından, prob kullanılarak sinirden küçük bir lif demeti ayrılır ve gözden en uzak uçtan afferent lif kaydı için, göze en yakın uçtan ise efferent lif kaydı için kesilir. Kayıt için, vakumlama amacıyla bir Gilman şırıngasına tüplerle bağlı olan ve Springer solüsyonu ile doldurulmuş bir AM sistem seksiyon elektrodu kullanılır. Elektrot ucu, 1 mm çapındaki bir borosilikat cam kapiler ucunun ateşle cilalanmasıyla hazırlanır; B ve C bağlantıları sinyal iletkenini sağlar ve gürültüyü azaltmak için elektroda sarılmış bir gümüş klorür teli referans iletkeni oluşturur.

Elektrot ucu kayıt odasına yerleştirilir ve sinir demetinin kesik ucu, vakum aracılığıyla cam ucun içine çekilir. Sinyal ve referans uçları, sinyal amplifikasyonu ve gürültü filtrelemesi için diferansiyel bir amplifikatörün kafa katına bağlanır. Amplifikatör çıktısı, görüntüleme için bir osiloskopa ve bilgisayar analizi ile depolama için bir veri toplama kartına aktarılır.

Işık stimülasyonlarını kontrol etmek için LabVIEW ile yazılmış özel bir program ve spike dizilerini kaydetmek için dijital bir spike diskriminatörü kullanıyoruz. Tek hücre aydınlatması için fiber optik bir ışık borusu kullanılırken, optik sinir kayıtları ile patern stimülasyonu için bilgisayar kontrollü bir video ekranı kullanılmaktadır; böylece gözler ve beyin arasındaki sinyal iletimi intraretinal olarak incelenebilir. Kayıt işlemi, bir mikro elektrodun doğrudan gözdeki hücrelere yerleştirilmesini ve ışığın tetiklediği hücre içi voltaj dalgalanmalarının kaydedilmesini içerir.

Bu prosedür için gerekli araçlar arasında bir tornavida ve L şeklinde şeffaf bir platform yer almaktadır. Cam elektrodun üzerinden geçecek bir mikro elektrot için dişli vida delikleri, paslanmaz çelik vidalar, cımbız ve ince uçlu bir bisturi kullanılır. Yengeç sabitlendikten sonra; iki yanına ve üst kısmına bir adet olmak üzere toplam üç vida ile önceden belirlenmiş vida deliklerine sahip şeffaf bir plaka, karpusa sabitlenir.

Hayvan, solungaçları kaplayacak şekilde deniz suyuyla doldurulmuş bir tank içindeki ışık sızdırmaz bir kafese yerleştirilir. Motorlu bir mikro konumlandırıcı, vidalarla bıçak kısmına sabitlenir ve konumlandırıcı kol göz üzerine hizalanır. Bir grup cam mikro pipet, bir milimetre dış çaplı silikat camdan çekilir ve uçları kılcal etkiyle doldurulur.

Pipetler birkaç dakika boyunca üç molar potasyum klorür çözeltisi içeren bir şişeye yerleştirilerek, pipetin geri kalanı tuz çözeltisi ile manuel olarak doldurulur ve kabarcık oluşumunu önlemek için önceden çözelti ile doldurulmuş bir mikro elektrot tutucuya yerleştirilir. Ardından elektrot tutucu, mikro konumlandırıcıya sabitlenmiş bir hücre içi amplifikatörün kafa aşamasına yerleştirilir. Dorsal korneadan küçük kare bir kesit dikkatlice kesilerek çıkarılarak retinanın bir bölümü açığa çıkarılır.

Skalpel kullanılarak, kurumayı önlemek amacıyla açığa çıkarılan doku üzerine bir damla Ringer Solüsyonu yerleştirilir ve mikropipet retinaya doğru ilerletilir. Pipet ucu solüsyona temas ettiğinde, hücre içi amplifikatörün mevcut enjeksiyon modu devreye alınır ve elektrot empedansı ölçülür; 20 ile 70 mega ohm aralığının dışındaki empedans değerlerine sahip mikropipetler elenir. Bu aralıktaki pipetler, mikron boyutundaki adımlarla retinaya doğru ilerletilir ve uç elektronik olarak titreştirilerek hücrelere yerleştirilir; hücrelere giriş yapmak için fiber optik boru veya video ekranı aracılığıyla ışık uyaranları verilir.

At nalı yengeci gözünde üç tip hücre ile karşılaşılabilir: ular hücreler, eksantrik hücreler ve pigment hücreleri; ular hücreler ışığa karşı büyük bir depolarizasyon yanıtı verir, eksantrik hücreler depolarizasyon yanıtı üzerinde bir dizi aksiyon potansiyeli sergiler ve pigment hücreleri ise ışığa karşı hiçbir yanıt vermez. Yanıt, bir osiloskop üzerinden gözlemlenir ve intraretinal kayıtlar ile bir bilgisayara kaydedilir. Bu sayede görmenin hücresel temeli incelenebilir.

Sonuç olarak, at nalı yengeçlerde in vivo olarak elektroretinogram kayıtlarının, optik sinir kayıtlarının ve intraretinal kayıtların nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Bu yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır ve at nalı yengeçlerdeki görsel bilgi işlemenin nöral mekanizmalarına dair benzersiz bilgiler sunmaktadır. Bu yöntemler sadece bir araştırma laboratuvarında uygulanması kolay yöntemler olmakla kalmaz, aynı zamanda görsel nörofizyoloji üzerine kurulu bir eğitim laboratuvarına da kolayca entegre edilebilirler.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.