Name: Horseshoe Yengeç kullanarak, Limulus Polyphemusun Vizyon Araştırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Öğrenin, Limulus Polyphemus kullanarak görme sinirbiliminde elektrofizyolojik kayıt tekniklerini. Elektroretinogram, optik sinir ve intraretinal kayıtlarla görsel işleme mekanizmalarını keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ile ona yardım için bu video makale üreten Dr. Birgit Werner kabul etmek istiyorum. Bu araştırma, bir NSF KARİYER Ödülü tarafından finanse edildi.

Bölüm 1: Deneysel Hazırlık At nalı yengeçleri üzerinde yapılan deneysel prosedürleri Boston Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar düzenlenmiş bir ışık-karanlık döngüsüne maruz kalan bir oda Deniz Biyoloji Laboratuarları (Woods Hole, MA) veya başka bir satıcı satın alınan ve gazlı bir tuzlu su tankı ev sahipliği yapmaktadır. Aydınlatma rejimi yengeç sirkadiyen saat sürükleyici ve gündüz ve gece devletler arasındaki günlük göz bisiklet için önemlidir. Iki paslanmaz çelik zehir yerleştirilen vida ve opisthosoma iki hareketi yavaşladı ve daha sonra tahta bir platform sağlanana kadar hemen hiçbir invaziv işlemler başlamadan önce, hayvan, 10-15 dakika süreyle bir buz kovası soğuk. Su lavabolar, böylece platform granit altında ağırlıklı. Terminal deneylerden sonra hayvan yine buz bulamaç içine çeker ve bir neşter ile ağız yukarıda yer alan beyin, pithing tarafından ötenazi. Bölüm 2: Çözümler Limulus Zil Kullanıcı çözümü 430 mm NaCl, 9.56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9.97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50μM TES, 50μM Hepes, ve 10 ml / L Kalem-Strep mix (Penisilin-Streptomisin, 10000 birimleri / ml) oluşur . Bölüm 3: elektroretinogram Kaydı Bu prosedür için gerekli araçlar, tornavida, vazelin, Ringer solüsyonu, bir transfer pipeti yeşil bir LED, bir kayıt odası, paslanmaz çelik vida ve bir pamuklu çubukla. <ol><li> Bir el yapımı oda ERG (Şekil 1A) kaydetmek için kullanılır. Odasına vücut, göz ile temas halinde tuzlu su rezervuar tutmak için tasarlanmıştır. Kapak, bir LED barındıracak büyüklükte bir amplifikatör ve küçük bir delik iletken çözüm bağlamak için gümüş klorür tel içerir. 520Nm çevresinde tepe emisyon LED bir yanabilme Ultraparlak iyi çalışır. </li><li> Başlatmak için, odanın alt vazelin ile kaplı ve iki adet vida ile göz üzerinde güvenli bir. </li><li> Odasına sonra tuzlu su ile doldurulur ve kapak ile kapatılmış. </li><li> Odasına eklenti sonra yengeç, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir. </li><li> LED kablo haznesi kapağının içine eklenir. </li><li> Sinyal kurşun klorür tel kırpılır ve referans kurşun implante vidalar kırpılır. </li><li> Her iki yol açar sinyal amplifikasyonu ve amplifikatör filtresi 10Hz altındaki frekanslarda geçmek için yüksek empedans diferansiyel amplifikatör başkanı evre (X-cell 3x4, FHC Inc.) Bağlanır. </li><li> Amplifikatör çıkışı görüntülemek için bir osiloskop ve bilgisayar analizi ve depolanması için bir veri toplama kuruluna beslenir. </li><li> Kurulumundan sonra kafes kapı, oda ışığında hayvan ulaşmasını engellemek için kapalı. </li><li> Veri LabView yazılmış özel bir program ile toplanır. Programı, LED yanıp söner, uyarılmış ERG sinyal kayıtları, ve tepeden-tepeye tepki genlik önlemler. Flaş paradigmanın seçim deneysel hedef bağlıdır. Örneğin, kısa bir 5V (100ms) darbe, uygulanan her 10 dakikada bir LED ışık uyum etkileri göz hassasiyeti sirkadiyen değişiklikleri izleme önler. </li></ol> Bölüm 4: Optik sinir kayıt Bu işlem için gerekli araçlar, bir tornavida, iplik, trefin, Ringer solüsyonu, rongeurs, vannas makas, bir kayıt odası, kavisli bir forseps, ince iğne probları, sıkıcı bir neşter, cerrahi makas ve bir emme elektrot içerir. <ol><li> Bir el yapımı oda, optik sinir yanıtları (Şekil 1B) kaydetmek için kullanılır. Odasının iç sinir karşılamak ve onu çevreleyen doku izole alt duvarında ince bir yarım daire oluklu açılış 2cm çaplı açık kuyu. </li><li> 16-gauge iğne oda takmadan önce kalbin içine menteşe kaslar arasındaki eklenir ve kan ~ 20cc hayvan boşaltılır. Exsanguination gerekli değil ama optik sinir diseksiyonu kolaylaştırır. </li><li> Optik sinir konumu karapaksta lateral ve median gözler arasında hafif kavisli bir çizgi çizerek tahmin edilmektedir. </li><li> Dairesel bir delik daha sonra bir trefin karapaksta kesilir. Delik de oda olarak aynı çapa. 2-3 cm lateral göz ve sinir iyi ventral kısmı boyunca uzanan hat böylece biraz dorsal anterior deliğin merkezi yer almaktadır. </li><li> Bağ dokusu, sinir tamamen görünür ve çevresindeki doku ve altta yatan ücretsiz kadar temizlenir. </li><li> Thread bir iplikçik sinir çevresinde dolanmıştı ve altındaki yuvası ile odasına çekilir. Bu aynı açıklıktan sinir hafifçe dize çekerek odasına yönlendirilir. Aynı zamanda odanın deliğe sokulur. Odasının karapaksta sonra yapıştırılmıştırvida ve iyi Ringer solüsyonu ile doludur. </li><li> Odasına eklenti sonra hayvan, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir. </li><li> Kuyu Stereoskop (SMZ-168, Jed Pella Inc) ve pamuk odasının içine ya da dışına ve tuzlu kan sızıntısını önlemek için alt açılış etrafında doldurulur altında görüntülenmiştir. </li><li> Artık sinir çevresinde bağ dokusu ince makas ve cımbız ile kaldırılır ve oda taze Ringer solüsyonu ile doldurulur. </li><li> Bir nick bu açıklıktan sinir dikkatle, ince makas, cımbız, iğne probları kullanarak uzunluğu boyunca desheathed, sinir kapsüller ve kan damarı yapılır. </li><li> Küçük bir elyaf demeti, afferent lif kayıt için göz uzak sonunda ve efferent lif kayıt için göze yakın sonunda prob ve kesme kullanarak sinir ayrılır. Video afferent lif kayıtları için son kesilir. </li><li> Zil çözümü ile dolu bir microsuction elektrot (AM Sistemleri A.Ş.), optik sinir kayıt için kullanılır. Elektrot ucu 1mm çapında borosilikat cam sonuna kapiller parlatma yangın sinir demetine takılmıştır. </li><li> Elektrot ucu manuel manipülatör (TEFE A.Ş.) ile de odasına indirdi ve kesik elyaf demeti ucu içine çekilir. Emme boru üzerinden elektrot bağlı bir Gilmont şırınga tarafından sağlanmaktadır. </li><li> Bir BNC bağlantısı sinyal yol sağlar ve gürültüyü azaltmak için elektrot sarılı bir gümüş klorür tel referans kurşun sağlar. İki yol açan sinyal amplifikasyon ve gürültü filtreleme (X-cell 3x4, FHC Inc.) Için bir diferansiyel amplifikatör başkanı sahneye bağlanır. Amplifikatör çıkışı bir osiloskop bilgisayar analizi ve depolama için görüntüleme ve veri toplama kartı gönderilir. </li><li> Veri LabView yazılmış özel bir program ile toplanır. Program, bir dijital video işlemcisi ile hafif uyaranlara kontrol (Bit + +, Cambridge Araştırma Sistemleri A.Ş.) ve başak trenler kayıtları dijital başak discriminator (APM, FHC A.Ş.) arayüzleri. Işık, bir fiber optik ışık borusu yoluyla ya da tüm göz göz, bilgisayar kontrollü bir video ekranı üzerinden tek hücrelere teslim edilebilir. </li></ol> Bölüm 5: İntraretinal kayıt Bu prosedür için gerekli araçlar, bir tornavida, dişli vida delikleri ile L şeklinde Lucite platformu, bir cam pipet ile mikroelektrot tutucu, paslanmaz çelik vidalar, cımbız, ve ince bir neşter. <ol><li> Lucite, önceden ayarlanmış vida deliklerini bir el yapımı tabak intrasellüler yanıtları kaydetmek için kullanılır. Delikleri motorlu mikromanipülatör (PPM5000, TEFE Inc) montaj için aralıklı. Plaka tarafta iki vida ve üstüne bir hayvan eklenir. </li><li> Plaka eklenti sonra hayvan, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir. </li><li> Micropositioner gözün üzerine dizilen hareketli kol ile plaka içine vidalanır. </li><li> 1-mm OD borosilikat cam, cam mikropipetler bir parti çekti ve ipuçları 3M KCl çözeltisi küçük bir flakon mikropipetler koyarak kapiller eylem yoluyla yeniden toprakla. </li><li> Pipetler geri kalanı daha sonra elle tuz çözeltisi ile doldurulur ve bir elektrot tutucu içine yerleştirilir. </li><li> Elektrot tutucu micropositioner koluna iliştirilmiş bir hücre içi amplifikatör başkanı evre (IR-283, Cygnus Technology Inc) bağlıdır. </li><li> Retinanın küçük bir bölümü (yaklaşık 1mm2), bir jilet ile kornea arayüzü keserek maruz kalmaktadır. </li><li> Kurumasını önlemek ve mikropipet ucu retina dokusunun içine açıklığından ileri bir damla Ringer çözeltisi maruz retina üzerine yerleştirilir. </li><li> Ucu çözüm girdiğinde, hücre içi amplifikatör mevcut enjeksiyon modu devreye girer ve elektrot empedansı ölçülür. 20-70 MW aralığının dışında empedansı ile mikropipetler atılır. Bu aralıkta olanlar mikron adım ileri, elektronik ya da mekanik pipet titreşimli hücre içine kazığa. </li><li> Üç tip hücrelerin göz karşılaştı olabilir. Retinular hücreleri sadece ışığa karşı bir depolarizan tepki gösterir, eksantrik hücreleri depolarize yanıt sürme aksiyon potansiyelleri bir tren ve pigment hücreleri hiç ışık tepki gösteriyor. </li><li> Veri Labview yazılmış özel bir program ile toplanır. Programı, bir dijital video işlemci (Bit + +, Cambridge Araştırma Sistemleri) ile hafif uyaranlara kontrol eder. Uyaranlar, bir fiber optik boru veya video gösterimi ile kazığa hücrelerine teslim edilir. Voltaj yanıtları osiloskop gözlenen ve bilgisayar programı tarafından sayısallaştırılmış. </li></ol> Bölüm 6: Temsilci Sonuçlar Bir temsilci ERG Şekil 2A gösterilecek. Dalga özetlenebilir elektrik temsil ederöncelikle photoreceptive retinular hücrelerin ışığa tepki, büyük ölçüde eksantrik hücreleri sayıca daha fazla ve elektrikle akuple. Memeli ERG gibi farklı retinal hücre tipleri birden fazla dalga şekli bileşenleri yoktur. Limulus beyinde bir saat Sirkadiyen geribildirim, günlük bazda retina hücrelerinin zaman içinde değişebilir (1) ERG genlik ve zaman içerisinde neden fizyolojik özellikleri modüle eder. Şekil 2B gösterildiği gibi, ERG genlik öznel gün boyunca hayvan öznel gece ve en düşük sırasında en yüksek olduğu. , Işık tek bir optik sinir lifi yanıtı bir temsilcisi iz Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Eksantrik hücreleri sürekli bir seviyeye bir çürüme tarafından takip başak deşarj oranı geçici bir artış göstererek, kabaca aynı şekilde davranır. Oranı çürüme, ışık uyum ve başak bağımlı self-inhibisyon eksantrik hücreleri (2) birleşik eylem yansıtır. Işık bağımlı oranı azalır gibi diğer başak desen, Limulus beyin görülen ama göz değil (3). Pigment hücresi, retinular hücre ve eksantrik bir hücrenin ışığa gerilim yanıt Temsilcisi izleri Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Sadece son iki retinal hücre tipleri görsel. Tepki genlik ve zaman ders kayıt kalitesi ve elektrot hücre içindeki yerini bağlıdır. Genellikle, elektrot, büyüklüğü ve sayısı nedeniyle pigment hücreleri veya retinular hücreleri nüfuz eder. Ikincisi, sürdürülebilir bir seviyeye çürükleri geçici bir depolarizasyon kaydedilir. Çürüme retinular hücreleri tarafından hafif adaptasyon (2) kaynaklanmaktadır. Elektrot eksantrik hücre girerse, büyük aksiyon potansiyelleri, akson (40-70mV) ve soma (&lt;25mV) yakın bir depolarizan dalga şekli sürme küçük aksiyon potansiyelleri kaydedilir. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 elektroretinogram kayıt (A) ve optik sinir kayıt (B) için kullanılan odaların şematik diyagramları. Bar 7mm eşittir B. A ve 5mm <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Örnek bir 100ms tarafından uyarılmış bir Limulus ERG izleme karanlıkta 5V nabız (A) ve sürekli karanlıkta zamanla ERG genlik tepe tepe dalgalanması (B) LED. Karanlık beyaz üçgen tarafından belirtilen süre başlandı. ERG genlik siyah üçgen tarafından belirtilen zaman içinde büyüme ışık adaptasyon, karanlıkta göz hassasiyetini artırır. ERG genlik siklik değişkenlik bundan sonra hayvanın iç sirkadiyen saat nedeniyle. B Zaman her 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 Örnek bir optik sinir lifi yanıt iz, tek bir ommatidial reseptör parladı ışık . Iz üzerinde Waveform uyaran zamanlama gösterir. Aksonlar sinir lifleri doğuran Eksantrik hücreler, tüm aydınlatma koşulları altında deney (toplam karanlıkta 5sn flaş) bu kadar ateş benzer bir model göstermektedir. Retina kodlama ile ani bir özellik Limulus diğer omurgasızlar aksine, memeliler ile ortak. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 gerilim yanıt Örnek izleri Limulus lateral göz bulunan üç hücre tiplerinin ışık: pigment hücresi (A), retinular hücre (B) ve eksantrik hücre (C) . Ilk hücre görsel olmayan. Son iki ışık yanıp üzerine depolarize. Işık transduce ve eksantrik bir hücreye gap junction ile sinyal göndermek için depolarizasyon yol boyunca bazı kaybı, retinular hücreler için büyük. Eksantrik hücre, akson tarafından ateş aksiyon potansiyelleri soma içine başak geri yayılım nedeniyle depolarizasyon sürme görülür. Aksiyon potansiyellerinin genlik depolarizan potansiyeli daha iyi görüntüleme için bu rakam zayıflatılmış olmuştur. Hücrelerin dinlenme potansiyeli-50mV.

<ol><li>Barlow, R. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li>
<li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li>
<li>Snodderly, D. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li>
<li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+a+neural+code+for+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li>
<li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limulus+lateral+eye%3A+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li>
<li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li>
</ol>

Biz, ERG kayıtları, optik sinir kayıtları ve in vivo olarak at nalı yengeçleri intraretinal kayıtları nasıl gerçekleştirebileceğimizi gösterdi var. Kayıt teknikleri her nöral temeline ilişkin vizyon, farklı bakış açıları sağlamak ve hepsi yengeç büyük gözleri ve sert karapaksla canlı hayvanlar sayesinde retina fonksiyonunu incelemek için kullanılabilir. Optik sinir aktivitesi elektrot uygun inşaat (4) ile özgürce okyanus hayvanları davranmaya bile kaydedilebilir. Bu teknikler, aynı zamanda kurulum küçük değişiklik ile e...

<table><tbody><tr><td>LED</td><td>Işık kaynağı</td><td>Newark Inc</td><td>33C1292</td><td></td></tr><tr><td>Vakum elektrodu</td><td>Elektrot</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>XCell 3*4 Kanallı Ekstrasellüler Amplifikatör</td><td>Amplifikatör</td><td>FHC, Inc.</td><td>40-40-8B</td><td></td></tr><tr><td>Hücre İçi Kayıt</td><td>Amplifikatör</td><td>Cygnus</td><td>IR-283A</td><td></td></tr><tr><td>APM</td><td>Nöral Spike Ayırıcı</td><td>FHC, Inc.</td><td>APM</td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Video Panosu</td><td>Cambridge Research Systems</td><td>Bits++</td><td></td></tr><tr><td>Piezoyama Manipülatörü</td><td>Mikrokonumlandırıcı</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PPM5000</td><td></td></tr><tr><td>Kare Dalga Stimülatörü</td><td>Sinir Stimülatörü</td><td>Ot Teknolojileri</td><td>Model S48</td><td></td></tr><tr><td>P-97</td><td>Mikropipet Çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat Cam Kılcal Boru</td><td>Elektrot camı</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Atlar&amp;#8211; yengeç (&lt;Elektron Mikroskobu&gt;Limulus polyphemus&lt;/em&gt;)</td><td>Hayvan</td><td>Deniz Biyoloji Laboratuvarları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Çekici</td><td>Cam Çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Zoomlu Stereoskop</td><td>Mikroskop</td><td>Jed Pella Inc.</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr></tbody></table>

horseshoe yengeç kullanarak, limulus polyphemus&#39;un vizyon araştırma

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Amerikan at nalı yengeci, Limulus Polyphemus&#39;un, dünyanın en eski canlıların biridir ve hayvan biyomedikal araştırma vazgeçilmez bir rol oynamaya devam etmektedir . Onların kan değil, sadece bilim adamları ilaçların bacteriotoxins algılamak için kullandığı özel hücreler içeren, ama onların gözleri de ışık adaptasyon ve yanal inhibisyonu gibi fizyolojik süreçleri, görsel sistem faaliyet hakkında daha fazla fikir sağlanan bir sinir ağı yapar. At nalı yengeci, hayvan, büyük ve cesur bir omurgasız olduğundan, retinal nöronların büyük ve kolayca erişilebilir görme araştırma için çekici bir model olmaya devam ediyor, görme sistemi, kompakt ve yoğun çalışılan ve görsel davranış iyi tanımlanmıştır. Ayrıca, gözlerin yapısı ve fonksiyonu, hayvanın beyninde bir sirkadiyen saat bir günlük bazda modüle. Kısacası, at nalı yengeçleri görme sistemi yeterince basit ama ilginç olacak kadar karmaşık anlaşılmalıdır. Bu video Limulus in vivo olarak yapılabilir görme nöral temelini araştırmak için üç elektrofizyolojik paradigmalar sunuyoruz. Onlar elektroretinogram kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt. Bir yüzeye sahip elektroretinografi (ERG) kayıtları tedbir, tüm hücreleri bir ışık yanıp sönmeye göz özetlenebilir elektriksel tepki elektrodudur. Onlar zaman uzatmak süreler için göz genel duyarlılığı izlemek için kullanılabilir. Optik sinir kayıtları ekstraselüler microsuction elektrot ile tek sinir liflerinin spike aktivitesini ölçmek. Göz, beyin gibi beyin göz geri beslenen sirkadiyen saat mesajları iletilir görsel mesajları okumak için kullanılabilir. Intrasellüler mikroelektrot İntraretinal kayıtları önlem voltaj dalgalanmaları göz bireysel hücrelerin ışık ile indüklenen. Onlar retina işleme hücresel mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir.

Bu videoda, Amerikalı at nalı yengeci elektroretinogram kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt gerçekleştirmek<em&gt; Limulus Polyphemus&#39;un</em&gt;. Bu elektrofizyolojik paradigmalar, bir araştırma veya öğretim laboratuvar görme nöral temeli soruşturma için kullanılabilir.

Horseshoe Yengeç kullanarak, Limulus Polyphemus&#39;un Vizyon Araştırma

Amerikan nal göbeği *Limulus polyphemus*, dünyadaki en eski canlılardan biridir ve bu hayvan ... konusunda vazgeçilmez bir rol oynamaya devam etmektedir.

Merhaba, ben Chris Paglia, Boston Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'ndeki Görsel Bilgi İşleme Laboratuvarı'nın direktörüyüm. Merhaba, ben Dr. Paglia'nın laboratuvarında doktora öğrencisi olan Jacque Liu. Laboratuvarımızın araştırma çalışmaları, hayvanların görmesini sağlayan nöral hesaplamaları anlamaya yöneliktir.Bu araştırma için, yeryüzündeki en eski canlılardan biri olan Amerikan nal yengecini kullanıyoruz. Bu hayvanlar yaşayan fosiller olabilir; ancak biyomedikal araştırmalarda vazgeçilmez bir rol oynamaya devam etmektedirler.Kanları, bilim insanlarının ilaçlarımızdaki bakteri toksinlerini tespit etmek için kullandıkları özel hücreler içermenin yanı sıra, gözleri de görme sistemimizin nasıl çalıştığına dair pek çok bilgi sağlayan bir sinir ağına sahiptir. Işık adaptasyonu ve lateral inhibisyon gibi süreçlerin hücresel temelleri ilk olarak hayvanın bileşik lateral gözleri üzerine yapılan çalışmalarda ortaya çıkarılmıştır ve bu öncü çalışma nedeniyle Dr. Keffer Hartline 1967 yılında Nobel Ödülü almıştır. At Nalı Yengeç, bir omurgasız için büyük ve dayanıklı olması, retinal nöronlarının iri ve kolayca erişilebilir olması nedeniyle görme araştırmaları için cazip bir model olmaya devam etmektedir.Görsel sistemi kompak olup kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır ve görsel davranışı iyi tanımlanmıştır. Ayrıca, gözlerin yapısı ve işlevi, hayvanın beynindeki sirkadiyen bir saat tarafından günlük olarak modüle edilir. Kısacası, at nalı yengeçlerinin görsel sistemi, anlaşılacak kadar basit ancak ilgi çekici olacak kadar karmaşıktır.Bu videoda, bu klasik hayvan modeliyle in vivo olarak gerçekleştirilebilen, görmenin nörolojik temelini araştırmak için kullanılan üç deneysel paradigmayı örneklendireceğiz. Görme araştırmaları için bunlar; elektroretinogram kaydı, optik sinir kaydı ve intraretinal kayıttır. At nalı yengeçleri, düzenli bir ışık-karanlık döngüsüne maruz bırakılan bir odada, havalandırılmış tuzlu su tanklarında tutulmaktadır.Bu kayıt tekniklerinden herhangi birine başlamadan önce, hayvanlar yaklaşık 10 dakika boyunca buz kovasında soğutulmuş ve ardından pro soma kısmına iki, EPIs soma kısmına ise iki paslanmaz çelik vida yerleştirilerek ahşap bir platforma sabitlenmiştir. Platformun altına, suyun içinde batmasını sağlamak için granit ağırlık konulmuştur. Göz hassasiyetini zaman içinde izlemek için elektroretinogram veya ERG kullanılır.Gözdeki tüm hücrelerin toplam elektriksel yanıtını ölçer. Işık çakması uygulaması için bu prosedürde gerekli olan araçlar arasında bir tornavida, vazelin, ringer çözeltisi, bir pipet, bir LED, bir kayıt odası, paslanmaz çelik vidalar ve bir pamuklu çubuk yer alır. ERG ölçümü için kendi yapımımız olan bir kayıt odası kullanıyoruz.Gövde, gözle temas halinde bir salyine rezervuarı tutacak şekilde tasarlanmıştır. Kapak, iletken çözeltiyi bir amplifikatöre bağlamak için gümüş klorür tel ve ekleme öncesinde bir LED'in yerleştirilebileceği boyutta küçük bir delik içerir. Haznenin alt tarafı vazelin ile kaplanmıştır.Ardından, At nalı yengeci gözü üzerine iki vida ile sabitlenen odacıklar salin ile doldurulur ve kapakları kapatılır. Hayvan, solungaçları suyun altında kalacak şekilde deniz suyuyla dolu bir tanktaki ışık sızdırmaz bir kafese yerleştirilir. LED kablosu odacık kapağına yerleştirilir.Sinyal kablosu oda teline, referans kablosu ise implante edilen vidalardan birine takılır ve her iki kablo, sinyal amplifikasyonu ve gürültü filtreleme için yüksek empedanslı bir diferansiyel amplifikatörün baş aşamasına bağlanır. Ardından, oda ışığının hayvana ulaşmasını engellemek için kafes kapatılır. AD aşaması amplifikatöre bağlanır ve amplifikatör filtreleri yaklaşık 10 hertz altındaki frekansları geçirecek şekilde ayarlanır.Buradan sinyal, görüntüleme için osiloskopa ve bilgisayarla analiz ve depolama için bir veri toplama kartına aktarılır; LED'den ışık stimülasyonları sağlamak ve ERG sinyalini kaydetmek için LabVIEW ile yazılmış özel bir program kullanıyoruz. LED, her 10 dakikada bir 5 V'luk 100 milisaniyelik bir darbe ile tetiklenir. Solda, her bir ışık flaşına verilen ERG dalga formu görüntülenmiş; sağda ise göz hassasiyetindeki zamanla meydana gelen değişiklikleri izlemek için ardışık flaş dalga formlarının tepe-tepe genliği çizilmiştir.ERG kayıtları ile ışık adaptasyonunun ve sirkadiyen nöral modülasyonun etkileri incelenebilir. Göz, görsel mesajları ve optik sinir liflerinin spike yanıtlarını beyne iletir. Kodlanmış mesajlar, tekil sinir liflerinden hücre dışı kayıtlar alınarak çalışılabilir.Bu yöntemle, göze geri beslenen sirkadiyen saat mesajları da incelenebilir. Bu prosedür için gerekli araçlar arasında bir tornavida, ring çözeltisi, makaslar, bir kayıt odası, kavisli pensler, ince bir iğne prob, küt bir bistüri, cerrahi makaslar ve seksiyonel bir elektrot yer alır. Siniri yerleştirmek için bir dile sahip kayıt odaları tasarlanmıştır; 20 mililitre kan, menteşe kasları ile kalbe doğru 16 gauge bir iğne yerleştirilerek attan boşaltılabilir.Kan boşaltma gerekli değildir, ancak hayvan platforma sabitlendiğinde optik sinir dissection işlemini kolaylaştırır. Optik sinirin konumu, lateral ve median gözler arasında karpus üzerine hafif kavisli bir çizgi çizilerek tahmin edilir. Daha sonra, karpus üzerinde bir refin ile dairesel bir delik açılır.Delik, oda tabanıyla aynı çapta olur. Deliğin merkezi, lateral gözün yaklaşık iki santimetre anteriorunda ve sinirin oda tabanının ventral kısmı boyunca uzanacağı şekilde çizginin hafifçe dorsalinde yer alır; bağ dokuyu örten kısım, sinirin tam uzunluğu görünene kadar temizlenir ve açığa çıkan sinir, çevresindeki ve altındaki dokulardan serbestleştirilir. Bir iplik parçası sinirin etrafından geçirilerek tabandaki yarım daire şeklindeki açıklıktan oda içerisine çekilir.Aynı açıklık aracılığıyla, ipe çekilerek sinir nazikçe kamaraya yönlendirilir. Sinir kamaraya girerken, sinir üzerindeki gerilmeyi minimize etmek amacıyla kamara tabanı deliğe doğru itilir. Ardından kamara iki vida ile sabitlenir ve Ringer solüsyonu ile doldurulur.Kamber takıldıktan sonra hayvan, solungaçların üzerinde kalacak şekilde deniz suyuyla doldurulmuş bir tanktaki hafif sıkı bir kafese yerleştirilir. Kamber içi stereoskop altında görüntülenir ve kamber içine kan sızıntısını, kamberden ise Ringer çözeltisi sızıntısını önlemek için alt açıklığın etrafı pamukla desteklenir. Kamber, taze Ringer çözeltisi ile yeniden doldurulur.Kalıntı dokular ince kavisli makas ve pensetler yardımıyla temizlenir. Siniri çevreleyen kılıfta küçük bir kesi yapılır ve sinir, ince bir iğne probu ile kılıftan ayrılır. Kılıf, sinir boyunca boyuna kesiler yapılarak kademeli olarak açılır ve çıkarılır.Ardından, prob kullanılarak sinirden küçük bir lif demeti ayrılır ve gözden en uzak uçtan afferent lif kaydı için, göze en yakın uçtan ise efferent lif kaydı için kesilir. Kayıt için, vakumlama amacıyla bir Gilman şırıngasına tüplerle bağlı olan ve Springer solüsyonu ile doldurulmuş bir AM sistem seksiyon elektrodu kullanılır. Elektrot ucu, 1 mm çapındaki bir borosilikat cam kapiler ucunun ateşle cilalanmasıyla hazırlanır; B ve C bağlantıları sinyal iletkenini sağlar ve gürültüyü azaltmak için elektroda sarılmış bir gümüş klorür teli referans iletkeni oluşturur.Elektrot ucu kayıt odasına yerleştirilir ve sinir demetinin kesik ucu, vakum aracılığıyla cam ucun içine çekilir. Sinyal ve referans uçları, sinyal amplifikasyonu ve gürültü filtrelemesi için diferansiyel bir amplifikatörün kafa katına bağlanır. Amplifikatör çıktısı, görüntüleme için bir osiloskopa ve bilgisayar analizi ile depolama için bir veri toplama kartına aktarılır.Işık stimülasyonlarını kontrol etmek için LabVIEW ile yazılmış özel bir program ve spike dizilerini kaydetmek için dijital bir spike diskriminatörü kullanıyoruz. Tek hücre aydınlatması için fiber optik bir ışık borusu kullanılırken, optik sinir kayıtları ile patern stimülasyonu için bilgisayar kontrollü bir video ekranı kullanılmaktadır; böylece gözler ve beyin arasındaki sinyal iletimi intraretinal olarak incelenebilir. Kayıt işlemi, bir mikro elektrodun doğrudan gözdeki hücrelere yerleştirilmesini ve ışığın tetiklediği hücre içi voltaj dalgalanmalarının kaydedilmesini içerir.Bu prosedür için gerekli araçlar arasında bir tornavida ve L şeklinde şeffaf bir platform yer almaktadır. Cam elektrodun üzerinden geçecek bir mikro elektrot için dişli vida delikleri, paslanmaz çelik vidalar, cımbız ve ince uçlu bir bisturi kullanılır. Yengeç sabitlendikten sonra; iki yanına ve üst kısmına bir adet olmak üzere toplam üç vida ile önceden belirlenmiş vida deliklerine sahip şeffaf bir plaka, karpusa sabitlenir.Hayvan, solungaçları kaplayacak şekilde deniz suyuyla doldurulmuş bir tank içindeki ışık sızdırmaz bir kafese yerleştirilir. Motorlu bir mikro konumlandırıcı, vidalarla bıçak kısmına sabitlenir ve konumlandırıcı kol göz üzerine hizalanır. Bir grup cam mikro pipet, bir milimetre dış çaplı silikat camdan çekilir ve uçları kılcal etkiyle doldurulur.Pipetler birkaç dakika boyunca üç molar potasyum klorür çözeltisi içeren bir şişeye yerleştirilerek, pipetin geri kalanı tuz çözeltisi ile manuel olarak doldurulur ve kabarcık oluşumunu önlemek için önceden çözelti ile doldurulmuş bir mikro elektrot tutucuya yerleştirilir. Ardından elektrot tutucu, mikro konumlandırıcıya sabitlenmiş bir hücre içi amplifikatörün kafa aşamasına yerleştirilir. Dorsal korneadan küçük kare bir kesit dikkatlice kesilerek çıkarılarak retinanın bir bölümü açığa çıkarılır.Skalpel kullanılarak, kurumayı önlemek amacıyla açığa çıkarılan doku üzerine bir damla Ringer Solüsyonu yerleştirilir ve mikropipet retinaya doğru ilerletilir. Pipet ucu solüsyona temas ettiğinde, hücre içi amplifikatörün mevcut enjeksiyon modu devreye alınır ve elektrot empedansı ölçülür; 20 ile 70 mega ohm aralığının dışındaki empedans değerlerine sahip mikropipetler elenir. Bu aralıktaki pipetler, mikron boyutundaki adımlarla retinaya doğru ilerletilir ve uç elektronik olarak titreştirilerek hücrelere yerleştirilir; hücrelere giriş yapmak için fiber optik boru veya video ekranı aracılığıyla ışık uyaranları verilir.At nalı yengeci gözünde üç tip hücre ile karşılaşılabilir: ular hücreler, eksantrik hücreler ve pigment hücreleri; ular hücreler ışığa karşı büyük bir depolarizasyon yanıtı verir, eksantrik hücreler depolarizasyon yanıtı üzerinde bir dizi aksiyon potansiyeli sergiler ve pigment hücreleri ise ışığa karşı hiçbir yanıt vermez. Yanıt, bir osiloskop üzerinden gözlemlenir ve intraretinal kayıtlar ile bir bilgisayara kaydedilir. Bu sayede görmenin hücresel temeli incelenebilir.Sonuç olarak, at nalı yengeçlerde in vivo olarak elektroretinogram kayıtlarının, optik sinir kayıtlarının ve intraretinal kayıtların nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Bu yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır ve at nalı yengeçlerdeki görsel bilgi işlemenin nöral mekanizmalarına dair benzersiz bilgiler sunmaktadır. Bu yöntemler sadece bir araştırma laboratuvarında uygulanması kolay yöntemler olmakla kalmaz, aynı zamanda görsel nörofizyoloji üzerine kurulu bir eğitim laboratuvarına da kolayca entegre edilebilirler.İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

using-the-horseshoe-crab-limulus-polyphemus-in-vision-research

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Amerikan at nalı yengeci, Limulus Polyphemus'un, tartışmalı, büyük miktarda herhangi bir omurgasız kan için en uygun bir kaynağıdır. Kan genel dolaşımı, granül amebocyte ve plazma, hemosiyanin, C-reaktif protein ve α2-makroglobulin sadece üç bol protein sadece tek bir hücre tipi, kompozisyon basit. Kan kalpten toplanır ve kan hücreleri ve plazma santrifüj ile ayrılır.

Amerikan Horseshoe Yengeç, Limulus Polyphemus&#39;un Kan Toplama

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Diseksiyon tekniği high-throughput ekranlarında fenotipleme gerçekleştirmek için doku fiksasyonu fare gözün enükleasyonu göstermektedir.

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

Bu video, bir kelebeğin gözündeki fotoreseptör hücrelerinin in vivo hücre içi kaydı ve tek tek hücre tiplerinin spektral duyarlılığının belirlenmesi prosedürünü göstermektedir. Bu teknik, bireysel fotoreseptör hücrelerinin farklı ışık uyaranlarına duyarlılıklarının incelenmesini sağlar.

Bir Kelebekte Fotoreseptör Hücre Spektral Duyarlılığının İn Vivo Hücre İçi Kaydı

Xenopus tadpoles siyah / beyaz tankın beyaz tarafında yüzme tercih laevis'den. Bu davranış, onların vizyonu tarafından yönlendirilir. Bu davranışa dayanarak, iribaşların görme fonksiyonunu test etmek için basit bir test sunuyoruz.

Test Görsel Fonksiyonu için Basit Bir Davranış Testi<em&gt; Xenopus laevis</em

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

hücre içi kayıt elektrofizyolojik teknik gösterdi ve bir kelebeğin bileşik gözünde tek fotoreseptör hücrelerinin spektral hassasiyetlerini belirlemek için kullanılır.

bir Böcek Modeli fotoreseptör hücre spektral Duyarlılık Belirlenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre içi Kayıtlar

Kerevit fotoreseptörlerinin sirkadiyen zamanın bir fonksiyonu olarak duyarsızlaştırma ve duyarlılık geri kazanımı için bir protokol sunulmuştur.

Bir Işık Uyaranteslimi Üzerine Kerevit Fotoreseptörlerinin Duyarsızlaştırılması ve İyileştirilmesi

Fare vizyonu incelemek için, biz bir giderek test yaptı. Fareler tavan üzerinde bir monitör ile büyük bir kare arenada yerleştirildi. Giderek yükselen görsel uyarıcı, farelerde sürekli olarak donma veya uçuş reaksiyonlarını uyarmaktadır.

Fare vizyonu değerlendirmek için görsel stimuli Looming kullanma

Makale, retinal girdinin optik tektum büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaya yönelik ilk adım olarak canlı zebra balığı larvalarından gözlerin cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Ek olarak, makale larva anesteziizasyonu, fiksasyon ve beyin diseksiyonu, ardından immünohistokimya ve konfokal görüntüleme hakkında bilgi vermektedir.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Anestezi uygulanan dişi yengeçler üzerinde iki göz konuşması ablasyon protokolü (yani koterizasyon ve cerrahi yaklaşımlar) uygulandı. Çamur yengeçlerinin göz konuşması ablasyonu, hayatta kalma oranını düşürmeden yumurtalıkların olgunlaşmasını hızlandırdı.

Çamur Yengeçlerinde Yumurtalık Olgunlaşmasını Artırmak için Göz Sapı Ablasyonu

Öğrenin, Limulus Polyphemus kullanarak görme sinirbiliminde elektrofizyolojik kayıt tekniklerini. Elektroretinogram, optik sinir ve intraretinal kayıtlarla görsel işleme mekanizmalarını keşfedin.

Horseshoe Yengeç kullanarak, Limulus Polyphemus'un Vizyon Araştırma

Daha fazla video keşfet