Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

Merhaba, ben Marcus to British Columbia Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Steven Helm'in laboratuvarından. Bugün size büyük bir kesici uç çevre kitaplığının inşası için bir prosedür göstereceğiz. Bugünkü prosedürde bana yardımcı olan, kütüphane ev sahibi e coli'nin faj paketlemesini ve enfeksiyonunu gerçekleştirecek olan San Lee'nin yanı sıra koloni toplamayı gerçekleştirecek olan Elise Hawley ve Chin Yang.

Deniz ve karasal ortamlarda mikrobiyo, topluluk yapısı ve metabolizmasını incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü uyguluyoruz. Öyleyse başlayalım. Bir fo smid DNA kütüphanesi oluşturmak için bu protokol, eşlik eden Jo makalelerinde ayrıntılı olarak açıkladığımız biyokütle örneklerinden genomik DNA'nın izolasyonu ve kesilmesi prosedürlerini takiben başlar.

Sonraki birkaç adım, SHE DNA'sını SMID vektörü PCC'ye bağlanma için hazırlar. İlk adım, SHE DNA ve fosforilat parçalarının uçlarını onarmaktır. Beş asal uç, bu adım için gerekli tüm reaktifler, son onarım reaksiyonunu kurmak, tüm reaktifleri buz üzerinde çözmek, ardından uç onarım tamponu DNTP'yi birleştirmek, 20 mikrograma kadar bir TP'yi karıştırmak için merkez üssünden bir SMID kütüphanesi üretim kitine dahil edilir. mikrolitre başına 0.5 mikrogram DNA ekleyin ve su 80 mikrolitreye ulaşmak için, tüm sıvıyı elde etmek için tüpü kısaca santrifüjleyin. dip.

Son onarım reaksiyonunu oda sıcaklığında 45 dakika ila bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra ısıtın, enzimleri 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca etkisiz hale getirir. Son onarım inkübasyonu sırasında, jeli bir sonraki adım için hazırlayabilirsiniz.

Darbeli alan jel elektroforezi veya PFGE, amacınız 30 ila 60 arasında değişen DNA moleküllerini izole etmektir. Kilobazlar PFGE, standart elektroforez sırasında birlikte çalışan bu büyük parçaları çözmek için elektroforetik bir yöntemdir. Başlamak için, 150 mililitrelik bir XTAE çalışma tamponunda düşük erime noktalı aros kullanarak% 1'lik bir jel hazırlayın.

80 mikrolitrelik son onarım DNA örneğinin tamamını ve yükleme tamponunu bir veya iki kuyuya yüklemenize izin verecek tarakları seçin. Jeli düşük erime noktalı agros jelleri olarak kullanırken özellikle dikkatli olun. Jel katılaşırken çok kolay kırılır.

Elektroforez odasını hazırlayın. Hazneye 2,2 litre XTAE ekleyin ve çalışan tamponu dolaştırmak için makineyi açın. Soğutma cihazını 14 santigrat dereceye ayarlayın ve pompayı 70 RPM'ye ayarlayın.

Yine NEB'den orta sınıf bir PFG işaretleyici ekleyin. Jelinizi çok yüksek kesmemek için, jel şırıngasından aros çıkarın ve neşterle uçtan küçük bir tıkaç kesin. Tapayı kuyunun önüne yerleştirin ve erimiş aros ile kapatın.

Jelinizi yüklemeden önce çalışan tamponun 14 santigrat dereceye kadar soğuduğundan emin olun. İlk kuyuda beş mikrolitre New England Biolabs Lambda Hindi üç digest yükleyin. İkinci kuyucuğa, 10 mikrolitre steril su artı yükleme tamponu ile seyreltilmiş bir mikrolitre Smid kontrol boyutu işaretleyicisi yükleyin.

Ardından, onarılmış ve ısıyla etkisiz hale getirilmiş karışımınızı ve yükleme tamponunu yükleyin. Kapağı kapatın ve makineyi programlayın. Jel gece boyunca veya 12 saat çalışacaktır.

Jelin çalışması bittiğinde, DNA'nın siber altını seyrelttiğini görselleştirmek için bir siber altın lekesi kullanın. Bir XTAE'nin 250 mililitresinde, jelinizi solüsyonun içine yerleştirin ve karanlıkta bir saat boyunca lekeleyin, siber altın ışığa duyarlıdır Jel lekelenirken. Aşağıdaki jel ekstraksiyon adımı için 70 santigrat derecede ve bir F 45 santigrat derecede bir su banyosu hazırlayın.

Bir sonraki adım, eksize etmek ve jelleştirmektir. DNA'yı istediğiniz 30 ila 60 kilobaz boyut aralığında saflaştırın. Lekeli jelinizi boş, yırtılmış ve etiketlenmiş bir mikro hile tüpü ve steril bir neşter ile birlikte mavi ışık translüminatörüne götürün.

Jelinizin çapraz kirlenmesini önlemek için translüminatörü plastik sargı ile hizalayın. Görüntüleme gözlüklerini açın ve mavi ışığı açın. Artık sonunuzun onarılmış genomik DNA'sını ve FO smid kontrol boyutu işaretçisini görebilirsiniz Neşter ile, smid kontrol boyutu işaretçisi ile birlikte ve biraz üzerinde göç eden beş ila yedi milimetre genişliğinde bir jel dilimi çıkarın.

PFG işaretçisini diliminiz için üst sınır olarak kullanın. Dilimi yırtılmış tüpe aktarın. Devam etmeden önce dilimleri eksi 20 santigrat derecede bir yıla kadar saklayabilirsiniz.

Şimdi jelleşme zamanı. Diliminizdeki DNA'yı saflaştırın. Jel diliminizi içeren tüpü tartın ve yırtılma ağırlığını çıkararak dilimin ağırlığını hesaplayın.

Daha sonra, dilimi 70 santigrat derece su banyosunda 10 ila 15 dakika eritin. Jel diliminiz tamamen eridikten sonra, tüpü hızlı bir şekilde 45 santigrat derece su banyosuna aktarın. Bir miligram katı jelin eridikten sonra bir mikrolitre hacme sahip olduğunu unutmayın.

100 mikrolitre erimiş aros başına bir birim veya bir mikrolitre Jase enzim preparatı ekleyin. Bir saat boyunca 45 santigrat derecede inkübe edin. Sonra iki ila dört mikrolitre daha ekleyin ve bir saat daha ısı için 45 santigrat derecede inkübe edin.

Jeli ısıttıktan sonra 10 dakika boyunca 70 santigrat derecede etkisiz hale getirin. Enzimi etkisiz hale getirerek, tüpü maksimum hızda santrifüj ettikten sonra 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Çözünmeyen parçacıkları peletlemek için 15 dakika boyunca 13.000 RPM.

Peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. Saflaştırılmış DNA'nızı içeren üst süpernatanı çıkarın ve 15 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın. Daha sonra DNA'yı yıkamak ve konsantre etmek için yanına üç mililitre steril su sürün.

Çözeltiyi 15 mililitrelik Falcon tüpünden ultra hücre 10 membranlı Ancon Ultra dört santrifüj filtre ünitesine aktarın. Filtre ünitesini adaptör olarak 50 mililitrelik bir falcon tüpü kullanarak sallanan bir kova rotoruna yerleştirin ve altı ila sekiz dakika boyunca 4.000 GS'de döndürün. Yaklaşık 100 ila 500 mikrolitre çözeltiye kadar santrifüjleyin.

Filtrenin üzerinde kalın ve akışı atın. Sonra boş şahin tüpüne üç mililitre daha steril su ekleyin. Çözeltiyi Amon tüpüne aktarın ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.

Falcon tüpünü üçüncü kez yıkayın ve filtrede toplanan son hacmi 50 ila 100 mikrolitreye düşürün. Numuneyi kaybetme konusunda endişelenmenize gerek yok. Filtre, uzun süreli santrifüjlemeden sonra bile 50 mikrolitre sıvıyı tutacaktır.

Kalan DNA solüsyonunu AmCon tüpünden önceden yıkanmış bir MicroCon YM 50 santrifüj filtre ünitesine aktarın ve tüm DNA santrifüjünü geri kazanmak için Amon tüpünü ek 50 mikrolitre steril su ile durulayın. MicroCon YM 50 santrifüj filtre ünitesi, 10.000 GS'de bir mikro santrifüjde, filtre hala hafifçe sıvı ile kaplanana kadar. Her dakika kontrol edin.

Filtrede sadece az miktarda sıvı kalırsa. Filtreyi ters çevirin ve DNA çözeltinizi yeni bir mikro santrifüj tüpünde üç dakika boyunca 1000 GS'de ikinci bir santrifüj adımıyla geri kazanın. Elde edilen hacim toplamda 10 ila 15 mikrolitreyi geçmemelidir.

Aksi takdirde, DNA'nız ligasyon için çok seyreltilmiş olabilir. Elde edilen DNA çözeltisinin konsantrasyonunu NanoDrop veya Pico Green Assel'i ile kontrol edin. Kurtarıldı ve onarıldı.

DNA artık ligasyon için bir FO SMID klonlama vektörü olan PCC'ye bağlanmaya hazırdır, tüm reaktifleri buz üzerinde çözer. Daha sonra burada listelenen sırayla birleştirilir ve her eklemeden sonra karıştırılır. İlk olarak, 10 mikrolitrelik bir reaksiyon hacmine ulaşmak için steril su ekleyin.

Daha sonra 10 x hızlı bağlantı ligasyon tamponu, 10 milimolar ATPPCC, bir SMID vektörü ve 10'a bir molar oranında yerleştirin. Ve son olarak hızlı bağlantı DNA Ligaz. Tüm sıvıyı dibe indirmek için tüpü kısaca santrifüjleyin.

Tüpe dokunun ve tekrar döndürün. Ligasyon reaksiyonunu oda sıcaklığında iki saat inkübe edin ve enzimi 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca ısıtın. Bu noktada, ligasyon reaksiyonunu eksi 20 santigrat derecede saklayabilir veya faj paketleme adımına geçebilirsiniz.

Bir sonraki adım, faj paketleme adımını yapmayı planlamadan iki veya üç gün önce FO SMID kütüphanenizi e coli'ye sokmak için işlev görecek bakteri fajları üretmektir: sağlanan EPI 300 T tek dirençli kaplama türünü düz bir LB plaka üzerinde çizin ve tek koloniler elde etmek için gece boyunca 37 ila santigrat derecede inkübe edin. Bu plakayı mühürleyebilir ve ileride kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayabilirsiniz. Paketleme reaksiyonlarından bir gün önce, 50 mililitre Albee suyu artı 10 milimolar magnezyum sülfatı Epi 300 plakanızdan tek bir koloni ile aşılayın Gece boyunca 225 RPM ve 37 santigrat derecede çalkalayın.

Paketleme reaksiyonlarının olduğu gün, taze 50 mililitre LB suyu artı 10 milimolar magnezyum sülfatı beş mililitre gece boyunca kültür ile aşılayın. Kültür, bakterileri 37 santigrat derecede 0.8 ila 1.0 arasında bir OD 600'e kadar çıkarır. OD 600/1.0'ı aşmayın.

Doğru bir sonuç elde etmek için spektrofotometrede ölçüm yapmadan önce numunenizi seyreltin. Devam etmeye hazır olana kadar veya 72 saate kadar buz üzerinde veya dört santigrat derecede saklayın. Artık bakteriler enfeksiyona hazır olduğuna göre, faj çözülmesini hazırlamanın zamanı geldi.

Maksimum plakalar Lambda Packaging buz üzerinde ekstraktlar. Ligasyon reaksiyonu başına bir tüp kullanarak, çözülme yaklaşık 10 ila 15 dakika sürecektir. Bu arada, reaksiyon başına bir tüp kullanarak boş bir 1.5 mililitrelik tüpü tekrar buz üzerinde önceden soğutun.

Lambda ambalaj ekstraktları çözüldükten sonra, hemen her bir ambalaj ekstraktından 25 mikrolitreye önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik mikro fuge tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Kalan ambalaj ekstraktını eksi 80 santigrat dereceye geri koyun. Çözülmüş ambalaj ekstraktlarını buz üzerinde çok uzun süre bırakmak enfeksiyon etkinliğini azaltacaktır.

Daha sonra, çözeltiyi hava kabarcıkları oluşturmadan birkaç kez pipetleyerek karıştırılan buz üzerindeki çözülmüş ekstraktların her 25 mikrolitresine 10 mikrolitre ligasyon reaksiyonu ekleyin. Tüplerin altındaki tüm sıvıyı birleştirmek için kısaca santrifüjleyin ve paketleme reaksiyonlarını 30 santigrat derece su banyosunda 90 dakika inkübe edin. 80 dakikalık inkübasyondan sonra, kalan ambalaj ekstraktını buz üzerinde çözdürün.

90 dakikalık paketleme reaksiyonu tamamlandıktan sonra, kalan 25 mikrolitre ambalaj ekstraktını her bir reaksiyon tüpüne ekleyin. Reaksiyonları 30 santigrat derecede 90 dakika daha inkübe edin. İkinci inkübasyondan sonra, her bir ambalaj tüpüne 100 mikrolitre hazırlanmış faj seyreltme tamponu ekleyin ve her tüpe beş mikrolitre kloroform ekleyerek hafifçe karıştırın.

Şimdi tüpte toplam 165 mikrolitre hacme sahip olmalısınız. Kloroform baskısından sonra viskoz bir çökelti oluşabilir. Faj parçacıklarını pipetlerken bu çökeltiden ve organik kloroform fazından kaçının.

Bu noktada, gerekirse paketlenmiş faj parçacıklarını birkaç gün boyunca dört derecede saklayabilirsiniz, ancak en iyi sonuçlar için taze hazırlanmış faj kullanın. Artık paketlenmiş faj ile faj paketleme adımları boyunca büyüttüğünüz konak hücreleri enfekte etmeye hazırsınız. Her 10 mikrolitre faj partikülü için 400 mikrolitre epi 300 T bir dirençli hücre oranında EPI 300 T bir dirençli konak hücre OD 600.8 ila 1.0'a paketlenmiş faj ekleyin.

Paketlenmiş faj tüpünün dibinden herhangi bir kloroformun pipetlenmesini önlemek için, 125 mikrolitre paketlenmiş faj parçacıkları ve beş mililitre hazırlanmış epi 300 T bir dirençli konak hücresi kullanıyoruz, nazikçe karıştırıyoruz ve daha sonra 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe ediyoruz. Bir sonraki adım, paketlenmiş fajın titresini belirlemektir. Bunu, enfekte olmuş hücreleri seçmek için enfekte olmuş bakterileri ortam üzerine kaplayarak yaparsınız.

Daha sonra elde edilen kolonileri sayın ve kapladığınız bakterilere eklenen faj hacmine bölün. C bir SMID, bir kloramfenikol direnç geni içerir. Bu nedenle, enfekte klonları seçmek için, bakterileri LB içeren kloramfenikol plakaları üzerine koyun.

Faj ile enfekte olmuş EPI 300 T bir dirençli hücreyi iki kez 50 mikrolitre ve iki kez 10 mikrolitre dört ayrı plakaya yayın ve plakaları 37 derecelik bir inkübatörde 16 ila 24 saat boyunca, koloniler oluşana kadar en fazla 48 saat boyunca baş aşağı yerleştirin. Bu arada, beş mililitrelik enfeksiyondan kalan EPI 300 T bir dirençli hücreyi, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 3.500 GS'de santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı atın.

Tüp resüsüne% 20 gliserol ile bir mililitre LB ekleyin. Hücre peletini askıya alın ve iki mililitrelik kriyo flakon tüplerinde her biri 100 mikrolitreye kadar doldurun, hemen dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ertesi gün koloni toplama adımında daha fazla kullanım için, 37 santigrat derece inkübatördeki dört plakadaki klon sayısını sayın ve bir sonraki adımda kullanacağınız paketlenmiş fajın titresini belirleyin.

Dondurulmuş EPI 300 T bir dirençli gliserol stoğu, kitaplığınızdaki tüm farklı plazmitlerle dönüştürülen hücreleri içerir. Daha sonra, her bir smidin viral titresine ve plaka boyutuna göre uygun bir miktar yayın. 2 45 x 2 45 milimetre kare klonlayın.

Cam boncuklar kullanılarak kloramfenikol ile LB biyotahlil plakaları. Ayrıca hücrelerinizi eşit şekilde yaymak için tabağa az miktarda LB suyu ekleyin. Gliserol stoğunu hazırlamanın ayrıca hücrelerinizi yaklaşık beş kat yoğunlaştırdığını unutmayın.

Koloni toplama günlerinde 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, LB suyu kuyusu başına 200 mikrolitre veya 70 mikrolitre ile doldurulmuş 96 veya 3 84 oyuklu plaka hazırlayın. Antibiyotik seçimi için mililitre et suyu başına 12.5 mikrogram kloramfenikol ve dondurma için% 10 gliserol ile desteklenmiştir. Bu adım için otomatik qfi üç plakalı dolum sistemini kullanıyoruz.

Bir sonraki adım, hazırladığınız LB CHLORAMPHENICOL plakalarından kolonileri dondurmak için hazırlanmış 96 veya 3 84 oyuklu plakalarınıza toplamaktır. Bu adım için, klon toplama alanı çevresinde steril bir ortam oluşturmak için kullanım kılavuzuna göre klon toplama robotu qix two'yu kullanıyoruz. UV ışığı açıkken UV ışığını 30 dakika boyunca açın.

500 mililitre% 1 çamaşır suyu, 500 mililitre steril deiyonize su ve 500 mililitre% 80 etanol hazırlayın. UV ışığı kapandığında, tepsileri arkadan öne doğru etiketlendiği gibi doldurun. Ön tepsiye %1 çamaşır suyu, ardından otoklavda deiyonize su ve %80 etanol doldurun.

Toplama iğneleri yeterli yıkama solüsyonu olmadan düzgün bir şekilde yıkanamayacağından dolu olduklarından emin olun. Optimum toplama için parametreleri ayarladıktan sonra, bakteri plakalarınızın ve LB dolgulu 96 veya 3 84 kuyulu plakalarınızın kapaklarını çıkarın ve bunları Q penalarındaki direklerin arasına yerleştirin. Çalışma alanı plakaları, toplama sırasında hareket etmemeleri için sağ ön köşeye karşı sıkı olmalıdır.

Ardından ön paneli kapatın. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, toplama prosedürü başlayabilir. Tüm toplama işlemleri tamamlandığında, fırçaları ve tepsileri deiyonize su ile durulayın ve kuruması için tezgahın üzerine koyun.

Meydana gelmiş olabilecek dökülmeleri temizleyin ve CICS'in içini %80 etanol ile silin. Tüm gliserol stok plakalarının etiketlendiğinden emin olun ve toplanan her koloniden bir kültür yetiştirmek için 24 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Kuluçka makinesinin üzerine, kuluçkaya yatırılan plakaların tarih numarasını, kuluçka zamanını, çıkarma zamanını ve baş harflerinizi içeren bir not bırakın.

Kuluçka işleminden sonra kütüphaneniz olur. Her kuyucuk, başlangıç numunenizden bir parça saf DNA'ya bir fo smid bağlanmış PCC'yi içeren bir bakteri klonunun kültürünü içerir. Uzun süreli saklama için plakaları eksi 80 derecede dondurun ve iyi yapılmış bir iş için kendinizi tebrik edin.

Sunulan protokol, belirli bir habitattaki bir mikrobiyal topluluğun genetik içeriğini yakalamak için çevresel bir smid kütüphanesinin nasıl oluşturulacağına ilişkin prosedürü açıklar. Bu protokol, örneklenen ortamın genetik içeriğini temsil eden bir SMID kütüphanesi oluşturmalı ve okuyucunun kritik adımları optimize etmesini sağlamalıdır. Tüm prosedürün sonunda elde edilen FO smid klonlarının miktarı çok düşükse.

Size bir deniz suyu örneğinden türetilen genomik DNA'dan FO SMID kitaplığını nasıl oluşturacağınızı gösterdik. Bu prosedürü yaparken, yüksek kaliteli genomik DNA ile başlamak önemlidir. Başlamadan önce tüm plakalarınızı ve reaktiflerinizi hazırlayın ve bu çok adımlı süreç için yeterli zaman planlayın.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.