Name: Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: Öğrenin, çevresel örneklerden büyük ekle fosmid kütüphanesi oluşturma yöntemini. Bu protokol, mikrobiyal topluluk yapısını ve metabolizmasını incelemek için E. coli kullanarak otomatik koloni seçimi ile klonlama sürecini kapsar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada Kanada Vakfı Biz, kıyı ve açık okyanus sularında düşük oksijen bölgelerde devam eden çalışmalar destek için teşekkür etmek istiyorum. MT ve SL Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim (CMDE) TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi burs tarafından desteklenmiştir. MT de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) burs desteği aldı.

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

Bir prosedür nasıl bir kıyı su numunesi elde edilen genomik DNA ile büyük bir takın fosmid kütüphane oluşturmak için en verimli şekilde açıklanmıştır. Up-stream genomik DNA ekstraksiyonu ayrı bir protokol [3] açıklanmıştır. Fosmid-kütüphane üretim çok adımlı bir süreç, planı dört sunulan adımları da dahil olmak üzere tüm prosedürü için en az 2-3 hafta süre. Genomik DNA ekstraksiyonu, en önemli adım ve tüm aşağı akım adımları çıkarılan genomik DNA nitelik ve nicelik güveniyor; böylece bu adım...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Adım II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CopyControl&amp;#8482; Fosmid Kütüphanesi Üretim Kiti</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>9-10 fosmid kütüphanesi oluşturmak için yeterli</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agaroz</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>karıştırıcılı ısıtıcı tabla</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>1.0X TAE yürütme tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>soğutma modülü ve değişken hızlı pompa dahil CHEF Mapper XA darbeli alan elektroforez sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#955; DNA-HindIII Sindirimi</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>MidRange I PFG Markörü</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>10,000X SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>mikrodalgaya uygun plastik streç film</td><td>Saran premium wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager transilüminatör</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>GELase Agaroz Jel Sindirim Hazırlığı</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>neşter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Ultracel-10 membranlı Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Ünitesi</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30 Santrifüj Filtre Ünitesi</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Analiz Kiti *2000 analiz*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>dijital kuru blok ısıtıcı</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>su banyosu</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>santrifüj</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>santrifüj rotoru</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>masaüstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>mikrosantrifüj tüpleri, 1.7 mL, şeffaf</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Adım III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB besiyeri</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>faj dilüsyon tamponu</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>kriyojenik tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Adım IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kapaklı 96 kuyucuklu plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>kapaklı 384 kuyucuklu plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları 100 O.D. x 15mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları 150 Dia. x 15mmH</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>LB besiyeri</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>cam boncuklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır suyu</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>QPix koloni seçici</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>seçme başlığı (E. coli)</td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

büyük ekle Çevre genomik kütüphane Üretim

Large Insert Environmental Genomic Library Production

Doğada mikropların büyük bir çoğunluğu şu anda, geleneksel tarım yöntemleri erişilemez kalır. Geçtiğimiz on yıl boyunca, kültür-bağımsız çevre genomik (<em&gt; Yani</em&gt; Metagenomic) yaklaşımları, araştırmacılar, bu kültür ortamında doğrudan yerli mikrobiyal toplulukların genetik içeriği yakalayarak köprü sağlayan ortaya çıkmıştır. Bu amaçla, genomik DNA kütüphaneleri de olsa standart sanatsal laboratuar klonlama teknikleri kullanılarak inşa edilmektedir. Burada mevsimsel hipoksik fiyort dikey derinliği süreklilik elde edilen DNA ile büyük bir ekleme çevre genomik fosmid kütüphane yapım açıklar. Bu protokol doğrudan kıyı deniz suyu örnekleme [1] bağlı protokoller de dahil olmak üzere bir dizi bağlı mikrobiyal biyokütle, büyük hacimli filtrasyon [2] ve bir DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma protokol [3]. Başlangıçta, yüksek kalitede genomik DNA 5-fosforile künt biter oluşturulması ile sona onarılmıştır. End-DNA tamir boyutu seçimi ve jel çıkarma, 30 ve 60 bin baz çiftinden (Kb) uzunluğu arasında DNA parçaları kurtarmak için yapılır pulsed-field jel elektroforezi (PFGE) tabi tutulur. Boyutu seçilen DNA PFGE jel matris uzak saflaştırılmış ve künt uç fosfataz tedavi fosmid CopyControl vektör pCC1 (Epicentre bağlandı.<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;). PCC1 ve insert DNA Lineer concatemers sonradan faj dayanıklı sonraki enfeksiyonu ile lambda terminase faj parçacıkları içine paketlenmiş headfull<em&gt; E. coli</em&gt; Hücreler. Başarıyla transduced klonlar antibiyotik seçimi altında LB agar plaklarına kurtarıldı ve robot alarak otomatik bir koloni (Qpix2, GENETIX) kullanarak 384 plaka biçimi arşivlenir. Mevcut protokol Epicentre CopyControl Fosmid Kütüphane Üretim Seti de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan çizer ve birden fazla araştırma grupları yayınlanan eserler [4-7]. Her adım, akılda en iyi uygulamalar ile sunulmuştur. Genel kütüphane üretim kalitesini ve verimliliğini artırmak için yürütme inceliklerini vurgulamak Mümkün olduğunda. Dahil pek çok kuluçka adımları olduğu gibi, fosmid kütüphane üretim ve otomatik koloni toplama tüm süreç en az 7-10 gün sürer. Ancak, protokol içinde belirtilen olası birkaç durak noktaları vardır.

Mevsimsel hipoksik fiyort dikey derinliği süreklilik çevre genomik DNA izole bir fosmid kütüphane inşaatı açıklanmıştır. Çıkan klon kütüphanesi 384-kuyucuğu içine aldı ve mansap sıralama ve fonksiyonel tarama, otomatik bir koloni toplama sistemi uygulama tarafından arşivlenir.

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

Doğadaki mikropların büyük bir çoğunluğu şu anda geleneksel kültürleme yöntemleriyle erişilemez durumdadır. Geçtiğimiz on yıl boyunca, kültürden bağımsız...

Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Steven Helm laboratuvarından Marcus. Bugün size büyük insertli bir çevresel kütüphane oluşturma prosedürünü göstereceğiz. Bugünkü prosedürde bana, faji paketleme ve kütüphane konakçısı e coli'nin enfeksiyonunu gerçekleştirecek olan San Lee ile koloni seçimi yapacak olan Elise Hawley ve Chin Yang yardımcı olacaklar.Denizel ve karasal ortamlardaki mikrobiyal topluluk yapısını ve metabolizmasını incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü uyguluyoruz. Öyleyse başlayalım. fosmid DNA kütüphanesi oluşturmaya yönelik bu protokol, biyokütle örneklerinden genomik DNA'nın izolasyonu ve parçalanması prosedürlerini takiben başlar; bu işlemlerle ilgili ayrıntılar beraberindeki JoVE makalelerinde belirtilmiştir.Sonraki birkaç adım, SHE DNA'sının SMID vektörü PCC one'a ligasyonu için hazırlanmasını içerir. İlk adım, SHE DNA parçalarının uçlarının onarılması ve fosforillenmesidir. Beş prime uçları için bu adımda gerekli olan tüm reaktifler, epicenter'dan alınan PCC one SMID kütüphane üretim kitinde yer almaktadır. uç onarım reaksiyonunu hazırlamak için tüm reaktifleri buz üzerinde çözdürün, ardından uç onarım ta

large-insert-environmental-genomic-library-production

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Burada T7 lineer RNA amplifikasyon dayalı gen ekspresyon analizi için iki tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna Illumina mRNA Seq sıralama kütüphaneler hazırlanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, toplam RNA başlayan sadece 10 nanogram gerektirir ve tüm transkript temsil eden son derece tutarlı bir kütüphane oluşturur.

10 nanogram Total RNA tek okuyun ve Eşleştirilmiş Sona mRNA-Seq Illumina Kütüphaneler

Genetik raportör testi, DNA dizileri ve gen düzenleyici aktiviteleri arasındaki ilişkiyi incelemek için iyi kurulmuş ve güçlü bir araçtır. Aday düzenleyici elemanların, tanımlayıcı dizi etiketlerini taşıyan raportör genlere bağlanması, bu tahlillerin büyük ölçüde paralelleştirilmesini sağlar.

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

Bu el yazması, yeni nesil dizileme için DNA parçalarını saflaştırmak için otomatik bir jel boyutu seçim yaklaşımını açıklamaktadır. Ranger Teknolojisi, agaroz jel yükleme, elektroforetik analiz ve hedeflenen DNA parçalarının geri kazanılması sürecinin tamamının tam otomasyonunu sağlayarak yüksek verimli ve yüksek kaliteli yeni nesil dizileme kitaplıklarına olanak tanır.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Büyük ölçekli gRNA kitaplıkları oluşturmak için yöntemleri basit, verimli ve maliyet-etkin olmalıdır. Biz gRNA kütüphaneler hedef DNA Enzimatik sindirim üzerinde dayalı üretim için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem CORALINA (kapsamlı gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile) pahalı özel Oligonükleotid sentezi için bir alternatif sunuyor.

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

PBIBAC-GW ikili vektör oluşturma transgenik bitkiler sağlam tek kopya eklemeler, kolay bir süreç ile kolaylaştırır. Burada, bir dizi protokol okuyucu transgenik Arabidopsis bitkiler üretme ve bitkiler intactness için sınama işlemi boyunca rehberlik ve ekleme sayısı kopyalamak sunulur.

Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

Gram-negatif bakterilerde doymak üzere transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak ve daha sonra yüksek işlemli sıralama için DNA amplicon kütüphanelerinin hazırlanmasını tanımlayan bir yöntem. Örnek olarak, biz ESKAPE patojen, Acinetobacter baumanniiodaklanmak , ama bu protokol Gram-negatif organizmaların geniş bir yelpazede için münasip olduğunu.

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Bu protokol, üriner bakterilerin kültleme, dizileme ve de novo hibrid genom montajı için kapsamlı bir yaklaşımı detaylandırmak. İdrar kolonizasyonuna, patogeneze ve antimikrobiyal direncin yayılmasına katkıda bulunan kromozomal ve ekstrakrozomal genetik elementlerin incelenmesinde yararlı olan tam, dairesel genom dizilerinin üretimi için tekrarlanabilir bir prosedür sağlar.

Kısa ve Uzun Süredir Okunan Dizileme Teknolojilerini Kullanarak İdrar Bakterilerinin Tam Genomlarının Üretilmesi için Hibrit De Novo Genom Montajı

Insersiyonel mutajenez, fonksiyonel genomik elementleri tanımlamak için ileri genetikte önemli bir araçtır. Burada, lentivirüs tabanlı bir ekleme mutajenez hücre kütüphanesi içindeki lentivirüs entegrasyon bölgelerini tespit etmek için bir yöntem olan İşlevsel Öğeler ve Transkriptler için Yerleştirme Tabanlı Ekranı (InSET) açıklıyoruz.

Bir İnsersiyonel Mutajenez Hücre Kütüphanesinde İşlevsel Olarak İlgili Lentivirus Entegrasyon Bölgelerinin Tanımlanması

Bu protokol, otomasyon destekli genetik kütüphane oluşturma ve değerlendirme yoluyla genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin sistematik küresel optimizasyonu için bir yöntem sağlar. Bu, deneyleri kolaylaştırmak ve biyosensörleri belirli tasarım sonuçlarına göre ayarlamak için genetik bileşenlerin seçimini sağlamak için deney tasarımı metodolojileriyle birleştirilir.

Genetik Olarak Kodlanmış Biyosensör Tasarım Alanının Verimli Örneklenmesi, Deney Tasarımı ve Otomasyon İş Akışı ile Etkinleştirildi

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&amp;Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Öğrenin, çevresel örneklerden büyük ekle fosmid kütüphanesi oluşturma yöntemini. Bu protokol, mikrobiyal topluluk yapısını ve metabolizmasını incelemek için E. coli kullanarak otomatik koloni seçimi ile klonlama sürecini kapsar.

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

Daha fazla video keşfet