Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Steven Helm laboratuvarından Marcus. Bugün size büyük insertli bir çevresel kütüphane oluşturma prosedürünü göstereceğiz. Bugünkü prosedürde bana, faji paketleme ve kütüphane konakçısı e coli'nin enfeksiyonunu gerçekleştirecek olan San Lee ile koloni seçimi yapacak olan Elise Hawley ve Chin Yang yardımcı olacaklar.

Denizel ve karasal ortamlardaki mikrobiyal topluluk yapısını ve metabolizmasını incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü uyguluyoruz. Öyleyse başlayalım. fosmid DNA kütüphanesi oluşturmaya yönelik bu protokol, biyokütle örneklerinden genomik DNA'nın izolasyonu ve parçalanması prosedürlerini takiben başlar; bu işlemlerle ilgili ayrıntılar beraberindeki JoVE makalelerinde belirtilmiştir.

Sonraki birkaç adım, SHE DNA'sının SMID vektörü PCC one'a ligasyonu için hazırlanmasını içerir. İlk adım, SHE DNA parçalarının uçlarının onarılması ve fosforillenmesidir. Beş prime uçları için bu adımda gerekli olan tüm reaktifler, epicenter'dan alınan PCC one SMID kütüphane üretim kitinde yer almaktadır. uç onarım reaksiyonunu hazırlamak için tüm reaktifleri buz üzerinde çözdürün, ardından uç onarım tamponu, DNTP, mix a TP, mikrolitre başına 0,5 mikrogram konsantrasyonda 20 mikrograma kadar she insert DNA'sı, enzim karışımı ve suyu birleştirin. Toplam hacmi 80 mikrolitreye tamamlayın; tüm sıvının tüpün dibine çökmesi için tüpü kısa süre santrifüjleyin.

Uç onarım reaksiyonunu oda sıcaklığında 45 dakika ile bir saat arası inkübe edin. Ardından, enzimleri 70 °C'de 10 dakika boyunca ısıtarak inaktive edin. Uç onarım inkübasyonu sırasında, bir sonraki adım için jeli hazırlayabilirsiniz.

Darbeli alan jel elektroforezi veya PFGE ile amacınız, 30 ile 60 Kilobases aralığındaki DNA moleküllerini izole etmektir. PFGE, standart elektroforez sırasında birlikte hareket eden bu büyük fragmanların ayrıştırılması için kullanılan elektroforetik bir yöntemdir. Başlamak için, 150 mililitre 1X TAE yürütme tamponu içerisinde düşük erime noktalı agar kullanarak %1'lik bir jel hazırlayın.

Uç onarımı yapılmış DNA'nın 80 µL'lik tüm örneğini ve yükleme tamponunu bir veya iki kuyucuğa yüklemenize olanak tanıyacak taraklar seçin. Düşük erime noktalı agaroz jelleri, jel katılaşırken çok kolay kırıldığı için jel ile çalışırken özellikle dikkatli olun.

Elektroforez hücresini hazırlayın. Hücreye 2,2 litre bir XTAE ekleyin ve çalışma tamponunun sirkülasyonunu sağlamak için cihazı çalıştırın. Soğutma cihazını 14 °C'ye ve pompayı 70 RPM'e ayarlayın.

NEB firmasından temin edilen orta menzilli bir PFG marker da ekleyin. Jelinizin çok yüksekten kesilmesini önlemek için jel şırıngasından aros çıkartın ve neşter ile ucundan küçük bir tıpa kesin. Tıpayı kuyucuğun önüne yerleştirin ve erimiş aros ile mühürleyin.

Jelinizi yüklemeden önce yürütme tamponunun 14 °C'ye kadar soğuduğundan emin olun. İlk kuyucuğa beş µL New England Biolabs Lambda Hindi 3 sindirimi yükleyin. İkinci kuyucuğa 10 µL steril su ve yükleme tamponu ile seyreltilmiş bir µL Smid kontrol boyut belirteci yükleyin.

Ardından, uçları onarılmış ve ısı ile inaktive edilmiş karışımınızı ve yükleme tamponunu yükleyin. Kapağı kapatın ve cihazı programlayın. Jel, gece boyunca veya 12 saat boyunca çalıştırılacaktır.

Jel yürütme işlemi tamamlandığında, DNA'yı görselleştirmek için cyber gold boyası kullanın ve cyber gold'u seyreltin. 250 mililitre 1X TAE içerisine jelinizi yerleştirin ve karanlıkta bir saat boyunca boyayın; cyber gold ışığa duyarlıdır. Jel boyanırken, sonraki jel ekstraksiyonu adımı için 70 °C ve 45 °C'de su banyoları hazırlayın.

Sıradaki adım kesme ve jel işlemi yapmaktır. 30 ila 60 kilobase arasındaki istenen boyut aralığında bulunan DNA'yı saflaştırın. Boyanmış jelinizi, boş, yırtılmamış ve etiketlenmiş bir mikro santrifüj tüpü ve steril bir bistüri ile birlikte mavi ışık transilüminatöre götürün.

Jelinizin çapraz kontamine olmasını önlemek için translüminatörü streç film ile kaplayın. Göz koruma gözlüklerini takın ve mavi ışığı açın. Şimdi, uçları onarılmış genomik DNA'nızı ve FO smid kontrol boyut belirtecini görebilirsiniz. Bisturi yardımıyla, smid kontrol boyut belirteci ile aynı hizaya veya hemen üzerine göç etmiş, beş ila yedi milimetre genişliğinde bir jel dilimini kesin.

PFG belirtecini kesitiniz için üst sınır olarak kullanın. Kesiti yırtılmış tüpe aktarın. Devam etmeden önce kesitleri -20 °C'de bir yıla kadar saklayabilirsiniz.

Şimdi jel elektroforezi zamanı. Diliminizdeki DNA'yı saflaştırın. Jel diliminizi içeren tüpü tartın ve dara ağırlığını çıkararak dilimin ağırlığını hesaplayın.

Ardından, jel dilimini 70 °C'lik su banyosunda 10 ila 15 dakika boyunca eritin. Jel dilimi tamamen eridikten sonra, tüpü hızlıca 45 °C'lik su banyosuna aktarın. Bir miligram katı jelin eridikten sonra bir mikrolitre hacme sahip olduğunu unutmayın.

Erime durumundaki arosun her 100 µL'si için bir ünite veya bir µL Jase enzim preparatı ekleyin. 45 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından iki ila dört µL daha les ekleyin ve 45 °C'de bir saat daha ısı altında inkübe edin.

Isıtma işleminden sonra jeli 70 °C'de 10 dakika boyunca inaktive edin. Enzimi inaktive etmek için tüpü 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin ve ardından çözünmeyen partikülleri çöktürmek için maksimum hızda, 13.000 RPM'de 15 dakika santrifüjleyin.

Pelleti rahatsız etmemeye dikkat ederek, saflaştırılmış DNA'nızı içeren üst süpernatanı uzaklaştırın ve 15 mililitrelik bir falcon tüpe aktarın. Ardından, DNA'yı yıkamak ve konsantre etmek için üç mililitre steril su ile seyreltin.

Çözeltiyi 15 mililitrelik Falcon tüpünden, ultra cell 10 membrana sahip bir Ancon Ultra four santrifüj filtre ünitesine aktarın. Filtre ünitesini, 50 mililitrelik bir falcon tüpünü adaptör olarak kullanarak salınımlı kova rotoruna yerleştirin ve 4.000 GS hızda altı ila sekiz dakika boyunca çevirin. Yaklaşık 100 ila 500 mikrolitre çözelti kalana kadar santrifüjleyin.

Filtrenin üzerinde kalın ve süzüntüyü atın. Ardından, boş falcon tüpüne üç mililitre daha steril su ekleyin. Çözeltiyi Amon tüpüne aktarın ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.

Falcon tüpünü üçüncü kez yıkayın ve filtrede toplanan son hacmi 50 ila 100 µL'ye düşürün. Numunenin kaybı konusunda endişelenmenize gerek yoktur. Filtre, uzun süreli santrifüjden sonra bile 50 µL sıvı tutacaktır.

Kalan DNA çözeltisini AmCon tüpünden önceden yıkanmış bir MicroCon YM 50 santrifüj filtre ünitesine aktarın ve tüm DNA'yı geri kazanmak için AmCon tüpünü ek 50 µL steril su ile durulayın. MicroCon YM 50 santrifüj filtre ünitesini, filtre hala hafifçe sıvı ile kaplı olana kadar bir mikro santrifüjde 10,000 ×g'de santrifüjleyin. Her dakika kontrol edin.

Filtre üzerinde yalnızca az miktarda sıvı kalmışsa, filtreyi ters çevirin ve yeni bir mikro santrifüj tüpünde, 1000 GS'de üç dakika boyunca ikinci bir santrifüj adımıyla DNA çözeltinizi geri kazanın. Elde edilen toplam hacim 10 ila 15 microliters değerini aşmamalıdır.

Aksi takdirde, DNA'nız ligasyon için çok seyrelmiş olabilir. Ortaya çıkan DNA çözeltisinin konsantrasyonunu NanoDrop veya Pico Green Analizi ile kontrol edin. Geri kazanıldı ve onarıldı.

DNA artık PCC one FO SMID klonlama vektörüne ligasyona hazır hale getirilmiştir; ligasyon için tüm reaktifleri buz üzerinde çözdürün. Ardından, her eklemeden sonra karıştırarak burada listelenen sırayla birleştirin. İlk olarak, 10 microliter reaksiyon hacmine ulaşmak için steril su ekleyin.

Ardından 10 x fast link ligasyon tamponu, 10 millimolar A-T-P-P-C-C, bir SMID vektörü ve 10:1 molar oranında insert ekleyin. Son olarak fast link DNA Ligaz ekleyin. Tüm sıvının tüpün altına çökmesi için tüpü kısaca santrifüjleyin.

Tüpü hafifçe vurun ve tekrar santrifüjleyin. Ligasyon reaksiyonunu oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin ve enzimi 70 °C'de 10 dakika boyunca ısıyla inaktive edin. Bu aşamada, ligasyon reaksiyonunu -20 °C'de saklayabilir veya faj paketleme adımına geçebilirsiniz.

Bir sonraki adım, FO SMID kütüphanenizi E. coli'ye aktaracak bakteriyofajlar üretmektir. Faj paketleme adımını gerçekleştirmeyi planladığınız tarihten iki veya üç gün önce, sağlanan EPI 300 T1 dirençli ekim suşunu düz bir LB plakasına çizin ve tek koloniler elde etmek için 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Bu plağı kapatıp gelecekteki kullanımlar için 4 °C'de saklayabilirsiniz. Paketleme reaksiyonlarından bir gün önce, Epi 300 plağınızdan tek bir koloni ile 50 mL LB besiyerine 10 mM magnezyum sülfat ekleyerek inoküle edin. Gece boyunca 37 °C'de ve 225 RPM'de çalkalayın.

Paketleme reaksiyonlarının yapıldığı gün, 10 millimolar magnezyum sülfat eklenmiş 50 mililitre taze LB besiyerine beş mililitre gece boyu kültürü ile inokülasyon yapın. Bakterileri 37 degrees Celsius'de OD 600 değeri 0,8 ile 1,0 arasına gelene kadar kültüre edin. OD 600 değerinin 1,0'ı geçmemesine dikkat edin.

Spektrofotometrede ölçüm yapmadan önce, doğru sonuç alabilmek için örneğinizi seyreltin. İşleme hazır olana kadar veya 72 saate kadar buz üzerinde veya dört derece Celsius'ta saklayın. Bakteriler enfeksiyon için hazır olduğuna göre, artık faj çözme işlemini hazırlama zamanı geldi.

Maksimum plak Lambda Paketleme buz üzerinde çözdürülür. Ligasyon reaksiyonu başına bir tüp kullanıldığında, çözdürme işlemi yaklaşık 10 ila 15 dakika sürer. Bu sırada, reaksiyon başına bir tüp gelecek şekilde boş 1,5 mililitrelik tüpleri buz üzerinde tekrar önceden soğutun.

Lambda paketleme ekstraktları çözündükten sonra, her bir paketleme ekstraktından 25 µL'yi derhal önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve buz üzerine yerleştirin. Kalan paketleme ekstraktını -80 °C'ye geri koyun. Çözünmüş paketleme ekstraktlarının buz üzerinde çok uzun süre bekletilmesi enfeksiyon verimliliğini düşürecektir.

Ardından, ligasyon reaksiyonundan 10 µL'yi, buz üzerinde çözülmüş 25 µL'lik her bir ekstrakt örneğine ekleyin ve çözeltiyi hava kabarcığı oluşturmadan birkaç kez pipetleyerek karıştırın. Tüm sıvının tüplerin dibinde toplanması için kısa süreliğine santrifüjleyin ve paketleme reaksiyonlarını 30 °C'lik bir su banyosunda 90 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun 80. dakikasından sonra, kalan paketleme ekstraktını buz üzerinde çözdürün.

90 dakikalık paketleme reaksiyonu tamamlandıktan sonra, her bir reaksiyon tüpüne paketleme ekstraktının kalan 25 µL'sini ekleyin. Reaksiyonları 30 °C'de 90 dakika daha inkübe edin. İkinci inkübasyonun ardından, her bir paketleme tüpüne hazırlanan fago dilüsyon tamponundan 100 µL ekleyip nazikçe karıştırın ve her tüpe beş µL kloroform ekleyin.

Şu anda tüpte toplam 165 µL hacme sahip olmalısınız. Kloroform ilavesinden sonra viskoz bir çökelek oluşabilir. Faj partiküllerini pipetlerken bu çökelekten ve organik kloroform fazından kaçının.

Bu aşamada, gerekirse paketlenmiş faj partiküllerini dört dereceye kadar birkaç gün boyunca saklayabilirsiniz; ancak en iyi sonuçlar için taze hazırlanmış faj kullanın. Artık, faj paketleme adımları boyunca büyüttüğünüz konak hücreleri, paketlenmiş faj ile enfekte etmeye hazırsınız. Paketlenmiş fajı, her 10 µL faj partikülü için 400 µL EPI 300 T1 dirençli hücre olacak şekilde, OD 600 değeri 0,8 ile 1,0 arasında olan EPI 300 T1 dirençli konak hücrelerine ekleyin.

Paketlenmiş faj tüpünün dibinden kloroform çekmemek için, 125 microliters paketlenmiş faj partikülünü ve beş milliliters hazırlanmış epi 300 T one dirençli konak hücreyi nazikçe karıştırıp ardından 37 degrees Celsius sıcaklıkta 30 minutes boyunca inkübe ediyoruz. Bir sonraki adım, paketlenmiş fajın titresini belirlemektir. Bunu, enfekte hücreleri seçmek için enfekte bakterileri besiyerine ekerek gerçekleştirirsiniz.

Ardından oluşan koloniler sayılır ve bu sayı, plaklara eklenen faji hacmine bölünür. C one SMID, kloramfenikol direnç geni içermektedir. Bu nedenle, enfekte klonları seçmek için bakterileri kloramfenikol içeren LB plaklarına ekleyin.

Faj ile enfekte edilmiş EPI 300 T one dirençli hücrelerden iki kez 50 µL ve iki kez 10 µL'yi dört ayrı plak üzerine yayın ve plakları, koloniler oluşana kadar 16 ila 24 saat boyunca (en fazla 48 saat) 37 °C'lik bir inkübatöre ters şekilde yerleştirin. Bu sırada, 5 mL'lik enfeksiyondan kalan EPI 300 T one dirençli hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 3.500 ×g'de santrifüj ederek toplayın. Süpernatantı atın.

Tüpe 1 ml %20 gliserol içeren LB ekleyin. Hücre peletini süspande edin ve iki adet 2 ml'lik kriyoviyale 100 µL olacak şekilde paylaştırın; hemen dondurun ve -80 °C'de saklayın. Ertesi gün koloni seçme adımında kullanmak üzere, 37 °C'lik inkübatördeki dört plaktaki klon sayısını sayın ve bir sonraki adımda kullanacağınız paketlenmiş fajın titresini belirleyin.

Dondurulmuş EPI 300 T one dirençli gliserol stoğu, kütüphanenizdeki tüm farklı plazmidlerle transduksiyonu yapılmış hücreleri içerir. Ardından, viral titreyi ve her bir smid'in plaka boyutunu temel alarak uygun miktarda yayın. 2 45 by 2 45 milimetrelik kareye klonlayın.

Cam boncuklar kullanılarak kloramfenikol içeren LB biyolojik analiz plakları. Ayrıca, hücrelerinizi eşit şekilde yaymak için plağa az miktarda LB besiyeri ekleyin. Gliserol stok hazırlamanın hücrelerinizi yaklaşık beş kat daha konsantre hale getirdiğini unutmayın.

Koloni seçimi günlerinde 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin; her kuyucuğa 200 µL veya 70 µL LB besiyeri doldurulmuş 96 veya 384 kuyucuklu plakalar hazırlayın. Antibiyotik seçimi için mililitre başına 12,5 µg kloramfenikol ve dondurma işlemi için %10 gliserol ekleyin. Bu adım için otomatik qfi three plaka doldurma sistemini kullanıyoruz.

Bir sonraki adım, hazırladığınız LB KLORAMFENİKOL plaklarındaki kolonileri dondurmak üzere hazırladığınız 96 veya 384 kuyucuklu plakalara seçmektir. Bu adımda, klon seçme alanı çevresinde steril bir ortam oluşturmak için, kullanıcı kılavuzuna uygun olarak qix two klon seçme robotunu kullanıyoruz. UV ışığı açıkken 30 dakika boyunca UV ışığını çalıştırın.

500 mililitre %1'lik çamaşır suyu, 500 mililitre steril deiyonize su ve 500 mililitre %80'lik etanol hazırlayın. UV ışığı kapandığında, tepsileri arkadan öne doğru etiketlendiği şekilde doldurun. Önce %1'lik çamaşır suyunu, ardından otoklavlanmış deiyonize suyu ve en ön tepsiye %80'lik etanolü doldurun.

Toplama iğneleri yeterli yıkama solüsyonu olmadan düzgün şekilde yıkanamadığından, bunların dolu olduğundan emin olun. Optimal toplama parametrelerini ayarladıktan sonra, bakteri plaklarınızın ve LB ile doldurulmuş 96 veya 384 kuyucuklu plaklarınızın kapaklarını çıkarın ve bunları Q picks'teki desteklerin arasına yerleştirin. Çalışma alanı plakları, toplama sırasında hareket etmemeleri için ön sağ köşeye sıkıca yerleştirilmelidir.

Ardından ön paneli kapatın. Tüm parametreler ayarlandığında, toplama işlemi başlatılabilir. Tüm toplama işlemi tamamlandığında, fırçaları ve tepsileri deiyonize su ile durulayın ve kurumaları için tezgaha bırakın.

Oluşmuş olabilecek tüm dökülmeleri temizleyin ve CICS'in iç kısmını %80 etanol ile silin. Tüm gliserol stok plakalarının etiketlendiğinden emin olun ve seçilen her koloniden bir kültür geliştirmek için bunları 24 saat boyunca 37 degrees Celsius inkübatöre yerleştirin. İnkübatör üzerine tarih, inkübe edilen plakaların sayısı, inkübasyon süresi, çıkarma zamanı ve baş harflerinizi içeren bir not bırakın.

İnkübasyonun ardından kütüphaneniz hazır olur. Her kuyucuk, başlangıç örneğinizden gelen bir parçalanmış DNA parçasına ligasyonla bağlanmış PCC one fo smid içeren tek bir bakteriyel klon kültürü içerir. Uzun süreli saklama için plakaları -80 °C'de dondurun ve başarılı bir çalışma gerçekleştirdiğiniz için kendinizi tebrik edin.

Sunulan protokol, belirli bir habitattaki mikrobiyal topluluğun genetik içeriğini yakalamak için çevresel bir smid kütüphanesinin nasıl oluşturulacağına dair prosedürü açıklamaktadır. Bu protokol, örneklenen ortamın genetik içeriğini temsil eden bir SMID kütüphanesi oluşturmalı ve okuyucunun kritik adımları optimize etmesine olanak tanımalıdır. Tüm prosedürün sonunda elde edilen FO smid klon miktarı çok düşükse.

Deniz suyu örneğinden elde edilen genomik DNA'dan FO SMID kütüphanesinin nasıl oluşturulacağını az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, yüksek kaliteli genomik DNA ile başlamak önemlidir. Başlamadan önce tüm plakalarınızı ve reaktiflerinizi hazırlayın ve bu çok adımlı süreç için yeterli zaman ayırın.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.