Name: Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Öğrenin, GFP işaretli miyoblastlar kullanarak farelerde kas rejenerasyonunu canlı floresan görüntüleme ile izleme yöntemini. Bu teknik, uzunlamasına çalışmalarda daha az hayvan kullanarak doğru veri toplamayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z Y Yang ve Wang çalışmaları NIAMS / NIH hibe K02 AR051181 Müsküler Distrofi Derneği ve Harvard Kök Hücre Enstitüsü Y Wang için hibe ile mümkün olmuştur. , Q Zeng ve X Xu iş Brigham ve Kadın Hastanesi Optik Görüntüleme Laboratuvarı verilen bir program hibe ile desteklenmektedir. Yazarlar hücre çalışmalarına teknik yardım için Anestezi Anabilim Dalı, BWH Wen Liu teşekkür etmek istiyorum.

Hücre hazırlık <ol><li> Uydu hücre izolasyonu <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Anestezi altında, GFP transgenik fareler (C57BL / Ka-βactin-EGFP) bacak kasları kaldırılır. Küçük parçalar halinde kestikten sonra, uydu hücreler 37 1 saat süreyle% 2 dispase kollajenaz çözümü ile kıyılmış doku kuluçka ° C enzimatik ayrışmış </li><li> Ham F-10 ve% 20 FBS içeren büyüme medya ile enzim sindirimi nötralize Pasteur pipeti ile tekrar triturating kas ayrıştırmaları. Hücreleri hücre süzgecinden geçirilerek süzülür (Ø70-100μm) ve ardından 37 az 1 saat kaplı olmayan bir yemek ° C kaplama </li><li> Kollajen kaplı bir çanak süpernatant ve plaka onları hafifçe kaldırın. Matür arındırmak için bu adımı daha sonra 1 saat tekrarlayın. (Ön plaka) </li><li> Zaman içinde medya ve plaka hücrelerin değiştirin. Son saflaştırılmış matür orta Ham F-10,% 20 FBS, 100 U / ml penisilin ve 37 ° C,% 5 CO2,% 95 hava az 100 mcg / ml streptomisin (besi) içeren kültür. </li></ol> </li><li> Kültür ve 10 ng / ml temel FGF ilavesi ile büyüme ortamında birincil matür genişletmek. </li><li> In vivo deneyler için, TA kas başına 5x10 5 hücre enjekte edilir. </li><li> Matür hasat,% 0.25 &#39;lik tripsin / EDTA kullanarak hücreleri ayırmak ve iki kez PBS ile yıkayın. Hücre sayıları bir hemasitometre sayılır ve hücreleri 5x10 4 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon HBSS yeniden bekletildi. HBSS içinde buz üzerinde konsantre hücreleri yerleştirilir ve toplandıktan sonra 1 saat içinde enjekte edilir. </li></ol> Vivo Görüntüleme <ol><li> 4-6 haftalık yaşta Erkek mdx farelerin Jackson laboratuvarı satın alınan ve bir hayvan barınağı tesiste muhafaza edilir. </li><li> Çevre konaklama yaklaşık bir hafta sonra, farelerin kültür hücreleri ile implante olmaya hazır. </li><li> Hücre nakli öncesinde, fare karışımı Ketamin (100 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi. Sonra TA kas alanı çevresinde saç bacak için Nair ve distile su ile silerek temizleyin uygulayarak 30 saniye bekliyor kaldırılır. </li><li> Fare anestezi altında iken, 5x10 5 hücre 10μl HBSS 30 gauge iğne kullanılarak 3 puan yavaş yavaş her TA kas içine enjekte edilir . </li><li> 4. adımı sonra, fare, in vivo floresan görüntüleme tarafından düzenli olarak görüntülü olabilir . Yüksek duyarlı şarj çiftli kamera ile donatılmış floresan görüntüleme istasyonu Nightowl LB981 (Berthold Technologies, Inc.), Farelerin engel bacak görüntüler elde etmek için kullanılır. </li><li> In vivo görüntüleme gününde, ilk olarak saç regrowth TA kas kontrol edin. Gerekirse, biz fareyi Ketamin ve Xylazine karışımı ile anestezi sonrası, yukarıda açıklandığı gibi saç kaldırmak için Nair yeniden uygulayın. </li><li> Fare anestezi altında iken, fare siyah floresan olmayan kağıt (Strathmore siyah Artagain kağıt) bir parçası üzerinde yüzükoyun pozisyonda yerleştirin. TA kas daha iyi görüntüleme için tam göstermek için, kağıt arka pençeleri bantlayın. </li><li> Biz görüntüleme odası ve konumu, kameranın görüş alanının merkezinde görüntülü arka bacak fare yer. Biz ilk 5 saniyelik bir pozlama süresi ile bacak geleneksel bir gri-ölçekli fotoğraf görüntü almak için emisyon filtresi anahtarı. Fare ve gerekirse kameranın odak konumunu yeniden ayarlayınız. Pozlama süresi (1250 ms), örnek yüksekliği (0.9 cm) vb de dahil olmak üzere görüntüleme parametreleri deneysel süreç içinde sabit tutulur. </li><li> Daha sonra yeşil flüoresan protein dalga boyu için uygun emisyon filtresi anahtarı. Biz 1.250 ms ve 1 binning maruz kalma süresi ile floresan görüntü alır. Görüntüleme sonra, fare toparlanma beklemek için bir kafes görüntüleme odasından çıkarılır. </li><li> Analizi için, saniyede fotonların açısından yoğunluğunu ölçmek için floresan sinyalleri üzerinde bir ilgi bölgesi (ROI) çizin. Biz de başka bir ölçüm değeri olarak piksel sayısı açısından yatırım getirisini ölçmek. Görüntüleme deneyler, boylamsal veri elde etmek için, gerekirse bir kaç ay içinde her hafta daha sık tekrarlanan ya da olabilir. </li></ol> Deney sonunda, fare ötenazi ve TA kas histolojisi analizi için hasat edilir.

<ol><li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li>
<li>Green, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li>
<li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li>
<li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li>
<li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 Forthcoming.</li>
<li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci+Vis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li>
<li>In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li>
<li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+I.+A+histological%2C+morphometric+and+biochemical+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li>
<li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li>
<li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li>
<li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li>
<li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li>
<li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells%2C+bone+marrow+cells%2C+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li>
<li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient%2C+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li>
</ol>

Biz bu çalışmada ana iskelet kası floresan etiketli nakledilen hücrelerin izlemek için güvenilir ve istikrarlı bir görüntüleme platformu kurdu. GFP transgenik fare GFP etiketli matür yetişkin kök hücreler gelecekte hücre tedavisi için aday olacak bir tür için duruyor. Hücre sayısı, hücre enjeksiyonu, açık arka plan, görüntüleme konumunu ve makine parametresi de dahil olmak üzere sürekli bir manipülasyon, yüksek kalitede görüntü elde ve özellikle kantitatif analiz için önemlidir. Floresans görüntüleme non-invaziv, kolay olduğu gibi biyomedikal araştırmalarda birçok uygulamalar vardır ve yüksek kapasiteli. Buna ek olarak floresan görüntüleme, saçılma, zayıflama ve emilimi sayesinde de olsa, foton sayımı, dayanan kantitatif bir ölçüm sağlayabilir, ışık, doku büyük bir mesafe, bir teknik eksiklik nüfuz edemez. Kırmızı ya da yakın-kızılötesi ışık penetrasyon derinliğini artırmak için muhabir kullanmak için çalışmalar devam etmekte. Floresan görüntüleme diğer bir avantajı, insan kullanımı için özel floresan muhabiri onaylanmıştır eğer klinikler çevrilebilir. Pahalı donanım ve görüntüleme ajanları gerektirmez, MR, CT, ve PET ile karşılaştırıldığında, floresan görüntüleme yüksek esnekliğe sahiptir. Bir örnek kliniklerde kullanılan floresan tabanlı endoskop ve mikro-endoskop. Floresan görüntüleme yöntemleri ile birleştirerek, biz altta yatan biyolojik süreçler ile ilgili anatomik ve fonksiyonel bilgi elde etme yeteneği elde etmek için bekliyoruz.

<table><tbody><tr><td>NightOwl LB981</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

küçük hayvan kas aşı dinamiği ile takip in vivo floresan görüntüleme

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Musküler distrofiler kontraktil kas hücrelerinin progresif kaybı ile karakterize dejeneratif kas hastalıklarının bir grup. Şu anda herhangi bir iyileştirici bir tedavi yoktur. Kök hücre biyolojisi son gelişmeler bu hastalıkları tedavi etmek için etkili bir hücre bazlı tedavilerin geliştirilmesi için yeni umutlar yarattı. Distrofik hayvan modelleri kas içine floresan proteinleri ile etiketlenmiş kök hücrelerin çeşitli türleri Nakli alanında geniş anlamda kullanılmıştır. Nakledilen hücre kaderi takip etmek yeteneğine sahip bir non-invaziv bir tekniktir boyuna, daha doğru ve verimli bir şekilde nakledilen hücrelerin kas engraftman değerlendirmek için yetenek daha. Bu çalışmada, in vivo floresan görüntüleme nakledilen GFP (Yeşil Floresan Protein) etiketli fare iskelet kaslarında hücre izlemek için duyarlı ve güvenilir bir yöntem olduğunu göstermektedir. Floresan protein uyarma için gerekli harici bir ışık kullanımı nedeniyle geçmişi hakkında endişe rağmen, çıplak ya da fareyi kullanarak ya da epilasyon reaktifler saç ortadan kaldırarak çok bu sorunun ortadan olduğu bulundu. CCD kamera kullanarak, floresan sinyal GFP transgenik fareler veya eGFP transduced myoblast kültür ya da 5 x 10 5 hücre enjeksiyonu sonra tibialis anterior kas (TA) tespit edilebilir. Ekstansör digitorum longus (EDL), daha az hücre enjeksiyonu gibi daha yüzeysel kasları için saptanabilir bir sinyal üretir. Sinyal yoğunluğu ölçülür ve ilgi (ROI) bir bölgede saniyede fotonların sayısı olarak sayılabilir olabilir. Edinilen görüntüleri engrafted alan net sınırlarının çizilmesi, ROI boyutu olarak ölçülebilir. Bacaklarda sürekli her zaman konumda iseniz, kas ve ROI boyutu başına saniyede fotonların toplam sayısı değişiklikler engrafted hücrelerinin sayısında değişiklikler ve engrafted alanının boyutunu yansıtmaktadır. Bu nedenle zaman içinde aynı kas değişiklikleri ölçülebilir. In vivo floresan görüntüleme tekniği tumorogenic hücrelerinin büyümesini izlemek için öncelikle kullanılan olmuştur, bizim çalışmamızda, nakledilen kök hücrelerin kaderi takip etmek için bize sağlayan güçlü bir araç olduğunu göstermektedir.

Biz bir tarif<em&gt; In vivo</em&gt; Floresan görüntüleme protokolü, hem sağlıklı ve distrofik farelerin iskelet kas içine transplantasyonu sonrası GFP-etiketli matür kas yenilenme izlemek. Bu protokol, diğer tip hücre nakli ve diğer kaslı koşulların yanı sıra kas yenilenme çalışma adapte edilebilir.

Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme

Kas distrofileri, kontraktil kas hücrelerinin progresif kaybı ile karakterize, dejeneratif bir grup kas hastalığıdır. Şu an için herhangi bir ...

Merhaba, ben Boston'daki Bergham Kadın Hastanesi Anestezi Bölümü'nden Juwan Ma. Bugün sizlere, farelerde kas rejenerasyonunun ilerleyişini izlemek için in vivo floresan görüntüler elde etme tekniğini göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, transplant edilen kas kök hücrelerinin tutunmasını incelemek için kullanmaktayız.Öyleyse başlayalım. Transplantasyon için kullanılacak GFP işaretli hücreler, GFP transgenik farelerden izole edilir ve kültüre edilir. Devam etmeden önce, ayak parmağı sıkma testiyle farenin tamamen anestezi altında olduğu doğrulanır. Ardından arka bacak kasları çıkarılır. Aseptik koşullar altında, kas dokusu ardından masere edilir.Uydu hücreler, kıyılmış dokunun %2'lik kollajenaz çözeltisi ile 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edilmesiyle ayrıştırılır. İnkübasyonun ardından, enzimatik sindirimi durdurmak için ham F 10 ve %20 FBS içeren büyüme ortamı eklenir. Kaslar daha sonra bir pastör pipeti ile tekrarlanan triturasyon işlemi uygulanarak ayrıştırılır.Ardından hücreler bir hücre süzgecinden filtrelenir ve kaplamasız bir kültür kabına ekilir. Kap, standart bir hücre kültürü inkübatöründe bir saat boyunca bekletilir. Uydu hücreleri, daha güçlü adezyon özelliklerine sahip diğer hücre popülasyonlarından ayırmak için süpernatan kolajen kaplı bir kaba aktarılır ve bir saat daha inkübe edilir.Bu inkübasyonun ardından, ortaya çıkan uydu hücrece zenginleştirilmiş süpernatant tekrar uzaklaştırılır, yeni bir kollajen kaplı plakaya uygulanır ve miyoblast kolonileri gözlemlenene kadar kültüre edilir. Bu işlem ön çoğaltma olarak adlandırılır; hücreler %60 ila %70 hücresel konfluansa ulaştığında pasajlanır. Hücrelerin küçük bir kısmı, kültürdeki kas hücrelerinin saflığını doğrulamak amacıyla miyojenik hücre belirteçleri ile boyanarak immünositokimya için kullanılır.Miyojenik hücrelerin saflığı onaylandıktan sonra, hücreler aynı kültürde genişletilir. Hücre transplantasyonu öncesindeki transplantasyon koşullarında, hücreler %0,25 Trypsin-EDTA ile ayrılır; hücreler iki kez yıkanır ve HBSS içinde mililitrede 5x10⁷ hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edilir. Tibialis anterior veya TA kası başına 10 µL hücre solüsyonu enjekte edilir.In vivo görüntüleme için, GFP etiketli miyoblastlar önce dört ila altı haftalık erkek farelere nakledilir. Fare, ketamin xylazin ile anestezi altına alınır ve anestezi durumunun onaylanmasının ardından işleme başlanır. Arka plan gürültüsünü azaltmak için, her iki arka bacağa tüy dökücü krem uygulanır, 30 saniye beklenir ve ardından krem silinerek bacaklardaki kıllar temizlenir.Pamuk uçlu aplikatör için, fareye hücre nakli yapmadan önce kalan burun içi salyalarını ve kılları temizlemek amacıyla bacaklar, distile suyla ıslatılmış yeni bir pamuk uçlu aplikatörle tekrar silinir. İlk olarak, 10 µL HBSS içinde 5 x 10⁵ hücreyi bir Hamilton şırıngasına çekin. 30 gauge bir iğne ile, TA kasının uzun ekseni boyunca üç pozisyona (üst medial ve alt kısım) eşit sayıda hücre enjekte edin.İğne boyunca sızıntıyı önlemek için her enjeksiyondan sonra, iğneyi kastan geri çekmeden önce iki dakika boyunca tutun. Bekleme süresi boyunca, aynı miktarda hücreyi başka bir şırıngaya çekin ve kontralateral TA kasına enjekte edin. Hücre enjeksiyonlarından sonra fare, hemen siyah floresan olmayan bir kağıt üzerine yüzüstü pozisyona getirilir, her iki ayağı plantar kısmı aşağı bakacak şekilde kağıda sabitlenir ve bacaklar 90 derece açıyla yayılır. Ardından fare, bir Night Owl LB 981 floresan görüntüleme istasyonunun haznesine yerleştirilir.Yüksek hassasiyetli bir şarj bağlı aygıt (CCD) kamerasıyla donatılmış sistemde, bir arka bacak kameranın görüş alanının merkezine yerleştirilir. İlk olarak, bacağın geleneksel bir gri tonlamalı fotoğrafı çekilir. Görüntülemeye başlamak için, yeşil floresan protein için belirli bir dalga boyuna sahip uygun emisyon filtresi seçilir.1.250 milisaniye pozlama süresiyle bir görüntü alın, ardından 500 milisaniye pozlama süresiyle başka bir görüntü daha alın. Daha uzun pozlama süresinin zayıf bir sinyalin tespit edilmesine olanak sağladığını, daha kısa pozlamanın ise daha fazla ayrıntıyı ortaya çıkardığını görüyoruz. Bir arka bacağın görüntülemesi tamamlandıktan sonra, diğer arka bacağı kamera görüş alanının merkezine yerleştirin ve bu bacağı daha önce gösterildiği şekilde görüntüleyin.Karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için numune yüksekliği değişmeden kalmalıdır. Görüntüleme işleminden sonra fare tekrar kafesine aktarılır ve anesteziden uyanma süreci izlenir. Analiz için, saniye başına düşen foton sayısını ölçmek amacıyla floresan sinyallerin üzerine bir ilgi alanı çizilir.Boylamsal veri elde etmek amacıyla ek bir kantitatif değer olarak, ilgi bölgesinin boyutunu piksel sayısı cinsinden de ölçüyoruz; görüntüleme deneyleri, gerektiği üzere farklı günlerde veya haftalarda tekrarlanabilir. Deneyler için, GFP etiketli hücrelerin enjekte edildiği günde farenin arka bacağından alınan floresan görüntü, yüksek sinyal yoğunluğu göstermiştir. Sinyal yoğunluğu ikinci günde düşmüş, ardından yedinci, 14. ve 21. günlere kadar stabil bir seviyeye yükselmiştir. Floresanstaki bu değişimler, sinyal yoğunluğu saniyedeki foton sayısı olarak ölçülerek kantifiye edildiğinde, enjeksiyondan bir gün sonra sinyal yoğunluğunda belirgin bir azalma gözlemlenmiş olup, bu durum GFP pozitif hücre sayısındaki azalmayı yansıtmaktadır.Buna karşın, yedinci, 14. ve 21. günlere gelindiğinde, sinyal yoğunluğu kas rejenerasyonunun gerçekleştiğini belirten stabil bir seviyeye yükselmişti. GFP etiketli hücrelerin enjeksiyonundan sonra rejenerasyon sürecindeki kasın ilerlemesini izlemek için in vivo floresan görüntülemenin nasıl kullanılacağını göstermiş olduk. Bu yöntemi kullanarak, her türlü floresan etiketli hücre enjeksiyonu sonrası kas rejenerasyonunun dinamiklerini inceleyebiliyoruz.Görüntüler belirlenen aralıklarla invaziv olmayan yöntemlerle elde edilebildiği için, daha az hayvan ve daha hafif bir iş yüküyle daha doğru boylamsal veriler toplanabilir. Sabit ölçüm parametreleri kullanıldığında, aynı hayvanlardan zaman içinde alınan görüntüler nicel olarak karşılaştırılabilir olmalıdır. Arka planı azaltmak için kas üzerindeki cilt yüzeyinin temiz tutulması son derece önemlidir; bu nedenle bacakları örten tüm tüylerin temizlenmesi ve bölgenin pamuklu çubuklar veya pedlerle iyice silinmesi kesinlikle gereklidir.Ve unutmayın, tüm ölçümleriniz arasında tutarlılığı sağlamak için her seferinde aynı parametre setini kullandığınızdan emin olun. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

tracking-dynamics-muscle-engraftment-small-animals-vivo-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

In vivo biyolüminesans ve manyetik rezonans görüntüleme (i) ve (ii) post mortem histolojik analiz: Bu makale ile kemirgen beyinde hücresel greft multimodal görüntüleme için optimize edilmiş olaylar dizisi anlatılmaktadır. Tek bir hayvan bu görüntüleme yöntemleri birleştirerek, yüksek çözünürlüklü, duyarlılık ve özgüllük ile hücresel greft değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

Diffüz floresans tomografi preklinik için yüksek boyunca nispeten düşük maliyetli ve potansiyel bir yaklaşım...

Kanser BİYOMARKÖRLERİN Yerelleştirme Küçük Hayvanlarda Bilgisayarlı Tomografi eşliğinde Zaman alanı Diffüz Floresans Tomografi

Bu video, yeşil floresan proteini eksprese eden pankreas kanseri hücrelerinin farenin pankreasına ortotopik olarak implante edilmesi için protokolü göstermektedir. Ortotopik fare modeli, yeni terapötiklerin primer ve metastatik tümörler üzerindeki etkinliğinin araştırılmasına yardımcı olur.

Floresan Ortotopik Fare Modeli: İn Vivo Tümör İlerlemesini Değerlendirmek için GFP İfade Eden Kanser Hücrelerinin Fareye İmplante Edilmesi

Miyoblast ekiminin başarısını değerlendirmek için bir non-invaziv yollarla açıklanmıştır. Yöntemi olan ifade farklı görüntüleme yöntemleri ile görüntülenebilir genlerin oluşan birleşik bir füzyon muhabiri gen yararlanır. Burada, bir...

Nakledilen Muscle Progenitör Hücreler Hedefleyecek Moleküler Görüntüleme

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Farelerde floresan haberci kullanılarak, akciğer metastazı olan tümör hücre stromanın etkileşimleri ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit bir yöntem tarif eder. iplik disk konfokal mikroskopi kullanılarak, bu teknik, en az 4 saat boyunca canlı hücre görüntülenmesini sağlayarak ve diğer enflamatuar akciğer koşulları incelemek için adapte edilebilir.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Ardışık kriyo-bölümleri tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ekspresyonu ölçümleri için histolojik uygulamalar ve RNA zenginleştirme sağlamak için toplanır. doğrudan uygulamalar arasında karşılaştırılmıştır toplanmış cryosections ve ölçümlerin 30 mg - Yüksek kaliteli RNA 20 elde edilir.

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

Biz kanseri metastaz preklinik vivo içinde takibi için bir iletişim kuralı tanımlamak. Non-invaziv [18F] tetrafluoroborate-evde beslenen hayvan ve aerodinamik ex vivo onay floresan bir protein tarafından algılanan sodyum iyodür simporter birleştiren bir radyonüklid Floresans muhabir dayanmaktadır. Preklinik in vivo hücre tümör biyolojisi izleme için uygun bir yöntemdir.

Kemirgen tümör modelleri ilerlemesinde tümör izlemek için Imaging radyonüklid Floresans muhabir gen

Bu makalede, kemirgen gastroknemius kası üzerinde in vivo (yüzey ve iğne elektrot dizileri kullanılarak) ve ex vivo (dielektrik hücre kullanılarak) elektriksel empedans miyografisinin nasıl yapılacağı açıklanmaktadır. Hem farelerde hem de sıçanlarda tekniği gösterecek ve mevcut modifikasyonları detaylandıracak (yani, obez hayvanlar, yavrular).

Kemirgenlerde In Vivo ve Ex Vivo Elektriksel Empedans Miyografisi Gerçekleştirme

Öğrenin, GFP işaretli miyoblastlar kullanarak farelerde kas rejenerasyonunu canlı floresan görüntüleme ile izleme yöntemini. Bu teknik, uzunlamasına çalışmalarda daha az hayvan kullanarak doğru veri toplamayı sağlar.

Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme

Daha fazla video keşfet