Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

Merhaba, ben Cecilia Owens Laboratuvarı'ndan Hillary Kemp. Ve ben Cecilia Owens. Hillary ve ben Seattle'daki Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi'nde temel bilimler bölümündeyiz.

Bugün size genetik mozaikler olarak da bilinen kimerik zebra balığı embriyoları yapmak için bir teknik göstereceğiz. Bu prosedür, gelişim sırasında gen fonksiyonunun hücresel temelini değerlendirmemizi sağlar. Belirli bir genin, hücre özerk işlevi olarak bilinen mutant bir fenotipe sahip hücreler içinde mi yoksa hücre özerkliği olmayan olarak bilinen hücre ortamı içinde mi işlev gördüğünü sorabiliriz.

Bu mozaikleri, blastula veya erken gastro evrede vahşi tip mutant embriyolar arasına hücre naklederek yapıyoruz. Daha sonra, konakçı ortamlarında donör türetilmiş hücrelerin fenotipini ve genotipini gözlemleyerek gen fonksiyonunu değerlendiriyoruz. Öyleyse başlayalım.

Protokolün bu bölümünde, donör embriyosuna bir soy boyası enjekte edilir, böylece donör kaynaklı hücrelerin nakil sonrası kaderi takip edilebilir. Bu teknik kullanılarak herhangi bir çeşitlilikte nükleik asit de enjekte edilebilir, ancak DNA enjekte ederken dekorasyon adımını atlayın Embriyolarla çalışmadan önce, bir Petri kabının en geniş kısmı boyunca 45 derecelik bir açıyla bir cam slayt yerleştirerek bir enjeksiyon kabı hazırlayın. Dörtte üçü kalem streptokok embriyo ortamında% 1.2 aros ile doludur.

Eğimli bir oluk yapmak için agro setlerinden sonra slaydı çıkarın. Tekneyi kalem strep embriyo ortamı ile doldurun. Şimdi tek hücre aşaması embriyolarının enzimatik dekorasyonuna devam edin.

Embriyoları bir hücre aşamasında, mililitre başına 0.5 miligramda bir ila beş dakika boyunca inkübe edin. Pronaz çözeltisi. Dekorasyonu yakından izleyin.

Korion gözle görülür şekilde çökmeye başlar başlamaz, embriyoları sistem suyuna batırın Ve bu tüm koryumu döküyor ve embriyolar gaga eğrisinin dibinde geride kalıyor. Ve embriyoların suyun yüzeyine sadece bir kez daha çarpmaması gerçekten önemlidir ve çoğunun corion'u çıkar. Dışarıda dönmeyen birkaç

Eğer hala corion'unda bir şey varsa, o zaman onları bu şekilde pipetleme eylemi onları dışarı çıkaracak ve daha sonra embriyoları serbest bırakacak, böylece asla su yüzeyine çarpmayacaklar. Kaplanmış embriyoları, kenarlarını düzleştirmek için ateşle parlatılmış bir pipetle tutmak önemlidir. Kırılgan dec kaplı embriyoları, geniş delikli ateşle parlatılmış cam pipet kullanarak enjeksiyon kabının oluğuna nazikçe aktarın.

Ve sonra bu çukura tek bir dosya yüklüyoruz. Artık embriyolar, hassas bir şekilde kalibre edilmiş bir ateş, çekilmiş cam enjeksiyon pipeti ve bir basınçlı enjeksiyon teçhizatı kullanılarak soy işaretleyici ile enjekte edilmeye hazırdır. İğneyi kırmak için embriyo ortamıyla dolu bir tabak ve iğneyi kalibre etmek için yağ dolu bir tabak kullanacağız.

Bu sadece normal bir standart laboratuvar sınıfı mineral yağdır. Bir çift keskinleştirilmiş saatçi forsepsi alıyoruz ve sonra doğru boyutun ne olacağını belirlemek için göz merceklerine bakarken, forsepsleri iğnenin her iki tarafına da koyuyoruz ve sonra çipi nazikçe kırıyoruz, ki bunu aslında bakmadan yapamam Verilen boya veya ribonükleotidin hacmini belirlemek için. Başlamadan önce.

Bolus boyutunu bir mineral yağ kabında ölçün. İğne, mikro enjektörün bir veya iki darbesi ile bir nanolitrelik bir bolus verilecek şekilde kırılmalıdır. Bolusun hacmi, bir mercek mikrometresi ile ölçülen çapından hesaplanabilir.

Bir nanolitre% bir ila% 3'lük floresan dekstran çözeltisini, bir ila dört hücre aşamaları arasında kaplanmış embriyoların ylk'sine doğrudan enjekte edin. Yapacağım şey embriyoyu iğnenin tam altına yerleştirmek. İğneyi nazikçe yumurta sarısının ortasına batıracağım ve ayak pedalına basacağım.

Enjekte edildikten sonra, boyanın hücrelere taşınması için yumurta sarısı akışlarına enjekte etmek önemlidir. Bu enjeksiyon, kimerik embriyolardaki hücreleri birkaç günlük gelişim boyunca izlemek için yeterli olacaktır. İdeal olarak, bunu hücreler dört hücre aşamasına ulaşmadan önce yaparız, Enjekte edilen embriyoları taze kalem streptokok embriyosu ile doldurulmuş kaplanmış bir Petri kabında düşük yoğunlukta yükseltin. Orta.

Enjekte edilen embriyoların biraz yavaşlamış bir gelişim hızına sahip olma eğiliminde olduğunu, embriyoları gelişimlerini kademelendirmek ve nakillerin gerçekleştirilebileceği zaman penceresini en üst düzeye çıkarmak için 25, 28 ve 31 santigrat derece gibi farklı sıcaklıklarda kuluçkaya yatırdığını unutmayın. Zebra balığı blastulasında hücre nakli için kullanılan aparat, üç yollu bir durdurma musluğu ile bir mineral yağ rezervuarına ve bir uzunlukta esnek boru aracılığıyla bir mikro pipet tutucusuna bağlanan, tahrik kontrollü bir Hamilton şırıngasından oluşur. Emme ve basıncı kontrol etme yeteneğinizi bozacağı için sistemdeki tüm hava kabarcıklarını ortadan kaldırın.

En az DX büyütmeli yüksek kaliteli optiklere sahip bir stereo mikroskop kullanın. Mikro pipet tutucunun ve iğnenin konumunu kontrol etmek için bir NARA shige manuel mikro manipülatör öneririz. Titreşimlerin nakil işlemine aktarılmasını önlemek için manyetik bir taban kullanılarak tezgaha sabitlendiğinden emin olun.

İğne nakli iğneleri, bir elektrot poları üzerinde hafif bir konikliğe çekilen cam kılcal pipetlerden yapılır. Pipetleri diseksiyon mikroskobu altında çekmeyle ilgili ayrıntılar için Miriam Goodman'ın laboratuvarından JoVE protokolüne bakın, çekilen iğnenin ucunu kırın. Blastula evresi nakilleri için, iğnenin dış çapı yaklaşık 50 ila 60 mikron veya gastro evre transferi için 30 ila 40 mikron arasında olmalıdır.

Penetrasyonu iyileştirmek için bir gastro aşama transferi için, önce bir mikro yem kullanılarak iğnenin ucuna keskin bir diken çekilmesi, iğnenin ucunu mikro dövmenin filamentine yaklaştırarak düzleştirilmesi gerekir. Ardından iğneyi, eğimin ön kenarı filament ile temas edebilecek şekilde çevirin. İğnenin ön kenarı filamente temas ettiğinde, bir diken oluşturmak için hızlı bir şekilde çekin.

Hücrelere zarar vermemek için, diken düz olmalı ve iğnenin ucu eğri olmamalıdır Teçhizat ve nakil iğneleri hazırlandıktan sonra, kimerik embriyolar yapmaya hazırsınız. Blastula nakli, ince kader haritası bilgisinin gerekli olmadığı durumlarda embriyolar arasında hücre nakli yapmak için kullanılır. İlkel germ hücreleri dışında, çoğu hücre genellikle bu aşamada bir kadere bağlı değildir.

Blastulanın kader haritası, ektodermi ortaya çıkaracak hücreleri ve mezodermi ortaya çıkaracak hücreleri ayırt edebileceğimiz şekildedir. Mezodermal ve endodermal, blastula evresindeki embriyonun kenarına yakın bir yerde bulunurken, sinir sistemine ve yüzey dermine yol açacak olan dermal progenitörler, embriyonun kenarından daha uzakta yer alır. Bu nedenle, hücreleri blastula evresindeki embriyolara naklettiğimizde, bu hücreleri varsayımsal mezoderme veya varsayımsal ektoderme hedefleyebiliriz.

Ancak hücreleri ektodermin veya mezodermin belirli bir bölgesine hedefleyemeyiz çünkü bilmiyoruz. Embriyonun dorsal tarafının olduğu blastula aşamasında, yarısı embriyo ortamında erimiş %1.2 aros ile doldurulmuş bir Petri kabında eşleştirilmiş kama şeklinde çıkıntılara sahip plastik bir kalıbı yüzdürerek enjeksiyon kaplarını önceden hazırlayın. Aros katılaştıktan sonra, her biri bir embriyoyu tutacak kadar büyük üçgen şekilli kuyucuk sıraları bırakarak şablonu çıkarın.

Transplantasyon kalıbını kalem strep embriyo ortamı ile doldurun ve blastula evresi embriyolarını ateşle parlatılmış bir cam pipet ile her bir oyuğa ayrı ayrı yükleyin. Şimdi embriyoları nakil kuyularına aktarın, başlangıçta yanlarında yatmalarına izin verin. Embriyoları, donör embriyolar bir sütuna yerleştirilecek ve konakçı embriyolar bitişik sütuna yerleştirilecek şekilde düzenleyin.

Çanağı, transplantasyon iğnesi bir embriyoya girdiğinde, iğne embriyoyu kuyusunun arka duvarına doğru itecek şekilde sahneye yerleştirin. Mikro manipülatörü kullanarak, nakil iğnesini oldukça dik bir açıyla tabağa indirin. İdeal olarak, nakil iğnesi embriyoya yaklaşık 45 derecelik bir açıyla girmelidir.

İğnenin ucu embriyo ortamının yüzeyinin altına geldiğinde, Hamilton şırıngasını kontrol eden mikrometre sürücüsünü çevirerek iğneye az miktarda embriyo ortamı çekin. En hassas kontrol için, mineral yağ ile embriyo ortamı arasındaki arayüz, iğnenin ince konik kısmında, uca çok yakın olmayacak şekilde kalmalıdır. Donör embriyoyu iğne ile nazikçe konumlandırın ve ardından iğneyi geri çekin ve istenen pozisyonda embriyonun blastula başlığına girin.

Hızlı ve sert bir vuruş, embriyonun yuvarlanmasına neden olmadan embriyoya nüfuz edecektir. Hücrelerin kesilmesini önlemek için donör hücreleri yavaş ve dikkatli bir şekilde iğneye çekin. İstenilen sayıda hücre alındıktan sonra iğneye yumurta sarısı almaktan kaçının.

Emmeyi durdurmak için basıncı hafifçe ters çevirin ve iğneyi ana embriyoyu yerine getirmek için çıkarın. Transplantasyon çanağını hareket ettirerek, yumurta sarısına dokunmamaya özen gösterildiği sürece, transplantasyon iğnesi kullanılarak nazikçe döndürülerek konakçı embriyonun pozisyonunda küçük ayarlamalar yapılabilir. Donör hücreleri konakçı embriyoya atarken, tek bir donörden gelen donör hücrelere zarar vereceği ve öldüreceği için embriyoya ylk almaktan kaçının, hücre transferleri tamamlandıktan sonra birden fazla konakçıya nakledilebilir.

Geliştirmeye devam etmek için donör konak çiftlerini 24 oyuklu bir plakanın kaplanmış kuyucuklarına aktarın. Blastula evresinde hücrelerin belirli kaderlere bağlı olmaması kuralının tek istisnası, ilkel germ hücreleridir. İlkel germ hücresi hücreleri, gelişimin çok erken dönemlerinde belirlenir ve ilkel germ hücresi durum kaderlerine bağlıdır.

Çok erken bir aşamadan itibaren, ilkel germ hücreleri bir blastula ve bir gast aşaması embriyosunun kenarına yakın bir yerde bulunur. Eğer transplantasyon deneyinin amacı ilkel germ hücrelerini nakletmekse, o zaman hücrelerin donör embriyoda nereden geldiği çok önemlidir ve konakçı embriyoda nereye gittikleri önemli değildir. Yani kural şu ki, somatik hücreler için, kaderlerini belirleyecek olan konakçı embriyoda nereye gittikleri önemlidir.

İlkel germ hücreleri söz konusu olduğunda, donör embriyoda nereden geldikleri önemlidir çünkü kaderleri zaten belirlenmiştir. Eğer amaç ilkel germ hücrelerini nakletmekse, o zaman bu, hücrelerin donör embriyonun umudunun kenarından alınması gerekir ve bu tabakadaki üç veya dört hücrenin her birinin dört küçük kümesi halinde embriyonun kenarına yakın bir yerde bulunurlar, bu mızrak aşaması veya gelişimin yüksek aşaması. Ve yanlışlıkla yumurta sarısını emmeye başlamamak için onları çok dikkatli bir şekilde toplamalısınız.

Tamam, orada yaptığım şey buydu ve şimdi bir konak embriyosuna geçiyorum. Şimdi ilkel germ hücreleri, içinde bulundukları embriyonun genital sırt bölgesine bilenecek. Bu nedenle, bu ilkel germ hücrelerini kendilerinin ulaşacağı sınıra nakletmeye gerek yoktur.

Bu yüzden sadece naklediyorum, onları herhangi bir eski yere, post embriyoya geri koyuyorum. Diğer herhangi bir nakil türünün tam tersi olan germ hücre naklinin anahtarı, donör hücrelerin nereden geldiğinin önemli olmasıdır. Hücrelerin gastro aşamadaki bir konakçıya nakledilmesi, deneycinin embriyonik kalkan görünür hale geldiğinde ortaya çıkan zebra zebra balığı kader haritasından yararlanmasını sağlar.

Farklı doku tiplerinin yanı sıra varsayımsal merkezi sinir sistemi içindeki alanları ayırt etmek mümkün hale gelir. Gastro liste aşamasında embriyolar arasında hücre transferi yapılırken protokolde bazı farklılıklar vardır, ancak genel prosedür gastros mount etmek için blastos ile çalışmaya benzer. Önce bir cam çöküntü slaytının çöküntüsüne dikey bir Metilselüloz şeridi sürün, ardından ateşle parlatılmış bir pipet transferi kullanarak bol miktarda kalem streptokok embriyo ortamı ile doldurun.

Bir donör ve üç kalkan aşaması depresyon slaydına ev sahipliği yapar. Ev sahiplerinden biraz daha genç olan donör embriyoları seçin. Gastros yapıştırıcısını, iki kiloluk kısa bir test misinasının uçlarını bir kılcal borunun ucuna manipüle etmek için yeni bir alet gereklidir.

Böylece küçük bir döngü oluşturur. Donörü ve ev sahibi embriyoları Metilselüloz şeridinin üstüne nazikçe yuvarlamak için halkayı kullanın ve güvenli olana kadar Metilselülozun içine doldurun. Bunları, hedeflenen bölge en üstte olacak şekilde yuvarlayın.

Nakil sırasında iğne, donör hücreleri ylk'ye zarar vermeden vermek için embriyoya teğet olarak girecektir. Gastro evre nakilleri en iyi şekilde sabit aşamalı bir bileşik mikroskopta gerçekleştirilir. Transplantasyon iğnesinin ucunu odağa getirmek için mikro manipülatörün kontrollerini kullanın.

Mikro pipet tutucuyu ve iğneyi, sürgü üzerindeki girintinin kenarının izin verdiği kadar yataya yakın olacak şekilde oldukça sığ bir açıyla konumlandırın. Sonra donör embriyoyu delin. Düzgün bir şekilde monte edilirse, embriyo iğnenin kolayca nüfuz etmesine izin vermeyecek kadar eski olmadıkça, nakil iğnesi girerken yuvarlanmayacaktır.

Ylk'nin delinmesini önlemek için, iğne embriyoya EDL'ninkinden biraz daha derin bir odak düzleminde girmelidir. Delindikten sonra, üç adede kadar konak hücre enjeksiyonu için donörden çok sayıda hücre çıkarılabilir. Hücreleri çizerken, istenirse hücreler alınırken iğneyi hareket ettirerek yumurta sarısını emmekten kaçının.

Hücreleri konakçıya çıkarmadan önce aynı iğne kullanılarak daha fazla hücre için ek embriyolar hasat edilebilir, hücre ejektörlüğü sırasında konakçı embriyoya hücre fırlatılırken, hücreleri tek bir küme halinde biriktirmek yerine, iğne hedeflenen alandan çekilirken hücreleri dışarı atar. Bu, donör hücrelerin istenen dokuya katkıda bulunma olasılığını artıracaktır. Hücre transferleri tamamlandıktan sonra, tüm slaytı bir Petri kabına yerleştirin ve dikkatlice kalem streptokok embriyosu ile doldurun. Orta.

Önümüzdeki birkaç saat içinde, metilselüloz çözülerek embriyoları serbest bırakacaktır. Aktarılan hücre sayısı, deneyin özel amacına bağlıdır. Tek bir donörden alınan hücreler, nakilden sonraki sabah üç veya dört konakçıya nakledilebilir.

Donör hücre hedeflemesinin başarılı olup olmadığını belirlemek için konakçılar incelenebilir. Blastula yaşından itibaren primordiyal germ hücrelerinin başarılı bir şekilde transplantasyonu, ylk ve ylk uzantısı arasındaki bağlantı noktasına yakın ventral olarak konumlandırılmış floresan işaretli hücrelerle sonuçlanır. Bu yüzden size gastrula ve blastula evresi nakillerinin nasıl yapıldığını gösterdik.

Bu tekniği yaparken, hücrelerinizle hedeflemeyi umduğunuz hedef doku için doğru nakil yöntemini seçmek önemlidir. Bu nedenle blastula evresi nakli, ektoderme karşı derme giden hücreleri belirlemek için yeterlidir. Ve bu tekniği ilkel germ hücrelerini hedeflemek için de kullanabilirsiniz.

Daha ince haritalama yapmak isterseniz, sırt tarafının zaten belirlenmiş olduğu bir gastros yaş nakli kullanmak daha iyidir. Ve bu teknikle, hücreleri sinir sisteminin çeşitli bölgelerine, özellikle ön beyin, orta beyin, arka beyin ve omuriliğe hedefleyebilirsiniz. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için çok teşekkürler ve tüm deneylerinizde bol şans.