Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

Merhaba, ben California Davis Üniversitesi, Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü'nden Bruce Draper ve Seattle'daki Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi Temel Bilimler Bölümü'nden Cecilia Moans. Bugün, Cecilia ve ben, orijinal Brian Harvey protokolünün bir modifikasyonu olan zebra balığı sperm ağlaması koruma protokolünü göstereceğiz. Size iki kişilik ekipler halinde çalışarak, 100 ayrı erkekten alınan spermleri iki saatten kısa sürede dondurarak saklamanın mümkün olduğunu göstereceğiz.

Çözüldükten sonra geniş bir doğurganlık aralığı olsa da, ortalama olarak% 25 doğurganlık alıyoruz ve bu, yedi yıldan fazla bir süredir dondurularak saklanan bir kütüphaneden. Öyleyse başlayalım. Bu işlemi gerçekleştirmeden önce sperm dondurma solüsyonlarını yapın.

Ginsburg Fish ringer çözeltisi her üç günde bir taze yapılır ve dondurma ortamı metanollü ve metanolsüz günlük olarak taze yapılır. Bu çözümlerin bileşimi, bu protokole eşlik eden çevrimiçi ek bilgilerde bulunabilir. Bu prosedürde kullanılan malzemeler donma ve çözülme oranını etkileyebilir ve bu da donmuş spermin doğurganlığını etkileyebilir.

Bu nedenle, önerilen materyallerin bir listesi de ek çevrimiçi bilgi olarak sağlanmaktadır. Spermi kuru buz topaklarının aksine ince ezilmiş kuru buz üzerinde dondurmak en iyisidir. Kuru buzu kırmanın basit bir yolu, onu bir havluya sarmak ve bir çekiçle toz haline getirmektir.

Daha verimli bir yöntem, zebra balığı spermlerini dondurmak için pençeler ve model RE iki gibi kuru bir buz değirmeni kullanmaktır. İlk olarak, 10 mikrolitrelik kılcal tüpleri 3.33 mikrolitre seviyesinde bir laboratuvar kalemi ile veya alttan yaklaşık 16.7 milimetre işaretleyin, erkekleri uyuşturmak için iki ila dört erkeği seyreltilmiş trica ve balık suyu içeren bir behere yerleştirin. Tarif zebra balığı kitabında bulunabilir.

Anestezi uygulandıktan sonra, balığı plastik bir kaşık kullanarak anesteziden çıkarın ve bir kağıt havlu üzerinde nazikçe kurulayın. Ventral tarafı çizmeye özellikle dikkat edin. Su, spermi aktive eder, bu nedenle ika çevresinde iyice kuruması çok önemlidir.

Balıkları ventral tarafı yukarı bakacak şekilde sünger tutucuya yerleştirin. Pelvik yüzgeçlerin etrafındaki bölge hala nemliyse, bir Kim mendiliyle nazikçe kurulayın. İşaretli kılcal boruyu, kılcal borularla birlikte verilen lastik ağızlı bir pipet adaptörüne yerleştirin.

Adaptör, bir ucunda ağızlık ve diğer ucunda kılcal tutucu bulunan kauçuk bir hortumdur. Alternatif olarak, kılcal boru 50 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngaya bağlanabilir. Uygun çapta kısa bir tigon borusu parçası kullanarak, erkeği dürbünün altına yerleştirin ve pelvik yüzgeçleri dikkatlice açarak ürogenital açıklığı ortaya çıkarın.

Kılcal borunun ucunu kullanarak, balığın kenarlarını düz forsepslerle nazikçe okşayarak veya balığın kenarlarını işaret parmağı ve başparmağınızla hafifçe sıkarak spermi bir kılcal tüpte toplayın, nazik emme kullanılarak dışarı atılır. Sperm ile dışarı atılabilecek dışkıdan kaçının. Hedef sperm hacmi 3.3 mikrolitredir.

Kabul edilebilir minimum sperm miktarı, spermin kalitesine bağlı olarak değişir. İyi sperm beyaz ve opaktır, gözenekli sperm ise sulu görünür. Genel olarak, kabul edilebilir minimum sperm miktarı, bir mikrolitre iyi sperm veya hedefin üçte biri ve iki mikrolitre gözenek spermi veya hedefin üçte ikisidir.

Sperm hacmi 3.3 mikrolitrelik hedef hacme ulaşmazsa, metanol içermeyen dondurma ortamı kullanarak hacmi kalem işaretine normalleştirmek gerekir. Sperm hacmi kılcal boru üzerindeki kalem işaretine zaten ulaşır veya aşarsa, bir sonraki adıma geçin. Şimdi kriyoprotektanı sperme ekleyin.

Metanol ile donma ortamını turuncu işarete kadar emdirin. Yaklaşık toplam hacim şimdi 20 mikrolitredir. Sperm ve kriyoprotektan karışımını, yaklaşık dört kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırılmış bir saat camının temiz bir alanına boşaltın ve kabarcık oluşturmaktan kaçının.

Her etiketli şişenin dibine 10 mikrolitre sperm kriyoprotektan solüsyonu pipetleyerek spermi iki kriyo şişesine ayırın. Hızlı hareket ederek, şişeleri kapatın ve her bir kriyo şişesini ayrı bir 15 mililitrelik şahin tüpüne bırakın. Oda sıcaklığında, şahin tüplerini kapatın ve ince toz haline getirilmiş kuru buzun içine yerleştirin.

Tüpler, şahin tüplerini takip etmek için sadece kapaklar görünecek şekilde yeterince derine yerleştirilmelidir. Bunları numaralandırın ve her bir tüpün kuru buza girdiği süreyi kaydedin. Spermin kuru buzda 20 dakika donmasına izin verin.

Sperm dondurulduktan sonra, iki kriyo şişesini sıvı nitrojen içeren bir doer şişesine aktarın. Geçici depolama için. Dondurucu kutusunu, numunelerin ısınmaması için sıvı nitrojen banyosuna yerleştirin.

Şişeleri şişeden kurtarmak için uzun metal maşa kullanın ve bunları kriyo eldivenlerle tutun. Alternatif olarak, kriyo şişeleri doğrudan kuru buzdan dondurucuya aktarılabilir. Dondurucu kutusu, uzun süreli saklama için strafor bir kapta sıvı nitrojene daldırılmış halde tutulursa, kriyo şişelerini kriyojenik bir sıvı nitrojen dondurucuya yerleştirin.

Sperm canlılığını korumak için, şişelerin sıvı nitrojene daldırılmış olarak saklanması çok önemlidir, buhar fazında saklanan şişeler zamanla canlılığını kaybedebilir. Hız, sperm canlılığının korunmasında da kritik öneme sahiptir. Kriyoprotektanın eklenmesi ile sperm şişelerinin kuru buza yerleştirilmesi arasındaki süre 30 saniyeden fazla olmamalıdır İn vitro fertilizasyon.

Kriyo ile korunmuş sperm kullanmak iki kişiyle en iyi sonucu verir. Bir kişi dişilerden yumurta sıkarken, diğer kişi spermi çözer. Bir su banyosunu 33 santigrat dereceye ayarlayın.

Sıvı nitrojen dondurucudan bir kriyo şişesi çıkarın ve çözülmeye hazır olana kadar D içeren bir sıvı nitrojen veya şişeye aktarın. Anestezi uygulanmış dişilerden alınan yumurtaları 35 milimetrelik plastik bir Petri kabına sıkın. Bu, zebra balığının ayrıntılı bir tanımını sağlayan Gyno Genetic'in zebra balığını erken basınçla konuşlandırması başlıklı JoVE protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

İn vitro fertilizasyon, iyi bir debriyaj, düzgün ve sarımsı olan 150'den fazla yumurta içerir. Herhangi bir beyaz kalıntı, bozulmanın göstergesidir. Mümkünse, üç kavrama yumurta elde etmeye çalışın ve bir tabakta birleştirin.

İlk debriyajdan sonraki bir dakika içinde üç iyi debriyaj elde edilmezse, bir sonraki adıma geçin. Sperm çözülürken tabağı kapalı tutun. Bu arada, şişeyi sıvı nitrojenden çıkarın ve kapağı çıkarın.

Şişeyi sekiz ila 10 saniye boyunca 33 derecelik bir su banyosuna yarıya kadar hızlı bir şekilde daldırın. 70 mikrolitre oda sıcaklığında, Hank'in tamponlanmış tuz solüsyonunu hızlı bir şekilde şişeye ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın, hemen Petri kabındaki yumurtalara ekleyin ve pipet ucuyla hafifçe karıştırın. Daha sonra 750 mikrolitre balık suyu ekleyerek sperm ve yumurtaları hemen aktive edin, karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Beş dakika sonra, tabağı balık, su ile doldurun ve 28 santigrat derecede inkübe edin. İki ila üç saat sonra, canlı embriyoları sayın ve tabak başına 50 embriyoda 100 milimetrelik tabaklara aktarın. Ayrıca sperm örneğinin doğurganlığının belirlenebilmesi için döllenmiş yumurtalara güvenin.

Sperm doğurganlığı, canlı embriyoların invitro fertilizasyon için kullanılan toplam yumurta sayısına oranıdır. Yumurtalar, in vitro fertilizasyondan iki ila altı saat sonra herhangi bir zamanda sıralanabilir. İnfertil yumurtalar canlı embriyolardan kolayca ayırt edildiğinde, infertil yumurtalar berrak ve bölünmezdir.

Stereo mikroskopta trans aydınlatma ile görüntülendiğinde, dondurularak saklanmış spermin ortalama doğurganlığı büyük ölçüde değişir. Bununla birlikte, birkaç yıl boyunca stabil olan ortalama% 25'lik bir doğurganlık elde etmek mümkün olmalıdır. Bu grafik, 2001 ve 2003 yılları arasında dondurulan ve 2008 yılına kadar düşünülen spermlerin ortalama doğurganlık yüzdesini göstermektedir.

Sıfır balık spermini koruyarak ağlamak için yüksek verimli bir yöntem gösterdik. Bu protokolü yaparken, önerilen tüm plastik aşınma ve ekipmanların kullanılmasının yanı sıra kuru buz peletleri yerine toz haline getirilmiş kırılmış kuru buz kullanılması önemlidir. Gerçekten yüksek kaliteli sperm ve yumurta kullanmak çok önemlidir ve in vitro fertilizasyon yapılırken yumurtalar söz konusu olduğunda, spermi tıraşladıktan sonra, diğer uçta elde ettiğiniz verimli embriyoların sayısını artırmak için mümkün olduğunca çok sayıda yumurta kullanmak önemlidir, Bu da üç ila dört Dişi alabilir, Sağ?

Protokolün bir diğer önemli bileşeni de hızdır. Spermin erkekten eksprese edilmesinden kuru buza konulmasına kadar geçmesi asla bir dakikadan fazla sürmemelidir. Sanırım bu kadar.

Deneylerinizde iyi şanslar.