Name: Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-06T19:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Öğrenin zebra balığı sperm kriyoprezervasyonu için yüksek verimli bir yöntemi. Bu protokol %25 ortalama fertilite oranı sağlar ve yedi yıldan fazla saklama süresi sunarak uzun vadeli genetik çalışmalara destek olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, R01 HG002995 tarafından desteklenen &quot;Zebra balığı Genom Baskı çıtası: Ters Genetik Yaklaşım&quot; CBM.

Bölüm A: Sperm Dondurma Çözümleri 1. Ginsberg Balık Ringers (her 3 günde bir, taze olun; Ginsburg, 1963) NOT: EK SİPARİŞ YAĞIŞ ÖNLEMEK İÇİN ÖNEMLİ 450 ml steril ddH2O çözülür: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0.125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0,175 g Daha sonra ekleyin: </li><li> NaHCO3 0.10 g </li></ul> 4 steril ddH2O ve mağaza ° C ile son hacim 500 ml getirin 2. Donma Orta (taze günlük yapın) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> Metanol OLMADAN <ul><li> Ginsburg Balık 10 ml Ringers (oda sıcaklığında). </li><li> Toz Yağsız Süt 1.5 gram </li></ul></li><li> Metanol ile NOT: EK SİPARİŞ YAĞIŞ ÖNLEMEK İÇİN ÖNEMLİ <ul><li> Ginsburg Balık 9 ml (oda sıcaklığında) Ringers </li><li> Metanol 1 ml </li><li> Toz Yağsız Süt 1,5 g </li></ul> Dondurma medya montaj sonra, 20 dakika süreyle iyice karıştırın. orbital çalkalayıcı ya da rocker. Kullanmadan önce, içine kısım 1 ml Eppendorf tüpleri, yüzeyinde kabarcıklar kaçınarak. </li></ol> Bölüm B: sperm dondurmak için gerekli malzemeler Sperm dondurma için gerekli malzemeler <ol><li> 10 ul tek kullanımlık pipetler (Fisherbrand kedi # 22-358.697) </li><li> MESAB / Tricaine içeren balık su için 250 ml bardak </li><li> izlemek camlar (Pyrex kedi # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (veya eşdeğeri) ve ipuçları </li><li> Sünger balık tutucu (sıkma sırasında erkek tutun) </li><li> Yukarıdaki sahne aydınlatma ile mikroskop Diseksiyon </li><li> Düz forseps (örneğin Millipore tipi) </li><li> 2.0ml kriyojenik şişeleri (Corning kedi # 430.488) </li><li> 10X10 cryoboxes (Nalgene kedi # 03-337-7AA) </li><li> Strafor konteyner ile dolu ince ezilmiş kuru ice1 ~ 15 cm </li><li> 15 ml konik tüpler (Falcon # 352.099) </li><li> Sıvı azot içeren Dewar şişesi </li><li> Uzun maşa (mesela, CMS Fisher Sağlık Bakım kedi # 10-316B) </li><li> Cryogloves </li><li> Erkekler için Kirli su tankı </li><li> Bir Eppendorf tüp metanol olmadan dondurma medya ile dolu </li><li> Bir Eppendorf tüp metanol ile dondurma medya ile dolu </li><li> Cryofreezer (örneğin Taylor-Warton K-serisi) </li></ol> 1 ince ezilmiş kuru buz yapmak için basit bir yöntem, bir havlu sarın ve bir çekiç ile ezebileceği . Daha etkili bir yöntem, bir kuru buz değirmeni, örneğin Clawson model RE-2 kullanmaktır. Bölüm C: Sperm Dondurma Yöntemi <ol><li> Kapiller BORULAR MARK: başlangıcına önce, (yani 16.7 mm alttan bkz. Şekil 1.1.) 3,33 ul düzeyinde bir laboratuar kalem ile 10μl kılcal tüpler işareti. </li><li> ERKEK uyutmak MESAB / tricaine (reçete) &quot;Zebra balığı Kitap&quot; balık su içinde seyreltilmesi içeren behere koyun erkek (ler): </li><li> KURU BALIK: Bir kez anestezi, anestezik bir plastik kaşık kullanarak balık kaldırın ve yavaşça ventral tarafında kuruma özel bir dikkat, bir kağıt havlu üzerine kuru balık blot . Lağım etrafında iyice kuruması için önemli böylece su sperm harekete geçirir. Sünger tutucu pozisyon balık, ventral yüzü yukarı (Şekil 1.2). Anal yüzgecinin etrafında bölgede hala bir kimwipe hafifçe kuru, nemli ise. Sperm erken sıkmak değil dikkat edin! </li><li> Place kılcal tüpleri ile birlikte lastik ağız pipet adaptörü kılcal tüp kutladı. Adaptörü, bir ucunda ağızlık ve diğer bir kılcal sahibi olan bir lastik hortum. Alternatif olarak, kılcal tüp, uygun çaplı Tygon boru kısa bir parça ile 50μl Hamilton şırınga bağlı olabilir. </li><li> Place kapsamında erkek ve kılcal tüp sonuna dikkatle kullanarak dışında pelvik yüzgeçler yayılmasını ürogenital açılış maruz. </li><li> SPERM TOPLAR: At pürüzsüz forseps (örneğin Millipore) balık tarafı hafifçe okşayarak tarafından sperm, ya da işaret parmağı ve başparmak arasında balık tarafını hafifçe sıkarak. Nazik vakum (Şekil 1.2) kullanılarak atılır kılcal tüp sperm toplayın. Sperm ile sınırdışı edilebilir dışkı kaçının. </li><li> Ul 3.3 İÇİN SPERM HACMİ normale hacmi, sperm ulaştığında ya da kapiller tüp (yani 16.7 mm veya daha fazla) kalem işareti aşarsa, daha sonra 8. adıma geçin . Sperm hacmi hedef hacim ulaşamazsa, daha sonra kalem işaretine Metanol (Şekil 1.3) OLMADAN Freeze Orta kullanarak hacim normalleştirmek. Kabul edilebilir minimum miktar sperm sperm kalitesi değişir. İyi sperm beyaz ve opak. Düşük sperm sulu görünüyor. 1 ul iyi sperm (ya da 1 / 3 hedef) ve 2 ul sperm (ya da 2 / 3 hedef): Genel olarak, asgari olarak kabul. Cilt şimdi 3.3 ul normalize. </li><li> SPERM İÇİN dölveriminin ADD: M İLE Donma Orta Suckturuncu işareti (Şekil 1.4 yaklaşık toplam hacmi 20 ul) etanol. Kabarcıkları tanıtmak için özel bir dikkat, bir saat camı temiz bir alan üzerine sperm ve dölveriminin karışımı boşaltınız. Yukarı ve aşağı pipetleme ~ 4 kez (kabarcıkları tanıtan kaçının) hafifçe karıştırın. </li><li> 10μl SPERM INTO 2 CRYOVIALS HER YERİ: sperm Pipet 10 ul ilgili bilgileri (Şekil 1.5) etiketli iki ayrı cryovials dibine dölveriminin çözüm. Hızlı, kap şişeleri taşıma ve oda sıcaklığında 15 ml Falcon tüpleri bir arada cryovial / tüp dibine bırakın. Cap Falcon tüp ve ezilmiş kuru buz içine cryovial içeren Falcon tüpleri çifti eklemek. </li><li> 20 MIN İÇİN SPERM FREEZE. KURU BUZ ON: Kuru buz, ince toz şeklinde değil, pelet olmalıdır . Tüpler, sadece kapakları (Şekil 1.6) yeterince derin kuru buz takılı olmalıdır. Kuru buz tüp takip etmek amacıyla, Falcon tüpleri her çift 1-20 (kapaklar üzerindeki yazılı) bir numara vermek ve kuru buz gitmek zamanların rekoru. </li><li> SIVI AZOT INTO YERİ CRYOVIALS: 20 dakika süreyle kuru buz dondurulmuş sperm edildikten sonra, sıvı azot içeren Dewar balon aktarabilirsiniz. Sperm sıvı azot dondurucu içine yerleştirmek saatine kadar burada saklanır. örnekleri ısınmasına kalmamak için sıvı nitrojen banyo dondurucu kutulara yerleştirerek, dondurucu kutusu. Dewar balon şişeleri kurtarmak ve cryogloves başa uzun metal maşa kullanın. Alternatif olarak, eğer dondurucu kutusu, plastik bir kap içinde sıvı azot içinde batırılır tutulur cryovials dondurucu kutusunun içine kuru buz doğrudan transfer edilebilir. </li><li> Kriyojenik sıvı azot dondurucuda saklayın cryovials uzun vadeli. Sperm canlılığı korumak için, şişeleri sıvı nitrojen içinde dalmış saklanır önemlidir. Deneyimlerimize göre, buhar fazında depolanan şişeleri zamanla canlılığını kaybeder. Hız önemlidir! Dölveriminin ekleyerek ve kuru buz sperm şişeleri yerleştirerek (yani adımları 6-10) arasında geçen süre en fazla 30 saniye olmalıdır. </li></ol> Bölüm D: kriyoprezervasyon Sperm Kullanımı, Tüp Bebek Yöntemi Biz bu iki kişi ile en iyi işe yaradığını bulabilirsiniz. Bir kişi, diğer kişinin sperm çözülür kadınlardan yumurta sıkar. <ol><li> Bir su banyosunda 33 ° C&#39;ye ayarlayın </li><li> Sıvı azot içeren Çözülme için hazır olana kadar Dewar balon, sıvı azot dondurucu ve transfer cryovial çıkarın. </li><li> 35mm plastik petri içine kadınlarda yumurta sıkın. Mümkünse, 3 debriyajlar yumurta elde etmek ve bir çanak birleştirmek için deneyin. İlk debriyaj 1 dakika içinde üç iyi kavramalar alamıyorsanız, o zaman (iyi bir kavrama yeterli olacaktır) 4. adıma geçin. Iyi kavrama tanımı:&gt; 150 düzgün güzel görünümlü yumurta (yani sarımsı, beyaz döküntüler ile bozulması göstergesidir). Sperm çözülmüş ise kapalı çanak tutun. </li><li> Sıvı azot flakon çıkarın ve kapağı çıkarın. 33 ° C su banyosunda 8-10 sn hızla batırmayın flakon ~ 1 / 2 yolu. </li><li> Hızla yukarı ve aşağı pipetleme tarafından şişe ve karıştırmak için 70 ul oda sıcaklığında Hanks ekleyin. Hemen yumurta ekleyin ve pipet ucu ile hafifçe karıştırın. </li><li> Gecikmeden 750 ul balık su ekleyerek, sperm ve yumurta etkinleştirin. Çalkalanarak karıştırılır. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 5 dakika sonra, 28 balık, su ve inkübe çanak çanak doldurmak ° C 2-3 saat sonra, sayım ve 100mm yemekleri (50/dish) bereketli embriyolar transfer. Infertil yumurta döllenme frekans tespit edilebilir, böylece güvenin. </li><li> Larvaların iyi dikkat edin! Ilk 5 gün için, günlük su değişimi ve ölü embriyolar kaldırmak. Sadece 5 gün kreş yüzmeye mesanesi larvaları koyun. </li></ol> Bölüm E: Temsilcisi Sonuçlar Biz 2001 ve 2003 yılları arasında toprağın işlenmesinde 8600 dondurulmuş sperm örneklerinin bir kütüphane yapmak için bu crypreservation metodoloji kullanılır. Bu örneklerin 106 çözülmüş ve doğurganlık tespit ettik. Doğurganlık canlı embriyoların in vitro fertilizasyon, dondurulmuş sperm ile döllenmiş yumurta toplam sayısına bölünmesiyle üretilen oranıdır. Taze (cryporeserved olmayan) sperm genellikle&gt;% 95 bereket vardır; Kriyoprezerve sperm, çok daha düşük doğurganlık: bir ortalama% 29 (n = 106 şişeleri). Doğurganlık flakon-flakon değişkenliği,% 1&#39;den daha az% 62 gibi yüksek değişen büyüktür. Bu değişkenlik, standart sapma Şekil temsil eden büyük bir hata çubukları tarafından temsil edilmektedir. 2. Ancak biz sadece bir kez, her iki sperm örnekleri 0% doğurganlık deneyimli ve ilgili toprağın işlenmesinde mutasyon kurtarmak için başarısız bugüne kadar çözülmüş 106 sperm örnekleri. Birkaç yıl boyunca kütüphane sperm şişeleri çözülme (2001-2008) bu yöntemle dondurulmuş sperm örneklerinin ortalama doğurganlık kalmasını buldukistikrarlı bir zaman içinde (Şekil 2). 2001 yılında çözülmüş dondurulmuş sperm örneklerinin ortalama doğurganlık 23.5 (% 11 sperm örnekleri üzerinde) oldu ve 2008 yılında 25 (% 21 sperm örnekleri üzerinde) oldu. Diğer araştırmacılar bir dizi şimdi kendi laboratuarlarında bu sperm dondurma protokolü kullanıyor. Bazı gözlediğimiz benzer doğurganlık oranları ve örnek-örnek değişkenliği ile iyi bir başarı bildirdin. Diğerleri bildirildiğine göre bu protokolü ellerinde çalışmasını sağlamak için başarısız oldu. Biz muhtemel sorunların kaynakları olduğuna inanıyoruz: <ol><li> , Farklı bir kuru buz soğutma oranı yol açan, protokol önerilen tam cryovials veya konik tüpler kullanmak durumunda </li><li> Bir alt-optimal soğutma oranı, toz, kuru buz kullanmak durumunda </li><li> Kötü doğurganlık erkek balık tek bir erkek sperm ul en az 1 almalısınız. Ayrıca taze sperm ile in vitro fertilizasyon yaparak erkek doğurganlığı test edebilirsiniz,% 100 doğurganlık yakın almak için çok az taze sperm alır, çünkü ancak bu yanıltıcı olabilir. </li><li> In vitro fertilizasyon, alt-standart kalitede yumurta kullanılması. Bir şey ama mükemmel debriyajlar kullanılması her zaman,% 0 doğurganlık yakın, aslında iyi doğurganlık (yinelenen flakonun doğurganlık dayalı) olan sperm örnekleri bile yol açar. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 sperm dondurma yöntemi şematik. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 kriyoprezervasyon sperm doğurganlık zaman içinde sabit kalır. Yüzde doğurganlık, dondurulmuş sperm ile döllenmiş yumurta toplam sayısına bölünmesiyle in vitro fertilizasyon üretilen canlı embriyo sayısı. &quot;N&quot;, doğurganlık ilgili yıl içinde test edildi Kriyoprezerve sperm şişeleri sayısını ifade eder. Hata çubukları standart sapma temsil eder. Her sperm flakon farklı bir erkek olduğu için, flakon-flakon değişkenlik görülmektedir.

<ol><li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li>
<li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li>
</ol>

Diğer araştırmacılar bir dizi şimdi kendi laboratuarlarında bu sperm dondurma protokolü kullanıyor. Bazı benzer bereket ve gözlediğimiz aynı örnek örnek değişkenlik bildirdin. Diğerleri bildirildiğine göre bu protokolü ellerinde çalışmasını sağlamak için başarısız oldu. Biz muhtemel sorunların kaynakları olduğuna inanıyoruz: <ol><li> , Farklı bir kuru buz soğutma oranı yol açan, protokol önerilen tam cryovials veya konik tüpler kullanmak durumunda </li><li> Bir alt-optimal soğutma oranı, toz, kuru buz kullanmak durumunda </li><li> Kötü doğurganlık erkek balık tek bir erkek sperm ul en az 1 almalısınız. Ayrıca taze sperm ile in vitro fertilizasyon yaparak erkek doğurganlığı test edebilirsiniz,% 100 doğurganlık yakın almak için çok az taze sperm alır, çünkü ancak bu yanıltıcı olabilir. Daha büyük, daha sağlam renkli erkekler genellikle daha yüksek kalitede sperm verir. </li><li> In vitro fertilizasyon, alt-standart kalitede yumurta kullanılması. Bir şey ama mükemmel debriyajlar kullanılması her zaman,% 0 doğurganlık yakın, aslında iyi doğurganlık (yinelenen flakonun doğurganlık dayalı) olan sperm örnekleri bile yol açar. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;l tek kullanımlık pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>Saat camları</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>2 ml kriyojenik tüpler</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>10 x 10 kriyoboxlar</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Maşalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>Kriyodondurucu</td><td>Taylor-Wharton</td><td>K-series</td><td>Örneğin</td></tr></tbody></table>

zebra balığı sperm kriyoprezervasyon için bir yüksek verim yöntem ve in vitro gübreleme

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Bu Harvey yöntemi (Harvey ve ark, 1982) bir uyarlaması olan zebrafish sperm dondurulması için bir yöntem. Biz de prosedür düzene ve örnek bütünlüğü artırmak, orijinal protokol iki değişiklik girmiştik. İlk olarak, sperm hacimleri dölveriminin içermez donma medyayı kullanarak tüm normalleştirmek. İkincisi, soğukta saklanan sperm kılcal tüpler yerine cryovials saklanır. (Δ ° C ​​/ saat) sperm dondurma ve çözme oranları muhtemelen bu yordamı kontrol etmek için iki en kritik değişkenler. Bu nedenle, belirtilen bu farklı tüpler yerine geçmez. 2 bu takımlar halinde çalışma ~ 2 saat içinde takım başına 100 erkeklerin sperm dondurmak mümkün. Sperm bu protokolü kullanarak, ortalama% 25 doğurganlık (in vitro fertilizasyon döllenmiş yumurta toplam sayısına bölünmesiyle oluşturulan canlı embriyo sayısı olarak ölçülen) ve bu yüzde doğurganlık, uzun yıllardır istikrarlı dondurularak saklanabilir.

Bu zebrafish yüksek verimlilik için bir sperm dondurulması protokol. Sperm bu protokolü kullanarak,% 25, ​​sonraki vitro fertilizasyon doğurganlık ortalama ve uzun yıllardır istikrarlı dondurularak saklanabilir.

Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

Bu, Harvey yönteminin (Harvey ve ark., 1982) bir adaptasyonu olan zebra balığı sperm kriyoprezervasyonu yöntemidir. Şunlarla ilgili iki değişiklik yaptık...

Merhaba, ben California Davis Üniversitesi, Moleküler ve Hücresel Biyoloji bölümünden Bruce Draper ve ben de Seattle'daki Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi, Temel Bilimler Bölümü'nden Cecilia Moans. Bugün Cecilia ile birlikte, orijinal Brian Harvey protokolünün modifiye edilmiş bir versiyonu olan zebra balığı sperm kriyoprezervasyon protokolünü uygulamalı olarak göstereceğiz. İki kişilik ekipler halinde çalışarak, 100 farklı erkek balığın sperm hücrelerini iki saatten kısa bir sürede kriyoprezerve etmenin mümkün olduğunu size göstereceğiz.Çözdürme sonrası fertilite oranları geniş bir yelpazede değişse de, ortalama %25 fertilite elde etmekteyiz ve bu sonuçlar yedi yılı aşkın süredir kriyoprezervasyon altında tutulan bir kütüphaneden alınmıştır. Öyleyse başlayalım. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce, ilk olarak sperm dondurma solüsyonlarını hazırlayın.Ginsburg balık ringer solüsyonu her üç günde bir taze olarak hazırlanır ve dondurma ortamı, metanol içeren ve içermeyen versiyonlarıyla her gün taze olarak hazırlanır. Bu solüsyonların bileşimleri, bu protokolle birlikte sunulan çevrimiçi ek bilgilerde bulunabilir. Bu prosedürde kullanılan malzemeler, dondurma ve çözme hızını etkileyebilir; bu durum ise dondurulmuş spermlerin fertilite oranını etkileyebilir.Bu nedenle, önerilen malzemelerin bir listesi ek çevrimiçi bilgi olarak da sunulmuştur. Spermleri kuru buz peletleri yerine ince şekilde ezilmiş kuru buz üzerinde dondurmak en iyisidir. Kuru buzu ezmenin basit bir yolu, onu bir havluya sarıp çekiçle toz haline getirmektir.Daha verimli bir yöntem, zebra balığı spermini dondurmak için claws ve model RE iki gibi bir kuru buz öğütücü kullanmaktır. İlk olarak, 10 µL'lik kapiler tüpleri laboratuvar kalemiyle 3,33 µL seviyesinden veya tabandan yaklaşık 16,7 mm mesafeden işaretleyin; erkekleri anesteziye almak için iki ila dört erkek balığı, seyreltilmiş trica içeren bir behere yerleştirin. Tarif, zebra balığı kitabında bulunabilir.Anestezi uygulandıktan sonra, balıkları plastik bir kaşıkla anestezik çözeltiden çıkarın ve bir kağıt havlu üzerinde nazikçe kurulayın. Özellikle ventral bölgenin kurulanmasına dikkat edin. Su spermleri aktive ettiğinden, ika çevresinin tamamen kurulanması kritik önem taşır.Balığı, ventral tarafı yukarı gelecek şekilde sünger tutucuya yerleştirin. Pelvik yüzgeçlerin çevresi hala nemliyse, bir Kim wipe ile nazikçe kurulayın. İşaretlenmiş kılcal tüpü, kılcal tüplerle birlikte verilen kauçuk ağız pipeti adaptörüne yerleştirin.Adaptör, bir ucunda ağızlık, diğer ucunda ise kapiler tutucu bulunan kauçuk bir hortumdur. Alternatif olarak, kapiler tüp 50 µL'lik bir Hamilton şırıngasına bağlanabilir. Uygun çapta kısa bir tigon tüp parçası kullanarak, erkeği mikroskobun altına yerleştirin ve pelvik yüzgeçleri dikkatlice birbirinden ayırarak ürogenital açıklığı açığa çıkarın.Kılcal borunun ucunu kullanarak, balığın yanlarına düz cımbızla nazikçe sürterek veya işaret parmağı ve başparmağıyla yanlarından hafifçe sıkarak spermi dışarı çıkarın; dışarı atılan spermi, hafif bir vakum uygulayarak kılcal boru içine toplayın. Spermle birlikte atılabilecek dışkılardan kaçının. Hedef sperm hacmi 3.3 microliters'dır.Kabul edilebilir minimum sperm miktarı, spermin kalitesine bağlı olarak değişir. Kaliteli sperm beyaz ve opaktır, düşük kaliteli sperm ise sulu görünür. Genel olarak, kabul edilebilir minimum sperm miktarı; kaliteli sperm için bir mikrolitre veya hedefin üçte biri, düşük kaliteli sperm için ise iki mikrolitre veya hedefin üçte ikisidir.Sperm hacmi 3,3 microliter hedef hacme ulaşmazsa, hacmin metanolsüz dondurma ortamı kullanılarak kalem çizgisine normalize edilmesi gerekir. Eğer sperm hacmi kapiler tüpteki kalem çizgisine zaten ulaşmışsa veya bu çizgiyi aşmışsa, bir sonraki adıma geçin. Şimdi spermin üzerine kriyoprotektan ekleyin.Metanol içeren dondurma ortamını turuncu işarete kadar çekin. Yaklaşık toplam hacim şu an 20 µL'dir. Sperm ve kriyoprotektan karışımını bir saat camının temiz bir alanına boşaltın; pipetle yaklaşık dört kez aşağı yukarı çekerek nazikçe karıştırın ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.Spermleri, her bir etiketli viyalin tabanına 10 µL sperm kriyoprotektan çözeltisi pipetleyerek iki kriyoviyale paylaştırın. Hızlı hareket ederek viyalleri kapatın ve her bir kriyoviyali ayrı bir 15 mL falcon tüpüne bırakın. Oda sıcaklığında falcon tüplerini kapatın ve ince toz haline getirilmiş kuru buzun içine yerleştirin.Falcon tüplerini takip edebilmek için tüpler, sadece kapakları görünecek şekilde yeterince derine yerleştirilmelidir. Tüpleri numaralandırın ve her bir tüpün kuru buza girdiği saati kaydedin. Spermlerin kuru buzda 20 dakika boyunca donmasını sağlayın.Sperm dondurulduktan sonra, iki kriyoviyali sıvı nitrojen içeren bir Dewar balonuna aktarın. Geçici saklama için dondurucu kutusunu, örneklerin ısınmaması için sıvı nitrojen banyosuna yerleştirin.Viyalleri doer balondan çıkarmak için uzun metal maşalar kullanın ve onları kriyojenik eldivenlerle tutun. Alternatif olarak, kriyo viyaller doğrudan kuru buzdan dondurucuya aktarılabilir. Eğer dondurucu kutusu uzun süreli saklama için bir strafor kap içerisinde sıvı azotun içinde tutuluyorsa, kriyo viyalleri kriyojenik sıvı azot dondurucuya yerleştirin.Sperm canlılığını korumak için, tüplerin sıvı azot içerisinde daldırılmış halde saklanması kritik öneme sahiptir; buhar fazında saklanan tüpler zamanla canlılığını yitirebilir. Sperm canlılığının korunmasında hız da kritik bir faktördür. Kriyoprotektanın eklenmesi ile sperm tüplerinin kuru buza yerleştirilmesi arasındaki süre 30 saniyeden fazla olmamalıdır In vitro fertilizasyon.Kriyoprezervasyonla saklanmış sperm kullanımı, iki kişiyle en iyi şekilde yürütülür. Bir kişi dişilerden yumurtaları sağarken, diğer kişi spermleri çözer. Bir su banyosunu 33 °C'ye ayarlayın.Sıvı azot dondurucudan bir kriyoviyol çıkarın ve çözülmeye hazır olana kadar sıvı azot içeren bir kaba veya erlene aktarın. Anestezi uygulanmış dişilerden yumurtaları 35 milimetrelik plastik bir Petri kabına sıkın. Bu işlem, zebrafish'lerin ayrıntılı bir açıklamasını sunan "Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure" başlıklı JoVE protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.In vitro fertilizasyonda, iyi bir yumurta grubu, tek tip ve sarımsı renkte olan 150'den fazla yumurta içerir. Herhangi bir beyaz kalıntı, dejenerasyonun göstergesidir. Mümkünse, üç yumurta grubu elde etmeye çalışın ve bunları tek bir kaba birleştirin.İlk clutch'tan sonra bir dakika içinde üç adet iyi clutch elde edilemezse, bir sonraki adıma geçin. Sperm çözülürken kabı kapalı tutun. Bu sırada, viyali sıvı azot içerisinden çıkarın ve kapağını açın.Viyali, 33 °C'lik bir su banyosuna hızlıca yarıya kadar daldırıp sekiz ila 10 saniye bekletin. Viyala hızlıca oda sıcaklığında 70 µL Hank'in tamponlu tuz çözeltisi ekleyin ve pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın; ardından hemen Petri kabındaki yumurtalara ekleyin ve pipet ucuyla nazikçe karıştırın. Sonrasında, 750 µL balık suyu ekleyerek sperm ve yumurtaları hemen aktive edin, karıştırmak için çalkalayın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Beş dakika sonra, kabı balık ve su ile doldurun ve 28 °C'de inkübe edin. İki ila üç saat sonra, canlı embriyoları sayın ve her kapta 50 embriyo olacak şekilde 100 mm'lik kaplara aktarın. Ayrıca, sperm örneğinin fertilite oranının belirlenebilmesi için döllenmiş yumurtaları da sayın.Sperm fertilite oranı, in vitro fertilizasyon için kullanılan toplam yumurta sayısının canlı embriyolara oranıdır. Yumurtalar, in vitro fertilizasyondan iki ila altı saat sonra herhangi bir zamanda ayrıştırılabilir. İnfertil yumurtalar canlı embriyolardan kolayca ayırt edilebildiğinde, infertil yumurtalar şeffaf ve bölünmemiş haldedir.Stereo mikroskopta trans-aydınlatma ile incelendiğinde, kriyokonserve edilmiş spermlerin ortalama fertilitesi geniş bir değişkenlik gösterir. Bununla birlikte, birden fazla yıl boyunca stabil kalan ortalama %25 fertilite elde etmek mümkün olmalıdır. Bu grafik, 2001 ile 2003 yılları arasında dondurulmuş ve 2008 yılına kadar saklanmış spermlerin ortalama yüzde fertilitesini göstermektedir.Balık sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonu için yüksek kapasiteli bir yöntemi uygulamalı olarak gösterdik. Bu protokolü gerçekleştirirken, önerilen tüm plastik malzemelerin ve ekipmanların kullanılmasının yanı sıra, kuru buz peletleri yerine toz haline getirilmiş kırılmış kuru buz kullanılması önemlidir. Gerçekten yüksek kaliteli sperm ve yumurtaların kullanılması kritik öneme sahiptir; in vitro fertilizasyon sırasında, spermler çözüldükten sonra, sürecin sonunda elde edilen fertil embriyo sayısını artırmak için mümkün olduğunca çok sayıda yumurta kullanmak önemlidir, ki bu da üç ila dört dişi balık gerektirebilir, değil mi?Protokolün bir diğer kilit bileşeni ise hızdır. Spermin erkekten alınmasıyla kuru buza yerleştirilmesi arasındaki süre hiçbir zaman bir dakikayı geçmemelidir. Sanırım bu kadar.Deneylerinizde başarılar dileriz.

a-high-throughput-method-for-zebrafish-sperm-cryopreservation-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Zebra balığı, daha yüksek omurgalılarla genetik benzerlikleri nedeniyle gelişimsel biyoloji ve insan hastalıkları araştırmaları için güçlü bir model sistemdir. Bu protokol, erken embriyogenez için gerekli olan genlerdeki resesif mutasyonları tanımlamak için ileri tarama stratejileri için kullanılabilecek haploid zebra balığı embriyoları oluşturmak için bir metodolojiyi açıklar.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

ploid manipülasyon için değiştirilmiş bir protokol, erken embriyoda sitokinez bir tek çevrim durak uyarılması için bir ısı şoku kullanır. Bu protokol zebrabalıkları gösterilmiştir, ancak diğer türlere uygulanabilir.

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Ayrıca, beş farklı Zebra balığı suşları yönteminde tekrarlanabilirlik test edildi.

Zebra balığı Spermatogonia bütün testis iğne tarafından dondurma hızlı soğutma dalmış

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

Bu protokol, erken evre zebrafit embriyoları belirli hücre popülasyonlarında hassas kolokalizasyon analizlerini sağlayarak, krobölümler üzerinde sıralı immünofluoresesans ve immünhistokimyasayı gösterir.

Cryosec, zebrafish embriyo üzerinde sıralı Immünofluorescence ve Immünhistokimya

Burada sunulan zebra balığı ve tüp oluşumu tahlil de hasta kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerinde tam montaj in situ RNA hibridizasyon analizi için bir protokol vasküler oluşumunda endoglin rolünü incelemektir.

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında kardiyak morfolojiyi ve işlevi değerlendirmek için düşük maliyetli bir ışık mikroskobu yöntemini açıklar ve gelişmiş görüntüleme sistemlerine ihtiyaç duymadan gelişimsel kardiyotoksisitenin tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Standart Mikroskopi ve Video Analizi Kullanılarak Fonksiyonel Kardiyak Görüntüleme: Çevresel ve Biyomedikal Araştırmalarda Uygulamalar

Öğrenin zebra balığı sperm kriyoprezervasyonu için yüksek verimli bir yöntemi. Bu protokol %25 ortalama fertilite oranı sağlar ve yedi yıldan fazla saklama süresi sunarak uzun vadeli genetik çalışmalara destek olur.

Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

Daha fazla video keşfet