Erken Basınç Gynogenetic Diployid Zebra balığı

Merhaba, ben Oregon Üniversitesi, Nörobilim Enstitüsü'ndeki Charles Kimmel laboratuvarından Charlene Walker. Ben de Gregory Walsh. Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi Temel Bilimler Bölümü'ndeki Cecilia Moens laboratuvarında çalışıyorum.

Bugün size erken basınç yöntemiyle triploid zebra balığı üretme prosedürünü göstereceğiz. Bu yöntem, UV ışınlamalı sperm ile döllenmiş bir yumurtadaki mikrotübülleri depolimerize etmek için hidrostatik basınç kullanır. Doğru zamanlama ile uygulandığında.

Bu durum, homolog kromozomları mayoz I'in iki ürünü olan diplo bir embriyo oluşturan ikinci polar cisimcinin atılmasını önler. Bu teknik, Oregon Üniversitesi'nde George Reisinger'in laboratuvarında çalıştığım 1970'lerin başında geliştirilmiştir. Laboratuvarımızda bu prosedürü iki nesilli dört genetik tarama çalışmalarında kullanmaktayız.

F1 mutajen balıkların gametleri, homozigot jino, genetik diploid döllerde gelişimsel fenotiplere neden olan resesif mutasyonlar için doğrudan taranabilir. Zebrafish yüksek genetik interferans sergilediği için, bu yöntemi ayrıca mutasyonların kromozomlar üzerindeki yerini belirlemek ve bu mutasyonların sentromerden ne kadar uzakta olduğunu tahmin etmek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım; deneyden önceki günün geç öğleden sonra saatlerinde, sıkılacak erkek ve dişileri ayırarak sperm toplama hazırlıklarını yapın; herhangi bir genetik materyal katkısı sağlamayacakları için yaşlı erkekler kullanılabilir.

Dişiler karın bölgesinden iri ve yağlı görünmeli, erkekler ise sarı renkli ve hareketli görünmelidir. Erkekleri ve dişileri, sabah kolayca erişilebilecekleri ayrı tutma tanklarında gece boyunca bekletin. Deney sabahı, Hank's solüsyonunu hazırlayın ve sodyum bikarbonat ekleyin.

Buz kovasıyla birlikte balık tesisine götürün. Hank's solüsyonu, trica, bir zamanlayıcı ve sperm toplama tüplerini yanınıza alın. Son olarak, balık tesisine vardığınızda trica'yı balık suyunda seyreltin.

Bu, bir sonraki adımda balıkları anestezi altında tutmak için kullanılacaktır. Sperm toplama işlemine başlamak için, buz üzerinde şeffaf bir tüpte Hank's çözeltisi hazırlayın. Her bir erkek için yaklaşık 50 µL hacminde yeterince soğuk Hank's çözeltisi bulundurarak, aynı anda bir veya iki erkek balığa anestezi uygulayın.

Daldırma ve transfer yöntemiyle, plastik bir kaşık kullanılarak anestezik çözeltiden çıkarılabilirler. Erkek balıklar suyla durulanır ve kağıt havlu yardımıyla nemleri alınarak kurulanır. Suyun spermleri aktive etmesi nedeniyle bu işlem oldukça kritiktir.

Balıklar kuruduktan sonra, düşük büyütmeli ve epi aydınlatmalı bir stereo mikroskop altında köpük tutucuya yerleştirin. Pelvik yüzgeçleri pensle ayırın ve sperm toplamaya başlamak için kloakanın açıklığına bir mikro kapiler yerleştirin; süt rengindeki sperm genital gözenekten çıkarken, balığın yanlarını pürüzsüz mil Pour penslerle nazik ama kararlı bir şekilde sıvazlayın. Mikro kapiler kullanılarak hafif vakumla toplanan spermi çekin ve birkaç erkekten alınan spermleri buz üzerinde biriktirin.

Beş ila 10 erkekten alınan soğuk Hanks tuzlu çözeltili sperm, 20 ila 30 dişiden alınan yumurtaları döllemek için yeterlidir. Soğuk Hanks çözeltisinde saklanan sperm, birkaç saat boyunca yumurtaları verimli bir şekilde döllemeye devam edecektir.

Spermleri UV ile inaktive etmek için bulanık bir süspansiyon oluşturmaya yetecek kadar sperm toplayın. Bir cam Petri kabının altını buzla doldurarak başlayın. Kabın içindeki buzun üzerine bir saat camı yerleştirin.

Ardından, spermi test tüpünden saat camına aktarmak için pipeti kullanın. Hava kabarcığı almamaya dikkat ederek, mümkün olduğunca fazla spermi pipete çektiğinizden emin olun. Spermin köpürmesini önlemek kritiktir; spermi saat camı üzerine ince ve eşit bir tabaka halinde boşaltın ve pipeti atın.

Sperm transfer edildikten sonra, Petri kabını bir UV çapraz bağlayıcıya (crosslinker) yerleştirin. Çapraz bağlayıcıyı, 900 JUUL enerji verecek şekilde ayarlayıp çalıştırın. Çapraz bağlama işleminden sonra, temiz bir pipet kullanarak spermi saat camından alın, "UV sperm" olarak işaretlenmiş bir fendor tüpüne aktarın ve buz üzerine yerleştirin.

Yumurta toplamaya başlamak için önce her seferinde iki dişiyi anesteziyle uyuşturun. Trica kullanımında, uzun süreli anestezinin balıkları öldürebilmesi nedeniyle balıkların Trica içinde çok uzun süre tutulmaması kritiktir. Ardından, balıkları balık suyuyla durulayın ve bir kağıt havlu yardımıyla nemli bölgelerini kurulayın.

Bu durum kritiktir çünkü fazla su yumurtaların şişmesine neden olarak döllenmeyi engelleyecektir. Dişiyi, nemli ancak ıslak olmayan parmaklarla 35 milimetrelik plastik bir Petri kabına yerleştirin. Karın bölgesine nazikçe ama sıkıca bastırın.

Eğer dişi balık yumurtlamaya hazırsa, yumurtalar kolayca dışarı çıkacaktır; yumurtaları bir spatula ile toplayın ve dişiyi suya geri bırakın. Sağlıklı yumurtalar sarımsı ve yarı saydam bir renge sahipken, dişide çok uzun süre kalmış yumurtalar beyaz ve suludur. Kaliteli yumurtalar elde etmek için, balık tesisindeki ışıklar açıldıktan sonraki ilk iki saat içinde toplama yapın ve yumurtaların kurumasını önlemek için üzerlerini kapalı tutun.

Yumurtalar toplandıktan sonra, yumurtalara 30 ila 50 µL UV sperm süspansiyonu ekleyin ve bir pipet ucuyla nazikçe karıştırın. Derhal yaklaşık 1 mL balık suyu ekleyin ve zamanlayıcıyı başlatın. Bu aşamada gelişmeye bırakılan yumurtalar haploit olacaktır.

Aşağıdaki adımlar, döllenmeden sonraki 90 saniye içinde tamamlanmalıdır. Yumurtalar su ilavesiyle aktive edildiği anda zamanlayıcıyı başlatın.

Mayoz birin metafazının kesin zamanlaması sıcaklığa bağlıdır. Basınç uygulama ve kaldırma zamanlaması 28.5 °C için optimize edilmiştir. Zamanlayıcıyı başlattıktan sonra birkaç dakika bekleyin, ardından daha fazla su ekleyin ve yumurtaları kabın merkezine doğru yüzdürün.

Kesilmiş ve parlatılmış bir pastör pipeti kullanarak, gerekirse döllenmiş yumurtaları basınç tüplerine aktarın; tüpün ağzında bir su damlacığı kalacak şekilde, yumurtalar neredeyse taşana kadar tüpe daha fazla yumurta suyu ekleyin. Ardından, su damlacığının üzerine bir kauçuk tıpa yerleştirin ve plastik kapağı kauçuğun üzerine sabitleyin.

Tüpleri basınç silindirine baş aşağı yerleştirin ve daha fazla yumurta suyu ekleyin. Silindiri doldurmak için üst kapağı silindire güvenli bir şekilde kapatın. Kapatıldıktan sonra, silindiri pistonu yukarı bakacak şekilde preste konumlandırın ve inç kare başına 8.000 pound basınç uygulayın.

Aktivasyon zamanından altı dakika sonrasına kadar, toplam 4,5 dakikalık basınç süresi boyunca silindiri presin içinde bırakın. Aktivasyondan altı dakika sonra silindiri presten çıkarın. Tüpleri silindirden çıkarın ve embriyoların soğumasını önlemek için dikkatlice kurulayın.

Silindiri sıfırlayın ve tekrar yumurta suyu ile doldurun. İhtiyaç duyulduğunda, bir sonraki tüpleri kısmen yumurta suyu ile doldurarak hazırlayın. Bu adımları tüm yumurta grupları için tekrarlayın.

Silindir aynı anda iki tüpe kadar tutabildiğinden, trica'daki diğer dişilerin yumurta verip vermeyeceğini görmek için yumurtaların döllenmesini bir ila iki dakika geciktirmek isteyebilirsiniz. Bu, aynı anda daha fazla grubun işlenmesini sağlayarak süreci hızlandıracaktır. Ayrıca, pres kullanılırken balıkları sıkarsanız, presin yeniden kullanılabilir hale geleceği zamana kadar yumurtalar canlılığını yitirecek kadar kurumuş olabilir; döllenmeden 24 saat sonra, haploid bir zebrafish embriyosu kısa, tıknaz bir vücuda, kısa bir kuyruğa ve daha az belirgin oluşmuş bir beyne sahip olacaktır.

Yine de hepsinin somite, notokord, gözler ve kulaklar gibi aynı vücut parçaları olacaktır. Diploidler, haploidler ve diploidler, hepsinin yaklaşık 24 saat sonra engellenmemiş bükülme hareketleri sergilediği görülür. Döllenme sonrası, EP diploid kardeşlerin uzun kuyrukları ve düzgün şekillenmiş beyinleri vardır ve canlılık oranları yaklaşık %60 ila %70 olmalıdır.

Bunlar, işlem görmemiş kontrol gruplarına çok benzemektedir. Genellikle bir grup haplo embriyosu; sağlıklı görünümlü embriyolar, ölü embriyolar ve bunların arasındaki tüm durumların bir karışımını içerir. Sağlıklı görünümlü embriyoların kusurlu olanlara oranı, dişi genomunda bulunan zararlı genleri yansıtır.

Bu arka planla bile mutasyonları belirlemek nispeten kolaydır; çünkü aynı karakteristik fenotipe sahip %50'ye kadar birçok birey olacaktır. Bu yöntemle üretilen embriyoların gerçek OID'ler olduğundan emin olmak önemlidir; kontrol olarak, UV inaktivasyonu uygulanmamış bazı spermleri ayırarak normal diploid yumurtalardan oluşan bir grup ve EP işlemine girmeden UV işlem görmüş spermle döllenmiş yumurtalardan oluşan bir grup haplo embriyo üretin; haplolar iki ila üç gün sonra canlılığını yitirir. EP ile üretilenler normal diploidler gibi görünmelidir.

Bazı düzensiz EP canavarları oluşabilse de, EP diploid kuluçkaları büyük ölçüde %70 ile %90 civarında canlı olmalıdır. EP uygulanmış kuluçkada haplo varlığı, EP sürecinde bir hata olduğunu gösterir; örneğin, presin basıncı koruyamaması gibi. Haplo kuluçkada diploidlerin bulunması ise sperm inaktivasyonunun tamamlanmadığını, örneğin çapraz bağlayıcının işlevsiz kaldığını gösterir.

Zebrafish ile in vitro fertilizasyonun ne kadar kolay olduğunu ve ikinci meyotik bölünmeyi inhibe ederek jineko genetik türevli diploid zebrafish embriyolarının nasıl oluşturulacağını size göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, erken basınç zamanlamasının hassas olduğunu ve presin işlem boyunca 8,000 pounds per square inch basıncı koruduğunu hatırlamak önemlidir. Presinizin kalibre edildiğinden emin olun.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.