Dayak Kalp görselleştirme Drosophila

Burada, yetişkin kalbinin diseksiyonu için Drosophila'da atan bir kalbin görselleştirilmesi için iki teknik sunulacaktır. İlk olarak, baş ve göğüs kafesi belirtilen çizgi boyunca tek bir kesi ile çıkarılır. Daha sonra, cinsel organlar çıkarılır ve karın gövdesi boşluğu forseps kullanılarak açılır bağırsakta ve dişi bir sinek durumunda yumurtalıklar çıkarılır.

Karın segmentleri üç ve dördüncüdeki karın yağ gövdesi, larva kalbinin hareketsiz hale getirilmesi için yetişkin kalbini açığa çıkarmak için dikkatlice emilir. Tampon solüsyona yerleştirilen tek bir larva, önce larva başı bölgesi çevresine histo akral yapıştırıcı uygulanarak tespit edilir. Larvalar hafifçe gerilir ve arka uca ve daha sonra larva vücut duvarının yanlarına daha fazla yapıştırıcı uygulanır.

Merhaba, ben GI Fler. Merhaba, ben Karen er. İkimiz de Burnham Tıbbi Araştırma Enstitüsü'ndeki Gelişim ve Yaşlanma programının üyesiyiz.

Bugün size Laval'ın ve yetişkin drosophila'nın atan kalbini görselleştirmek için geliştirdiğimiz prosedürleri göstereceğiz. Bu preparatların her ikisini de meyve sineğindeki kalp atışı parametrelerini görselleştirmek, incelemek ve ölçmek için bir yol olarak kullanıyoruz. Drosophila. Başlamadan önce yapay bir hemolenf solüsyonu hazırlıyoruz.

Bu çözelti, kullanımdan hemen önce soğutulmuş stok çözeltilerinden yapay hemolenfeğe eklenmesi gereken sükroz girişi, helo içerir. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için, yapay hemolenfi oda sıcaklığına getirin ve çözeltiyi en az 15 dakika hava köpürterek oksijenlendirin. Daha sonra, sinek içindeki yağ kütlelerinin çıkarılması için gerekli olacak standart bir pipet çektirmesi kullanarak birkaç ince kılcal damar çekin.

Her şey hazırlandıktan sonra, yetişkin sinekler uyuşturulmalıdır. Bu, iki ila beş dakika boyunca sinek uykusuna kısa bir süre maruz kalarak yapılabilir, ancak sinekleri sinek uykusunda beş dakikadan daha uzun süre bırakmamaya dikkat edin. Kısa süreli soğuğa maruz kalma, sinekleri uyuşturmak için de kullanılabilir, ancak karbondioksit, kalp atış hızı ve kalp atış hızı üzerinde daha uzun süreli etkileri olduğu için önerilmez.

Daha sonra, uyuşturulmuş sinekler sırt tarafı aşağı bakacak şekilde ince bir vazelin tabakası ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirilir. Kanatlardaki ve vücuttaki hidrofobik kütikül, jöleye geri dönüşümlü olarak yapışmalıdır, ancak gerekirse sinek yeniden konumlandırılabilir. İlk kesim, kavisli bir çift yaylı makas kullanılarak yapılır.

Bu, makas bıçaklarının sineğin bacaklarının altına yerleştirilmesiyle ve boynun yakın kısmının sırt yüzeyine doğru açılı olarak yerleştirilmesiyle yapılır. Baş, ventral sinir kordonu ve bacaklar kesildikten sonra tek bir kesi ile çıkarılır. Preparat daha sonra yaylı makas kullanılarak oksijenli yapay hemo lenf çözeltisine daldırılır.

Karın segmenti yedi ve sekizinci segmentten oluşan karın arka ucu tek bir kesi ile çıkarılır. Bu, karnın her iki kenarı boyunca yanal kesimler yapmak için erişim sağlar ve arka bağırsak ile abdominal kütikül arasındaki bağlantıyı kesmeye hizmet eder. Makasın bıçaklarını karın ucundaki küçük açıklığa sokun ve kütikülü yanlamasına kesin.

Bu, ventral kütikülün bir kenarını serbest bırakır. Flebi forseps ile kavrayın ve karnın karşı yan kenarı boyunca benzer bir kesim yapın. Ventral abdominal kütikülün serbest kalan flebi artık çıkarılabilir.

Bağırsak ve diğer karın organları genellikle kuyumcu forsepsleri ve hafif çekme kullanılarak tek bir kitle olarak çıkarılabilir. İç organların çıkarılması, hala küçük aery kasları ile dorsal kütiküle bağlı olan ve yağ cisimleriyle çevrili olan atan kalp tüpünü ortaya çıkarır. Çekilen kılcal damarlar, bir vakum kaynağına bağlı bir adet 16. inç boru olan plastiğe yerleştirilir.

Emiş kuvveti uç çapı ile orantılıdır, bu nedenle çapı 40 mikrondan büyük olan pipetler kurulduktan sonra kullanılmamalıdır. Bu aspirasyon sistemi, kalp tüpünün etrafındaki fazla yağı emmek için kullanılır. Kütikül çevresinde biriken hava kabarcıklarını ve herhangi bir kalıntıyı gidermek için de kullanılabilir.

Kalbin kendisine dokunmamak için son derece dikkatli olunmalı ve kalbin arka kısmı çok kırılgan olduğu için o bölgeden hep birlikte kaçınılmalıdır. Yetişkin drosophila kalp tüpü artık açıkta ve gerekirse atmalıdır. Kütikül ve bağlı kalp, kütikülü vazelinden nazikçe kaldırarak ve tekrar dikkatlice bastırarak yeniden konumlandırılabilir.

Kalp dokusu ile herhangi bir temastan kaçınmak. Bu noktada, preparasyonu yıkayan çözelti taze yapay hemolenf ile değiştirilmelidir. Bu preparatın, herhangi bir manipülasyondan önce oksijenasyon ile 20 ila 30 dakika dengelenmesine izin verilmelidir.

Preparat 60 dakikadan daha uzun süre sürdürülecekse, taze yapay hemolenf ile tekrar perfüze edilmelidir. Bu preparat artık optik kayıt için kullanılmaya hazırdır ve ayrıca elektrofizyolojik kayıt veya histolojik manipülasyonlar için de kullanılabilir. Larva içi atan kalbi görselleştirmek için farklı bir teknik gereklidir.

İlk olarak, işlemden bir gün önce lamel hazırlayın. Bu, yaklaşık 50 ila 70 mikrolitre Sard solüsyonunu 22 x 22 milimetrelik bir kapak kızağına aktarmak için bir kürdan kullanılarak yapılır. Sil koruyucunun gece boyunca 65 santigrat derecede sertleşmesine izin verin.

Daha sonra, hazırlandıktan sonra Brody ve Bates tamponunu yapın, alikotlar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir ve gerektiğinde çözülebilir. Son olarak, histo akral yapıştırıcıyı uygulamak için gerekli aletleri hazırlayın. İlk olarak, birkaç ince kılcal damar çekin.

Ardından, 1,5 mililitrelik bir pipet ucunu yaklaşık 32 inç çapında küçük bir plastik boru ile bağlayın. Küçük ucu tüpe sokarak, diğer ucuna geniş açıklığı olan bir kılcal damar yerleştirin. Kurulduktan sonra, kılcal damarı bir damla yapıştırıcıya batırarak ve plastik uca hafifçe emerek kılcal damarı histo yapıştırıcı ile yükleyin.

Yapıştırıcı ile çalışırken, tutkal kılcalının ucundan fazla yapıştırıcıyı çıkarmak için elinizin altında ikinci bir cam kılcal damar bulunmalıdır. Yapıştırıcı, birkaç saniye içinde sertleşeceği tamponlu tuzlu su ile temas edene kadar sıvıdır. Bununla birlikte, genellikle tutkal kılcal ucundan çıkarılacak kadar uzun süre plastik kalır veya numuneye uygulanırken.

Şimdi larvaların hareketsiz hale getirilmesine başlamak için, syl korumasının her bir köşesine yakın bir damla histo akral yapıştırıcı yerleştirin. Kapak fişleri, tutkal damlalarına 50 mikrolitre B ve B tamponu ekler, bu da sertleşir, yapıştırılmış noktalar arasındaki boşluğu b ve b ile doldurur. Yapıştırıcı, tamponu slayt üzerinde tutacaktır.

Dolaşan bir L üç larva alın ve iki dakika boyunca buz üzerinde bir parça ıslak kağıt mendil üzerine koyun. Bu hareketini yavaşlatacaktır. Daha sonra, larvaları tampona aktarın ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin.

Bu, larvaların aynı kayışlardan yoksun olan tarafıdır. Baş bölgesi ile eşik koruması arasına hızlıca biraz yapıştırıcı sürün. Tutkal çok hızlı bir şekilde sertleşecek ve larvaların başının hareket etmesini önleyecektir.

Forseps kullanarak, hayvanı dikkatlice arka parıltılardan tutun ve yavaşça gerin. Larvaların her iki tarafına arka yarıda yapıştırıcı uygulayarak larvaları bu pozisyonda sabitleyin. Kütikülün vücut duvarı kasları tarafından daha fazla hareketini azaltmak için, hayvanın yanlarına daha fazla yapıştırıcı ekleyin.

Larva şimdi bu pozisyonda sabitlenmiştir. Kapak fişi, yapay hemolenf ile doldurulmuş küçük bir Petri kabına yerleştirilebilir veya PBS kalp atışları artık vücut duvarı hareketlerinden etkilenmeden kaydedilebilir. Yarı sağlam yetişkin drosophila kalbi, taze oksijenli yapay hemolenfte tutulduğunda diseksiyonu takiben saatlerce ritmik olarak atacaktır.

Temsili bir örnek burada gösterilmiştir ve ek filmde, burada gösterilen yıldız larvalarında üçüncüden bir kalp ve elodan bir ila üç hafta sonra genç sinekler genellikle bir ila üç hertz arasındaki oranlarda düzenli bir kalp atışı sergiler, üç haftadan daha eski sinekler genellikle daha aritmiktir. Bununla birlikte, bu kalpler oksijenli yapay hemolenf kalplerde saatlerce kendiliğinden atabilmektedir ve diseksiyon işlemi sonucunda hasar gören yetişkin sinekler tipik olarak gevşeyemeyen ve çoğu zaman kontrolsüz olabilen lokalize aşırı daralma bölgeleri gösterir. Bir Hertz'den daha yavaş kalp atışı hızları, üç haftalıktan küçük sineklerde nadiren görülür.

Sonuç olarak, bu tür preparatların zarar gördüğü kabul edilir ve atılır. Optik görüntüleme için seviye ve yetişkin meyve sineği kalplerinin nasıl hazırlanacağını gösterdik. Unutmayın, yarı sağlam preparat yaparken asla kalbin kendisine dokunmayın.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.