Patojen İlişkili Moleküler Desen (PAMP) Triggered Tesisleri Bağışıklık (PTI) için Testi

Merhaba, ben Voice Thompson Bitki Araştırmaları Enstitüsü'ndeki Greg Martin laboratuvarından Suma TI. Bugün size PAMP tetiklemeli bağışıklık veya PTI için hücre ölümü temelli bir analiz prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, bir genin PTI'daki rolünü incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. İşleme, Nicotiana ANA bitkilerini yaklaşık yedi haftalık olana kadar yetiştirerek başlayın. Başlamadan dört ila beş gün önce.

PAM tetiklemeli bağışıklık veya PTI analizi. Tüm koltuk dallarını ve çiçekleri temizlemek için bitkileri budayın. Bitkilerin daha kolay yönetilebilmesi için koltuk dallarını ortaya çıktıktan kısa süre sonra çıkarmaya çalışın.

Bitkilerin hazırlanmasının ardından bakteri üretimine geçiniz. Bu prosedür, challenge bakterileri ile yapılacak ikinci inokülasyon öncesinde bitki immünitesini indüklemek için patojenik olmayan bakteriler kullanır; analizde kullanılan tüm bakterilerin üretimini başlatınız. Aynı zamanda, her bir pseudomonas bakteri stoku için pseudomonas bakterilerinin dondurulmuş gliserol stoklarını kullanınız.

Uygun antibiyotik içeren bir KBM plağının merkezine az miktarda bakteri yayın ve plağı 30 °C'de yaklaşık 18 ila 24 saat inkübe edin. Agrobacterium için, iki mililitre LB içinde sıvı kültür başlatmak amacıyla önceden hazırlanmış taze bir plak kullanın. Bir sonraki gün, çalkalamalı inkübatörde 30 °C'de gece boyunca büyütün.

Pseudomonas bakterilerinin bulunduğu plakalara 150 ila 200 microliters sıvı KBM ekleyin. Bakterileri plakanın tamamına yayın. Bunun için steril bir yayma çubuğu kullanın.

Plakaları tekrar 20 ila 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin. Agrobacterium için, 20 µM asetona içeren yaklaşık 5 ila 10 mL LB içinde sekonder bir kültür başlatın.

Kültürü 30 °C'de, çalkalamalı olarak gece boyunca büyütün. Bakterileri hazırladıktan sonra, PTI analizini gerçekleştireceğiniz günden bir gün önce analiz için bitkileri hazırlayın. Bakterileri hazırlamanın ardından bitkileri, yaklaşık %35 ila %40 bağıl nemin olduğu 22 ila 24 °C sıcaklıktaki sabit ışıklı bir odaya alın.

Ardından, yapraklar üzerinde daireler işaretlemek için kalın siyah bir marka kalem kullanın. İyice genişlemiş yaprakları seçin ve daha yaşlı yapraklardan veya dokunulduğunda sert veya kalın olan yapraklardan kaçının. Yaprağın alt kısımlarını işaretlemekten kaçının.

Dairelerin çapı en az 1.5 santimetredir ve yaprak başına iki ila dört daire işaretlenebilir. Daireler arasında yeterli mesafe olmalı ve tercihen büyük bir damarı kesmemelidir. PTI analizine, PTI indüksiyonunda kullanılan bakterilerin hasat edilmesiyle başlayın.

Kullanılan pseudomonas türleri, iyi büyümeye işaret eden bir bakteri çimlenmesi oluşturmuş olmalıdır. Bunlar, steril uzun bir tahta çubukla sıyrılarak plakadan toplanmalı ve agrobacterium santrifüjü için yaklaşık 20 ila 25 mililitre 10 millimolar magnezyum klorür çözeltisi içinde yeniden süspanse edilmelidir.

Hücreleri toplamak için kültürü santrifüjleyin ve yaklaşık 20 ila 25 mililitre 10 milimolar magnezyum klorür artı 10 milimolar MES pH 5.6 içerisinde yeniden süspanse edin; santrifüj işlemini tekrarlayın ve hücreleri tekrar yaklaşık 20 ila 25 mililitre magnezyum klorür artı MES çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Artık indükleyici pseudomonas ve agrobacterium bakterileri yeniden süspanse edilmiştir.

Her üç kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometre dalga boyunda ölçün. Pseudomonas için magnezyum klorür ile, Agrobacterium için ise MES artı magnezyum klorür ile hücreleri seyrelterek OD değerini ayarlayın. Gereken nihai OD değerleri ekteki yazılı protokolde yer almaktadır.

Yaklaşık 40 ila 50 noktayı inoküle etmek için toplam 25 mililitre bakteriyel kültür yeterlidir. Şimdi, iğnesiz bir mililitrelik şırınga kullanarak PTI indükleyicilerini yapraklardaki önceden işaretlenmiş dairelere infiltre ederek analizi başlatın. Bitkilerin infiltre edilme sırasını ve indüksiyonu takiben infiltrasyonun başladığı kesin zamanı not edin.

İndüksiyon inokülasyonundan birkaç saat sonra challenge inokülasyonuna geçin. Challenge inokülasyonu için gerekli bakteri suşlarını, indükleyici pseudomonas suşları için daha önce gösterildiği şekilde hasat edin. Tekrar OD ölçümü yapın ve kültürlerin konsantrasyonunu beraberindeki GR protokolüne göre ayarlayın.

Meydan okuma inokülasyonuna, indükleyici infiltrasyonundan yedi saat sonra başlayın. Aşağıdaki indükleyici-meydan okuyucu kombinasyonlarını kullanın. İlk inokülasyon dairesinin çevresinden bir noktayı, ikinci inokülasyon dairesinin merkezi olarak belirleyin.

Challenge infiltrasyonunu, indüksiyon ile aynı bitki sırasına göre gerçekleştirin. Bir yaprak üzerinde birden fazla nokta varsa, infiltrasyonların üst üste binmediğinden emin olun. Son olarak, analizde kullanılan tüm kültürlerin seri dilüsyonlarını, uygun antibiyotikleri içeren KBM veya LB plaklarına ekin.

Challenge inokülasyonundan iki gün sonra PTI yanıtı değerlendirilmeye başlanabilir; indüksiyon ve challenge inokülasyonlarından iki gün sonra, PST DC 3000 ile challenge edilen bölgelerde efektör tetiklemeli immünite (ETI) kaynaklı hücre ölümünün oluşup oluşmadığına bakılır. İnfiltrasyonun örtüşen alanındaki hücre ölümü, PTI'nın bozulduğunu gösterir ve pozitif fenotip olarak puanlanmalıdır. İndüksiyon ve challenge inokülasyonlarından dört ila beş gün sonra, DC 3000 hop Q1 mutantı veya PS back high ile challenge edilen bölgelerde hastalığa bağlı hücre ölümünün oluşup oluşmadığına bakılır. İnfiltrasyonun örtüşen alanındaki hastalığa bağlı hücre ölümü ile belirtilen PTI bozulması yeniden aranır. PTI'sı bozulmamış olan bitkiler infiltrasyonun örtüşen alanında hücre ölümü göstermeye başlayana kadar bitkileri gözlemlemeye devam edin.

FLS iki geni susturulmuş bitkiler, PFDC kombinasyonu ile inokülasyondan iki gün sonra PTI açısından risk altındadır. Hücre ölümü, PTI kontrol bitkilerinin kontrol mekanizmasının bozulduğunu gösteren örtüşme alanında görülmektedir. Herhangi bir gen susturulmamış olan kontrol bitkileri de PFDC kombinasyonu ile inoküle edilmiş ve analizden iki gün sonra incelenmiştir; normal bir PTI yanıtı nedeniyle, challenge kaynaklı hücre ölümü örtüşme alanının dışında görülmüş ancak içinde görülmemiştir.

Bu prosedürü uygularken, PAMP tetiklemeli bağışıklık (PTI) için hücre ölümü tabanlı bir analizin nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Bitkileri önerdiğimiz çevresel koşullarda tutmayı unutmamak önemlidir. Daha yüksek nem seviyeleri bitkileri olumsuz etkileyecek ve analizin daha hızlı ilerlemesine neden olacaktır.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.