Name: Patojen İlişkili Moleküler Desen (PAMP) Triggered Tesisleri Bağışıklık (PTI) için Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Öğrenin Nicotiana benthamiana bitkilerinde PTI yanıtını değerlendirmek için hücre ölümü tabanlı bir yöntem. Bu protokol, bitki bağışıklığı genlerinin işlevini incelemek için araştırmacılara rehberlik eder ve hastalığa dayanıklı bitki çeşitleri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hye-Sook Oh, Joanne Morello ve Alan Collmer, Bitki Patolojisi ve Bitki-Mikrop Biyoloji Bölümü, Cornell Üniversitesi, değerli tartışmalar için teşekkür ederiz. Biz Jesse Munkvold yazı hakkında yorum için teşekkür ederim. Finansman Ulusal Bilim Vakfı Bitki Genomu Programı tarafından sağlanan, ödül sayısı DBI-0605059 (GBM).

Bölüm 1: Bitki büyüme ve bakım Tayininde kullanılan Nicotiana benthamiana tesislerinde yaklaşık 7 haftalık olmalıdır. Onlar tüm aksiller dallar ve çiçekler kaldırmak için tahlil için en az 4-5 gün önce kesilmiş olmalıdır. Ortaya çıkar sonra bitkilerin daha kolay yönetilebilir hale getirmek için yakında aksiller dalları çıkarmak için iyi bir fikirdir. Bölüm 2: Bakteriyel kültür 1. GÜN: <ol><li> Plakalar ya da kültürler tayininde kullanılan tüm suşlar için aynı anda başlatılır. Pseudomonas spp. 2 indükleyicileri KBM plakalar üzerine dondurulmuş gliserol stokları (Tablo 2) uygun antibiyotik içeren ve 3 zorluk suşları, çizgi bakteri içerir. Küçük bir miktarda bakteri plakasının ortasına yayılmış olmalıdır. Plaka yaklaşık 18-24 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. 30 Agrobacterium için yeni bir plaka, 2 ml LB sıvı kültürü başlatmak ve 250 rpm&#39;de gecede büyümek ° C </li></ol> 2. GÜN: <ol start="2"><li> Pseudomonas için, bakteriler sıvı KBM 150-200 ul ekleyin ve steril bir cam dağıtıcısı kullanılarak tüm plaka üzerinde bunları yaymak. Geri inkübatör plaka koyun ve bir 20-24 saat büyümesine izin. Iyi bir büyüme gösteren, bakteriyel bir plaka ertesi gün çim olmalıdır. Agrobacterium için, 20 mcM acetosyringone ile yaklaşık 5-10 ml LB ikincil kültür başlatmak ve 20 saat gece için 250 rpm, 30 büyümesine izin ° C. </li></ol> Bölüm 3: Test için hazırlık bitkiler 2. GÜN: <ol><li> Tahlil bir gün önce bitkiler 22-24 bir odaya taşınmış ° C olmalıdır, ~% 35-40 RH ve sabit ışık. </li><li> Kalın siyah bir kalem kullanarak en az 1.5 cm çapında yaprakları çevreler işaretleyin. Yaprağı başına iki ila dört çevrelerin işaretlenebilir. Çevrelerinde de aralıklı olarak ve tercihen büyük bir ven çapraz olmamalıdır. Iyi genişletilmiş yaprakları seçin. Büyük yaprakları veya dokunmatik sert veya kalın ve yaprağın alt kısımları çevrelerin işaretleme önlemek yaprakları kaçının. </li></ol> İşaretleme çevrelerin bir gün önce deneme için protokol için gerekli değildir. Ancak, test olan bitkilerin çok sayıda varsa kaydeder ve daha kolay PTI indüksiyonu ve meydan aşılar arasındaki hassas zamanlama elde etmek için yapar. Bölüm 4: PTI indüksiyonu 3. GÜN: <ol><li> P. fluorescens ve P. 10 mM MgCl 2 plaka hücreleri Hasat putida. Agrobacterium için, kültür hücreleri toplamak için santrifüj ve 10mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5.6 tekrar süspansiyon haline getirin. MgCl 2-MES çözümü santrifüj ve tekrar süspansiyon tekrarlayın. 600 nM hücreleri optik yoğunluk (OD) ölçün. ODS nihai gerekli değerleri Tablo 2&#39;de açıklandığı gibi. Pseudomonas sonunda 10 mM MgCl 2 ve Agrobacterium yeniden süspanse edilmelidir MgCl 2-MES çözümü ayarlayın. 25 ml toplam hacmi yaklaşık 40-50 noktalar aşılamak için yeterli. </li><li> PTI indükleyicileri 1 ml iğnesiz şırınga kullanılarak yaprakları üzerinde önceden işaretlenmiş çevrelerin içine sızmak. Bitkiler infiltre edildiği düzeni ve infiltrasyon başladı tam zamanı yazınız. </li></ol> Bölüm 5: Mücadelesi aşılama <ol><li> P. hazırlayın syringae pv. domates DC3000, 4.1 ve Tablo 2&#39;de açıklandığı gibi meydan Pst DC3000 Δ hopQ1-1 ve Ps pv. tabaci. </li><li> Indüksiyon yapıldı indükleyicisi infiltrasyon Yedi saat sonra meydan infiltrasyon, bitkilerin aynı sırayla gerçekleştirin. Genellikle, ilk aşılama dairenin çevre üzerinde bir nokta, ikinci aşılama dairenin merkezi olarak kullanılabilir. Bir yaprak üzerinde birden fazla lekeler varsa o sızıntıların çakışmadığından emin olun. </li><li> Tam CFU sayısını belirlemek için uygun antibiyotik içeren KBM veya LB plakalar üzerinde tayininde kullanılan tüm kültürlerin Plaka seri dilüsyonları. </li></ol> Bölüm 6: PTI parçalanması için Puanlama 5. Gün: <ol><li> Pst DC3000 ile itiraz edilen noktalar hücre ölümü nedeniyle ETİ görünüm için bakın. Infiltrasyon örtüşen alanı içinde hücre ölümü PTI bir dökümünü gösterir ve olumlu bir fenotip olarak atılır. </li></ol> 7. Gün: <ol start="2"><li> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 veya Ps pv ile itiraz edilen noktalar hücre ölümü nedeniyle hastalığa görünüm için bakın. Tabaci </em&gt;. Puan bölüm 6.1 &#39;de açıklandığı gibi, aynı şekilde olumlu bir fenotip. </li></ol> Kontrol bitkiler (PTI için tehlikeye olmamalı) infiltrasyon örtüşen alanda hücre ölümüne göstermeye başladığınızda, başka gözlemler yapmayı durdurmak. Bölüm 7: Temsilci sonuçları Şekil 1 P. bir test sonucunu gösterir fluorescens meydan okuma olarak indükleyicisi ve Pst DC3000 olarak kullanılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" /> Şekil 1 P. fluorescens N. üzerine sızmış benthamiana yaprakları (siyah daire) PTI ikna etmek için ve 7 saat sonra, spot Pst DC3000 (beyaz daire) ile meydan. FLS2 için susturuldu Tesisleri P. bölgede PTI bir dökümünü gösterdi fluorescens hücre ölümü görüldüğü gibi, (A) infiltre edildi. Kontrol bitkiler susturulması değil, PTI (B) indüksiyon nedeniyle örtüşen alanda hiçbir hücre ölümü gösterdi. Kırmızı oklar eksikliği veya infiltrasyon örtüşen alanda hücre ölümüne varlığı göstermektedir. Fotoğraflar, infiltrasyonların 2 gün sonra alındı. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> PTI indükleyicisi </td><td> Hücre ölüm eliciting meydan okuma </td><td> Doğa hücre ölümü </td><td> Kod </td></tr><tr><td> Pseudomonas fluorescens 55 </td><td> Pseudomonas syringae pv domates (Pst.) DC3000 6 </td><td> ETİ </td><td> / Pf DC </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> Pst DC3000 </td><td> ETİ </td><td> Pp / DC </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 </td><td> Hastalık </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV2260 </td><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> Hastalık </td><td> Agro / Ptab </td></tr></tbody></table> Tablo 1: PTI uyaran ve hücre kombinasyonları ölüm eliciting PTI için hücre ölümü tayininde kullanılır mikropların. <table border="1"><tbody><tr><td> Bakteri suşu </td><td> Seçim orta </td><td> Final OD deneyde kullanılan </td><td> Sorumlu CFU / ml </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> KBM ampisilin (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 1 x 10 9 </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> KBM ampisilin (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> A. tumefaciens GV2260 </td><td> LB Rifampisin (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 5 x 10 8 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 </td><td> KBM Rifampisin (100 ug / ml) </td><td> 0,02 </td><td> 2 x 10 7 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 </td><td> KBM Rifampisin (100 ug / ml) </td><td> 0.1 100 kat seyreltme </td><td> 1 x 10 6 </td></tr><tr><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> KBM Rifampisin (100 ug / ml) </td><td> 0.1 100 kat seyreltme </td><td> 1 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Kültür ve inokulum seviyeleri tayininde kullanılır. OD ve ilgili CFU seviyeleri spektrofotometreler farklı marka arasında değişebilir.

<ol><li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li>
<li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li>
<li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li>
<li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li>
<li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li>
</ol>

Hücre ölümü tabanlı test PTI bir gen katılımı belirlemek için kullanılır. Örneğin, bir gen ilgi kaybı fonksiyon-mutantlar Bu testte kullanılarak test edilebilir. Indükleyicisi ve Tablo 1&#39;de verilen mücadele aşılar 4 kombinasyonları Out, sadece tek bir kombinasyonu bitki arka planda bir fenotip neden olabilir mümkündür. Biz FLS2 susturulması için bitkiler Pf / DC ve indükleyicisi ve meydan aşılar (Tablo 1) Pf/Q1-1 kombinasyonları PTI bir dökümünü gösterir olduğunu gözlemledik. Bu testi için çevre koşulları, Bölüm 3.1 &#39;de açıklanan olanlar mümkün olduğu kadar yakın olduğunu esastır. Düşük nem puan tahlil zorlaştırır, çok hızlı devam etmek için hücre ölümüne neden olur. Protokolde belirtilen şartlar laboratuarında işe yaramazsa, daha sonra indükleyicisi veya meydan aşılama düzeyini değiştirerek deneyin. Değiştirilmiş olabilir başka bir parametre daha kısa zaman aralıkları tahlil kontrolü bitkiler çok hızlı bir şekilde yıkmak için neden olduğu bulundu olmasına rağmen, gidiş ve meydan arasındaki zaman aralığı. Biz en az 4-5 bitkiler bir deneyde test edilmesi ve olumlu bir fenotip en az 3-4 bağımsız deneyler tekrar edilmesi önerilir.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>1M stok olarak hazırlayın, pH değerini ayarlayın ve filtre sterilizasyonu yapın. Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Life Science UV/Vis Spektrofotometresi</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

patojen İlişkili moleküler desen (pamp) triggered tesisleri bağışıklık (pti) için testi

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

Çevreleri potansiyel patojen algıladıkları için, bitkiler, örüntü tanıma reseptörleri (PRRs) plazma membranlar mevcut kullanın. PRRs patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) olarak adlandırılan korunmuş mikrobiyal özelliklerini tanımak ve bu algılama, etkili olmayan patojenlerin 1,2 bitki dokularında kolonizasyonu engeller PAMP tetiklenen bağışıklık (PTI), yol açar. PTI içinde en çok çalışılan sistem FLS2-bağımlı yolak 3. FLS2 bakteriyel flagellin bir bileşeni olan PAMP flg22 tanır. Başarılı patojenlerin virülans faktörleri veya PTI bastırmak ve patojen hastalık 1 neden izin etkileyiciler sahiptir. Sırayla Bazı bitkiler effektör veya efektör tetiklenen bağışıklık (ETİ) 2 yol açar faaliyet tespit direnç genlerine sahip. Oh ve Collmer 4 değiştirilmiş PTI için bir hücre ölümü tabanlı test açıklar. Testin N. standardize benthamiana giderek bitki-patojen etkileşimi 5 çalışma için bir model sistemi olarak kullanılmaktadır. PTI, bir yaprak patojen olmayan bakteri suşunun infiltrasyonu indüklenir. Yedi saat sonra, bir bakteri suşunun da hastalığa neden ya da ETİ orijinal infiltrasyon bölge örtüşen bir alana sızmış harekete geçirir. Ilk infiltrasyonu ile indüklenen PTI görünümünü ikinci bir meydan okuma infiltrasyon nedeniyle hücre ölümü geciktirmek veya önlemek mümkün. Tersine, inokülasyon örtüşen alanda hücre ölümüne görünümünü PTI bir dökümünü gösterir. PTI ve meydan aşılar indükleyicileri dört farklı kombinasyon standardize edilmiştir (Tablo 1). Tahlil sessiz N. üzerinde test edildi benthamiana bitkiler kontrolü ve PTI geliştirmek için yeteneklerini tehlikeye gireceği tahmin edilmiştir FLS2 için susturuldu bitkiler olarak görev yaptı.

PTI Nicotiana benthamiana bitkiler için bir hücre ölümü tabanlı test açıklanmıştır.

Patojen İlişkili Moleküler Desen (PAMP) Triggered Tesisleri Bağışıklık (PTI) için Testi

Bitkiler, çevrelerindeki potansiyel patojenleri algılamak için plazma membranlarında bulunan örüntü tanıma reseptörlerini (PRR'ler) kullanırlar. PRR'ler ...

Merhaba, ben Voice Thompson Bitki Araştırmaları Enstitüsü'ndeki Greg Martin laboratuvarından Suma TI. Bugün size PAMP tetiklemeli bağışıklık veya PTI için hücre ölümü tabanlı bir analiz prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, bir genin PTI'daki rolünü araştırmak için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. İşleme, Nicotiana ANA bitkilerini yaklaşık yedi haftalık olana kadar yetiştirerek başlayın. Başlangıçtan dört ila beş gün önce.PAM tetikli bağışıklık veya PTI deneyi. Bitkileri, tüm koltuk dallarını ve çiçekleri temizleyecek şekilde budayın. Bitkilerin daha kolay yönetilebilir olması için koltuk dallarını ortaya çıktıktan kısa bir süre sonra çıkarmaya çalışın.Bitkiler hazırlandıktan sonra bakteri üretim aşamasına geçiniz. Bu prosedür, challenge bakterileri ile yapılacak ikinci bir inokülasyondan önce bitki immünitesini indüklemek için patojen olmayan bakteriler kullanır; analizde kullanılan tüm bakterilerin üretimini başlatınız. Aynı zamanda, her bir pseudomonas bakteri stoğu için pseudomonas bakterilerinin dondurulmuş gliserol stoklarını kullanınız.Uygun antibiyotiği içeren bir KBM plağının merkezine az miktarda bakteri yayın ve plağı yaklaşık 18 ila 24 saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Agrobacterium için, iki mL lb içinde sıvı kültür başlatmak amacıyla önceden hazırlanmış taze bir plak kullanın. Ertesi gün, çalkalamalı inkübatörde 30 °C'de gece boyunca büyütün.Pseudomonas bakterilerinin bulunduğu plakalara 150 ila 200 µL sıvı KBM ekleyin. Bakterileri plakanın tamamına yayın. Bunun için steril bir yayma çubuğu kullanın.Plakaları tekrar inkübatöre yerleştirin ve 20 ila 24 saat daha bekletin. Dört agrobacterium. 20 micromolar asetona sahip yaklaşık beş ila 10 mililitre LB içerisinde sekonder bir kültür başlatın.Kültürü 30 °C'de, çalkalamalı olarak gece boyunca büyütün. Bakterileri hazırladıktan sonra, PTI analizini gerçekleştirmeden bir gün önce analize yönelik bitki hazırlıklarına geçin. Bakterilerin hazırlanmasının ardından bitkileri, yaklaşık %35 ila %40 bağıl neme sahip, sabit ışıklı ve 22 ila 24 °C sıcaklıktaki bir odaya taşıyın.Ardından, yapraklar üzerine daireler çizmek için kalın siyah bir markör kullanın. İyice genişlemiş yaprakları seçin; yaşlı yapraklardan veya dokunulduğunda sert veya kalın olan yapraklardan kaçının. Yaprağın alt kısımlarını işaretlemekten kaçının.Dairelerin çapı en az 1.5 santimetredir ve yaprak başına iki ila dört daire işaretlenebilir. Daireler arasında yeterli mesafe olmalı ve tercihen büyük bir damarı kesmemelidir. PTI analizine, PTI indüksiyonunda kullanılan bakterileri hasat ederek başlayın.Kullanılan pseudomonas türleri, iyi büyümeye işaret eden bir bakteriyel çim tabakası oluşturmuş olmalıdır. Bunları, steril uzun bir tahta çubukla sıyırarak plakadan toplayın ve agrobacterium santrifüjü için yaklaşık 20 ila 25 mililitre 10 millimolar Magnezyum klorür çözeltisi içinde yeniden süspande edin.Hücreleri toplamak için kültürü santrifüjleyin ve yaklaşık 20 ila 25 mililitre 10 milimolar magnezyum klorür ile 10 milimolar MES pH 5.6 içerisinde yeniden süspande edin; santrifüj işlemini tekrarlayın ve hücreleri tekrar yaklaşık 20 ila 25 mililitre magnezyum klorür artı MES çözeltisi içerisinde yeniden süspande edin. Artık indükleyici pseudomonas ve agrobacterium bakterileri yeniden süspande edilmiştir.Her üç kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometre dalga boyunda ölçün. Pseudomonas için magnezyum klorür ile, Agrobacterium için ise MES artı magnezyum klorür ile hücreleri seyrelterek OD değerini ayarlayın. Gerekli nihai OD değerleri beraberindeki yazılı protokolde yer almaktadır.Toplam 25 mililitre bakteriyel kültür, yaklaşık 40 ila 50 noktanın inoküle edilmesi için yeterlidir. Şimdi, iğnesiz bir mililitrelik şırınga kullanarak PTI indükleyicilerini yapraklardaki önceden işaretlenmiş dairelere infiltre ederek deneye başlayın. Bitkilerin infiltre edilme sırasını ve indüksiyonu takiben infiltrasyonun başladığı tam saati not edin.İndüksiyon inokülasyonundan birkaç saat sonra challenge inokülasyonuna geçiniz. Challenge inokülasyonu için gerekli bakteri suşlarını, indükleyici pseudomonas suşları için daha önce gösterildiği şekilde hasat ediniz. Kültürlerin OD değerini tekrar ölçünüz ve konsantrasyonlarını ekteki GR protokolüne göre ayarlayınız.Challenge inokülasyonuna, indükleyici infiltrasyondan yedi saat sonra başlayın. Aşağıdaki indükleyici-challenge kombinasyonlarını kullanın. İlk inokülasyon çemberinin çevresinden bir noktayı, ikinci inokülasyon çemberinin merkezi olarak seçin.Challenge infiltrasyonunu, indüksiyonla aynı bitki sırasına göre gerçekleştirin. Bir yaprak üzerinde birden fazla nokta varsa, infiltrasyonların üst üste binmediğinden emin olun. Son olarak, assay'de kullanılan tüm kültürlerin seri dilüsyonlarını, uygun antibiyotikleri içeren KBM veya LB plaklarına ekin.Challenge inokülasyonundan iki gün sonra, indüksiyon ve challenge inokülasyonlarından iki gün sonra PTI yanıtı değerlendirilmeye başlanabilir; PST DC 3000 ile challenge edilen bölgelerde, efektör tetiklemeli bağışıklık veya ETI kaynaklı hücre ölümünün ortaya çıkışı gözlemlenir. İnfiltrasyonun örtüşen alanındaki hücre ölümü, PTI'nın bozulduğunu gösterir ve pozitif fenotip olarak puanlanmalıdır. İndüksiyon ve challenge inokülasyonlarından dört ila beş gün sonra, DC 3000 hop Q1 mutantı veya PS back high ile challenge edilen bölgelerde hastalığa bağlı hücre ölümünün ortaya çıkışı gözlemlenir. İnfiltrasyonun örtüşen alanında hastalığa bağlı hücre ölümü ile belirtilen PTI bozulması aranır. Bitkiler, PTI'sı bozulmamış olanlar da infiltrasyonun örtüşen alanında hücre ölümü göstermeye başlayana kadar gözlemlenmeye devam edilir.FLS iki geni susturulmuş bitkiler, PFDC kombinasyonu ile inokülasyondan iki gün sonra PTI açısından yetersiz kalır. Hücre ölümü, örtüşen alanda görülmekte olup bu durum, herhangi bir geni susturulmamış PTI kontrol bitkilerinin kontrolünün bozulduğunu göstermektedir. Bu bitkiler de PFDC kombinasyonu ile inoküle edilmiş ve analizden iki gün sonra incelenmiştir; normal bir PTI yanıtı nedeniyle, zorlama kaynaklı hücre ölümü örtüşen alanın dışında görülmekte ancak içinde görülmemektedir.Bu prosedürü uygularken, bitki tetiklemeli bağışıklık (PTI) için hücre ölümü tabanlı bir analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bitkileri önerdiğimiz çevresel koşullarda tutmayı hatırlamanız önemlidir. Daha yüksek nem seviyeleri bitkileri olumsuz etkileyecek ve analizin daha hızlı ilerlemesine neden olacaktır.Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

assay-for-pathogen-associated-molecular-pattern-pamp-triggered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz canlı bakteri stoma yanıt erişmek için basit ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirmiştir. Bu yöntem daha önce bildirdiği epidermal peeling kullanımı ile karşılaştırıldığında yaprak yaralama ve manipülasyona en aza indirir.

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Patojen büyümesinin niceliksel olarak belirlenmesi, çeşitli Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis olarak anılacaktır) bağışıklık tepkilerini karakterize etmek için güçlü bir araçtır. Burada açıklanan yöntem, Pseudomonas syringae pv'yi ölçmek için optimize edilmiş bir şırınga infiltrasyon testi sunar. maculicola ES4326 yetişkin Arabidopsis yapraklarında büyüme.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Bu yazıda bağışıklık elicitors maruz aşağıdaki Arabidopsis thaliana savunma tepkiler miktarının için iki yöntem açıklanmaktadır: geçici oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

Fide sel testi Pseudomonas syringae bakteridirenç için yabani domates katılımları hızlı tarama kolaylaştırır. Bu tetki, fide bakteri büyüme testi ile birlikte kullanılan, daha fazla bakteriye altta yatan direnç karakterize yardımcı olabilir, ve direnç genetik temelini belirlemek için popülasyonları tarama için kullanılabilir.

Pseudomonas syringae pv Direnci yüksek-Throughput Tanımlama. Fide Sel Asası Kullanarak Domates

Bu protokol, bitki köklerini toprak kaynaklı mikroplarla aşılamak için stratejilerin ayrıntılı bir özetini sunar. Verticillium longisporum ve Verticillium dahliae mantarları için örneklendirilen üç farklı kök enfeksiyon sistemi tanımlanmıştır. Potansiyel uygulamalar ve olası aşağı akış analizleri vurgulanır ve her sistem için avantajlar veya dezavantajlar tartışılır.

Bitki Köklerini Toprak Kaynaklı Mikroorganizmalarla Enfekte Etmek için Aşılama Stratejileri

Burada, Arabidopsis thaliana'da bakteri istilasına karşı stoma yanıtlarının doğrudan gözlemlenmesi ve otomatik ölçümü için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntüleri için tasarlanmış bir görüntü analizi boru hattı ile birlikte taşınabilir bir stoma görüntüleme cihazından yararlanır.

Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Bu protokol, aynı örnekte bitki iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi ve kallos üretimini değerlendirmek için yüksek verimli bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal İkincil Metabolitlere Yaprak Yanıtlarının Yüksek Verimlilikli Bir Formatla Değerlendirilmesi

Öğrenin Nicotiana benthamiana bitkilerinde PTI yanıtını değerlendirmek için hücre ölümü tabanlı bir yöntem. Bu protokol, bitki bağışıklığı genlerinin işlevini incelemek için araştırmacılara rehberlik eder ve hastalığa dayanıklı bitki çeşitleri geliştirmeye yardımcı olur.

Patojen İlişkili Moleküler Desen (PAMP) Triggered Tesisleri Bağışıklık (PTI) için Testi

Daha fazla video keşfet