Name: Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Keşfedin, Saccharomyces cerevisiae'de kantitatif fosforilasyon analizi için kriyoliz, üre çözünürlüğü, HILIC fraksiyonasyonu ve IMAC zenginleştirme yöntemlerini kullanarak hücre sinyalleşme mekanizmalarını kitlesel spektrometri ile inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz kütle spektrometresi analizleri ve yararlı tartışmalar ile teknik yardım için teşekkür Dr Zengin Rogers, ve Dr. Rob Moritz, Jeff Ranish ve yararlı tartışmalar için Hamid Mirzai. Bu çalışma, NIH Mükemmeliyet Merkezleri tarafından finanse edildi.

Hücre büyümesi ve medya <ol><li> 1.0 minimal bir maya orta iki (Amonyum Sülfat veya amino asitler olmaksızın% 0.17 Maya Azot Bankası,% 0.5 &#39;lik Amonyum sülfat) 1 litre kültürü içine sonra tohum OD 600 100 mL zengin medya geceleme BY4742Δarg4Δlys1 hücreleri tek bir koloni içeren bir (Isotec 13 C 6 15 N 4) ve lisin (13 C 6 15 N 2; Isotec) 20 mg / L isotopically normal veya ağır arginin ile desteklenmiş amino asitler, tam. </li><li> Hücreler 1,8 OD 600, 18 saat boyunca yetiştirilmiştir. Etiketli izotopların tam birleşme hücreleri elde etmek için en az 9 nesiller geçmesi kritik öneme sahiptir. Işık örnek, orta (isotopically Normal arginin ve lizin,% 0.2 oleat (Sigma Kimyasallar) ve% 0.5 Tween 40 (Sigma Kimyasallar)) içeren bir oleat içine reseeded ve başka bir 85 dakika için uyarılan, steril su ile yıkanır, pelet. Bu arginin ve lizin açısından bir isotopically ışık verimleri, örnek ve isotopically ağır bir glikoz yetişen referans örnek oleat uyarılır. </li></ol> Hücre Lizis, İzolasyon ve Peptitler, Fraksiyonu <ol start="3"><li> Santrifüj şişesi tartılır. 3 dakika boyunca santrifüj Hasat örnekleri. Medya çıkarın ve aşırı sıvı aspire. Pelet ve şişe (genellikle 1-2 gram arasında verim) sıvı nitrojen sonra flaş dondurma tartılır. &#39;Taşlama&#39; tampon pelet ağırlığı, sıvı azot (Fosfat% 10 gliserol, Proteaz İnhibitörleri (SigmaFAST Proteaz İnhibitör Tablet, Sigma, (PBS, Gibco) Tuzlu Tamponlanmış) dondurulmuş pelet hacmi eşdeğer ekleyin ve Fosfataz inhibitörleri (Thermo Scientific HALT )). </li><li> Taşlama damar sıvı nitrojen içinde dondurun. Sıvı azot kaynama geçene kadar bekleyin. Dondurulmuş bilyeli rulmanlar, taşlama gemi pelet aktarın. </li><li> 600 rpm&#39;de 3 dakika için bir yön ters ile 1 dk 20 sn döngüsü ile Grind. Sıvı nitrojen içinde taşlama gemi dondurursam. Toplam öğütme süresi 15 dakika 4 kez daha tekrarlayın. </li><li> 50ml Falcon tüp yeri kuru buz içine donmuş grindate toplayın. Kullanmak üzere saklayın -80 ° C ye kadar hazır. </li><li> 8M üre, 0.1M amonyum bikarbonat, 0.1M Tris pH: 8.6 10ml çözüm olun. Üre tampon 3 cilt donmuş grindate 1 hacim (örneğin üre tampon 3mls için 1 ml PBS ile 1 gram pelet) ekleyin. Hemen bir prob ucu sonikatör (10 saniye bakliyat 2) ile karışım sonikasyon. Ucu çözüm köpük önlemek için tüpün alt kısmına yakın tutun. Grindate hemen çözüm gitmek gerekir. </li><li> 4 5 dakika santrifüj lizat temizleyin ° C </li><li> Supernatant taze tüplerine transfer. </li><li> 0,5 M Tris yeni bir kısım olun [2-carboxyethyl] fosfin (TCEP). 5mM bir final konsantrasyon için 1:100 örnek ekleyin. 37 ° C&#39;de 1 saat </li><li> Azaltılmış cysteines Alkilasyon. Oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. 1M iodoacetamide taze bir kısım olun. (Tüp folyo ile sarın) karanlıkta tutun. 20mm bir final konsantrasyon ekle. Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında 1M stok 20mm DTT iodoacetamide Quench </li><li> Protein standart Bradford veya BCA assay (tarif) ile sayısal olarak. Aşağıdaki SDS PAGE ile analiz için bir örnek ele alalım. </li><li> Ağır izotoplar dahil doğrulamak için, azaltılmış ve alkillenmiş lizat 100 ul kullanın. DH 2 O ile 01:04 sulandırınız sonikasyon ve tripsin için 50:1 protein tripsin eklemek. C18 Ultramicrospin sütunlar (The Nest Grubu) ile elektrikli süpürge ve sonra desalt hız aşağı en az 4 saat, kuru örnek Digest. <ol><li> 100 ul Asetonitril Hidrat sütun </li><li> 200 ul% 0.1 TFA ile dengelenmesi. </li><li> 200 ul% 0.1 TFA kuru örnek tekrar Sütun üzerine yükleyin. ~ 200 xg veya sütun akışı için gerekli minimum hız santrifüjleyin. </li><li> 200 ul% 0.1 TFA ile iki kez yıkayın. </li><li> 50 ul Asetonitril% 60,% 0.1 TFA ile iki kez ile Zehir. </li><li> Vac hız Kuru örnek. </li><li> 20 ul% 0.1 formik asit süspanse edin örnek. Bir kütle spektrometresi 2 ul çalıştırın. Isotopically ağır arginin ve ilgili m / z spektrumları 10 ve 8 Dalton vardiya tarafından lizin dahil kontrol edin. % 98 - 96 arasında her amino asit için birleşme olmalıdır. </li></ol></li><li> Isotopically ağır ve hafif örneklerin eşdeğer miktarda (protein mg) karıştırın. </li><li> % 20 metanol ile örnek 01:04 sulandırınız. </li><li> 1:200 az tripsin ekleyin. 37 o gece inkübe ° C </li><li> SDS SAYFA sindirim tamamlanması için gitti. 2 ve 4 predigestion örnek ul ve 8 çalıştırınd 16 ul sonrası tripsin sindirmek. Coomassie boyama sindirim eksiksiz olduğunu gözünüzde canlandırın. Tam değilse, bir prob ucu sonikatör kısaca örnek sonikasyon ve tripsin ile sindiremez. </li><li> Vac hız örnek kurulayın. Kuru pelet çözüm girer kadar süzülmüş dH 2 O ve vorteks 200 ul eklediğinizde. Vac bir hızda aşağı Kuru örnek. DH 2 O ile yeniden süspanse edin Örnek yeniden kurulayın. </li><li> % 0.1 Trifluoracetic Asit yeniden süspanse pelet (TFA, Sigma). PH pH şeritleri kullanarak 3 civarında olduğunu kontrol edin. % 10 TFA ile asitlenir Gerekirse. </li><li> Pelet dışında herhangi bir çökelti. </li><li> Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18 kolon örnekleri Desalt. Bu sütunlar aşırı yüklenmeyin. Maksimum miktarı 5 mg ama biraz daha az yük bulunuyor. Örnek gerekirse birden çok sütun arasında Böl. <ol><li> 5 ml% 100 asetonitril Hidrat sütun. ~ 200 xg veya sütun akışı için gerekli minimum hız santrifüjleyin. </li><li> 5ml% 0.1 TFA ile sütun dengelenmesi. Örnek Yük. Akışını toplamak ve yeniden yükleyin. </li><li> 5 ml% 0.1 TFA ile yıkayınız. Tekrarlayın. </li><li> Zehir 2ml 60% Asetonitril,% 0.1 TFA. </li><li> Vac bir hızda aşağı Kuru örnek. </li></ol></li></ol> Phosphopeptides Peptid Fraksiyonu ve İzolasyon <ol><li> Peptitler HILIC bir sütun üzerinde fraksiyone. Biz Tosoh TSK-Gel Amid-80 4.6 mm x 25 cm bir bekçi sütun ile analitik kolon. Kullanın Bu adım için zaman ayırın, sonra çalıştırmak iki boş gradyanlar numunenin yüklemeden önce% 90 az 2 saat sütun çalıştırmak. XX etrafında bu boyutu olduğu düşünülen bir sütun üzerinde maksimum yük, genellikle başına en fazla 5 mg vadede yük yoktur. </li><li> Solvent A -% 98 ACN/0.1% TFA Solvent B -% 2 ACN/0.1% TFA % 90 yük üzerinde 20 &#39;,% 90,% 85 üzerinden 5,% 85% 60 A üzerinden 40,% 60% 0 5 üzerinden&#39;% 0,% 90 A üzerinde 5 &#39;. </li><li> Akış hızı 1ml/min ve fraksiyonları% 85% 60 A degrade başlayarak 2 dakika aralıklarla toplanmıştır. </li><li> 10 kesirler sayısını azaltmak için kesirler birleştirin. Artan kesirler muhtemelen phosphoproteome daha fazla kapsama alanı verecektir. </li></ol> Phosphopeptides, zenginleştirilmesi <ol><li> Phosphopeptides PHOS seçin Demir Affinity Jel ile zenginleştirilmiştir. Biz kısım tekrarlanır dondurulmasından kaçınmak için elimizden IMAC reçine. 50 ml 250 mM asetik asit,% 30 ACN yük çözümü olun. HCl ile pH 2.7 &#39;ye getirin. 500 ul yük çözüm pelet tekrar HCl veya NaOH ile ayarlamak gerekli olduğu, pH kontrol edin. </li><li> Ön yıkama 200 uygun bir sütun IMAC boncuk ul. Biz Molbiotec dönüş sütunları kullanın. Her fraksiyonu% 50 bulamaç (jel çözüm yüklemek için) 15 ul ekleyin ve sonunda dönme üzerinde son 30 örnekleri &#39;kuluçkaya yatmaktadır. Analizi için akış tutun. </li><li> Yük çözüm örnekleri 3 kere yıkayın ve 500 kez ile ul süzülmüş dH 2 O </li><li> 2 Zehir peptidler - 400 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8.4) tampon ul ile 3 dk. Bir cam flakon aktarın. </li><li> Ile pH 3 ila 5 ul% 100 Formik asit, sıvı azot flaş dondurma ve hız vac kurutulmuş numune aşağı asitlenir. </li><li> % 0.1 TFA ve yukarıda açıklandığı gibi temiz C18 200 ul süspanse edin phosphopeptides. Vac hız yıkandı, örnekleri kurulayın. </li><li> % 0.1 formik asit 20 ul peptitler tekrar 2 kütle spektrometresi analizleri başına ul ya da gerektiği gibi kullanın. </li></ol> Notlar Bu protokol için &#39;kör&#39; bir çalışma olacak. Hücre parçalama batı blot ve Bradford ve BCA deneyleri ve tripsin sindirim da kolaylıkla tespit edilebilir, izlenebilir. HILIC sütun bu benzer bir iz verdi, ya da diğerleri [1, 2] bağlı olarak kullanılan likit kromatografi makine tarafından görülebilir. Örnekler kütle spektrometresi tarafından izlenmekte; ucuz makineleri gibi yüksek bir kitle doğruluğu, yüksek çözünürlüklü makine yüksek maliyet analizleri gitmeden önce LCQs veya MALDIs gibi örnekleri test edin. Bir asit ile bir örnek kurutma Son olarak, cam kullanın.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

Bu yöntem, kantitatif analiz edilebilir phosphopeptides bir zenginlik verecektir. Parametrelerin sayısı bu protokolde değişiklik, ama hatırlanması gereken en önemli yönü, fosforilasyon korumak için olabilir. Eğer böyle ICAT gibi in vivo, etiketleri hücrelerin etiket değil. Eğer örneğin ölçümü için hücrelerin hazırlanması çok sayıda farklı şekillerde elde olması. [3 veya ITRAC [4] farklı ölçümü için iki kültürler etiketlemek için yazılan çıkarma kullanılır olması. etmelidir. Fraksiyo...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Arginine-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Lysine-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; Fosfat tamponlu salin (PBS) 7.4 (10X) sıvı</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFAST Proteaz İnhibitör Tabletleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Halt Fosfataz İnhibitör Kokteyli</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Retsch PM100 Bilyalı Değirmen Öğütücü</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Retsch 125 ml Paslanmaz Çelik Öğütme Kabı</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrospin C18 kolonu</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm analitik kolon</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>Bu, HILIC kromatografik kolonudur.</td></tr><tr><td>Koruyucu kolon 4,6 mm ID x1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>HILIC kolonunuzun ömrünü uzatmak için bu koruyucu kolonu öneriyoruz.</td></tr><tr><td>PHOS-Select&amp;#8482; Demir Afinite Jeli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>Bu, IMAC reçinesidir. Alikotlayın ve saklayın.</td></tr></tbody></table>

yağ asidi kantitatif phosphoproteomics uyarılmış saccharomyces cerevisiae</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Bu protokol isotopically ağır ve hafif S. cerevisiae hücrelerinin yağ asidi oleat, büyüme ve stimülasyon açıklar. Hücreler bir bilyalı değirmen değirmeni ve üre çözünürleştirme çözüm getirilen grindate cryolysis prosedür kullanılarak öğütülür. Bu prosedür, fosforilasyon korunması ve hücre parçalama sırasında phosphoproteome reorientation önlenmesi, metabolik olarak inaktif bir devlet hücreleri lizis sağlar. Azaltma, alkilleme tripsin, proteinlerin sindirimi takiben, örnekleri C18 sütun ve fraksiyonasyon hidrofilik etkileşim kromatografi (HILIC) kullanılarak azaltılabilir örnek karmaşıklığı desalted. HILIC sütun tercihen phosphoproteomics için de uygundur hidrofilik molekülleri korur. Fosforile peptidler kromatografik profili olmayan fosforile muadillerine göre daha sonra Zehir eğilimindedir. Fraksiyonasyon sonra, phosphopeptides phosphopeptide zenginleştirme için ücret tabanlı yakınlık dayanmaktadır immobilize metal kromatografi kullanılarak zenginleştirilmiştir. Bu prosedürün sonunda örneklerin kantitatif kütle spektrometresi ile analiz edilmesi için hazırız.

Cryolysis, üre solubilziation, HILIC fraksiyonasyon ve fosforile peptidlerin IMAC zenginleştirme kullanarak kantitatif fosforilasyon prosedürü açıklaması.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Bu protokol, izotopik olarak ağır ve hafif S. cerevisiae hücrelerinin büyümesini ve oleat yağ asidi ile stimülasyonunu tanımlamaktadır. Hücreler öğütülür...

Fosforilasyon, protein lokalizasyonundan DNA transkripsiyonuna kadar birçok süreci yöneten temel bir hücresel sinyal iletim mekanizmasıdır ve yalnızca fosfo gruplarının kütle spektrometrisi ile incelenmesi, hem sinyal iletimi hem de proteomik çalışmalarında heyecan verici yeni bir gelişmedir. Farklı şekilde işaretlenmiş hücreler, bilyalı değirmen ile lizise uğratılır, ardından redükse edilir, alkilleştirilir, karıştırılır ve sindirilir. Sindirilen peptitler, hidrofilik etkileşim kromatografisi ile fraksiyona ayrılır ve fosfopeptitler, iMac zenginleştirmesi ile fraksiyonlardan zenginleştirilir.Fosfopeptid açısından zenginleştirilmiş fraksiyonlar daha sonra kütle spektrometrisi ile tanımlanır. Merhaba, ben Persistence Biology Enstitüsü'ndeki E grubundan Ramsey Celine. Bugün size metabolik olarak işaretlenmiş fosfopeptidlerin ekstraksiyonuna yönelik bir prosedür göstereceğiz.Laboratuvarımızda fossa proteomunu kantitatif olarak incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedür, izotopik olarak hafif ve ağır maya hücrelerinin büyütülmesiyle başlar.Öncelikle, 100 mililitre zengin besiyerini tek bir maya hücresi kolonisi ile inoküle edin. Bu kültürü, OD 600 değeri 1,0 olana kadar gece boyunca büyütün. Ardından, bu kültürü tam amino asit setini içeren ve litre başına 20 miligram izotopik olarak desteklenmiş iki adet bir litrelik minimal besiyeri kültürünü başlatmak için kullanın.Normal veya izotopik olarak ağır arginin ve lizin içeren her iki bir litrelik kültür, OD 600 değeri 1,8 olana kadar 18 saat boyunca büyütülür. İşaretli izotopların tam olarak dahil edilmesi için hücrelerin en az dokuz nesil geçirmesi kritik öneme sahiptir. Hücreler işaretli izotopları tamamen dahil ettiğinde, izotopik olarak normal arginin ve lizin içeren besiyerinde büyütülen hücreleri santrifüjleyin.Hücre peleti elde etmek için, peleti steril su ile yıkayın, izotopik olarak normal arjinin ve lizin içeren oleatlı bir besiyerine aktarın ve 85 dakika boyunca stimüle edin. Bu işlem, izotopik olarak hafif, oleat ile stimüle edilmiş bir örnek sağlar. İzotopik olarak ağır arjinin ve lizin içeren besiyerinde büyütülen diğer kültür ise oleat ile stimüle edilmez ve izotopik olarak ağır, glukozla büyütülmüş bir referans örnek olarak hizmet eder.Bir litre toplamak için, kültür dört adet 250 mililitrelik santrifüj şişesine paylaştırılır. Santrifüjleme sonrası hücreler; medyadan sadece 100 mililitre bırakarak, hücreleri yeniden süspandirip bir sonraki tüpe aktarma işlemiyle tek bir tüpte toplanır. Son aşamada, tek bir tüpte toplanan tek bir büyük pelet, 4.000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüj edilir.Besiyeri uzaklaştırıldıktan sonra, santrifüj şişesi ve pelet ağırlığı, boş bir santrifüj şişesiyle karşılaştırılır. Santrifüj işleminden sonra besiyerini uzaklaştırın ve şişelerdeki fazla sıvıyı aspire edin; peletleri tartın; tipik verim bir ila iki gram arasındadır. Ardından, peletleri sıvı azotta hızlıca dondurun ve peletlere proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren öğütme tamponu ekleyin.Eklenen öğütme tamponu hacmi, pelet ağırlığına eşit olmalıdır. Öğütme kabını sıvı azotta dondurun. Sıvı azot kaynamayı bıraktığında.Pelleti parçalamak için bir spatül kullanın ve donmuş bilyelerin bulunduğu öğütme kabına aktarın. Pelletleri 600 RPM hızda, bir dakikalık 22. döngü ile üç dakika boyunca yön ters çevirerek öğütün. Öğütme kabını sıvı azot içinde tekrar dondurun.Öğütme işlemini, toplamda 15 dakika olacak şekilde dört kez daha tekrarlayın. Her iki örnek için de öğütme işlemi tamamlandığında öğütme süresini kaydedin. Dondurulmuş öğütülmüş materyali 50 mililitrelik falcon tüplerine toplayın ve sıvı azot veya kuru buz içinde dondurulmuş olarak saklayın.Öğütülmüş tarihi, kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Peptitlerin izolasyonu ve fraksiyonlanması, alkilleme işlemleriyle başlar. İlk adım, örneğinizi üre çözeltisinde çözmekle başlar.Bir birim dondurulmuş öğütme örneğine üç birim üre tamponu ekleyerek her bir öğütme tarihli örneği çözeltiye alın. Örneğin, bir gram pelletle bir mililitre PBS tamponuna üç mililitre RIA tamponu eklenir.Karışımı hemen prob ile sonike edin. Uçla sonikasyon yapın. Çözeltinin köpürmesini önlemek için ucu tüpün tabanına yakın tutun.Öğütme sonrası materyal derhal çözeltiye girmelidir. Lizatları, 6.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj ederek temizleyin. Süpernatanı, dört santigrat derecede yeni tüplere aktarın.İndirgenme reaksiyonunu başlatmak için, her örneğe 1/100 dilüsyon oranında, taze hazırlanmış 0.5 molar tris, iki karboksil LITAL PHOSPHINE veya TCEP ekleyin. Beş milimolar nihai TCEP konsantrasyonu elde etmek için örnekleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. 37 °C'lik inkübasyonun ardından, örneklerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.Ardından, taze hazırlanmış 1 M iodoacetamide ekleyerek nihai konsantrasyonu 20 mM'ye getirin ve oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat inkübe edin. Bir saatlik inkübasyonun ardından, iodoacetamide'i 20 mM DTT ile söndürün. Oda sıcaklığında bir saat bekletin.İndirgenmiş ve alkillenmiş lizatlar artık tripsin sindirimi için hazırdır. Bu aşamada, lizat örnekleri; hücre lizini doğrulamak için protein miktar tayini SDS-PAGE analizi ve ağır izotopların eklemini doğrulamak için kütle spektrometrisi analizi amacıyla kullanılabilir. Tripsin sindirimine başlamak için, izotopik olarak ağır ve hafif örneklerin eşdeğer miktarlarını karıştırın.Numuneyi %20 metanol ile dörtte bire oranında seyreltin ve 200'de bir oranında tripsin ekleyin. Numuneyi 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile tam sindirimin gerçekleştiğini doğruladıktan sonra, numuneyi speed-vac cihazında kurutun; numune kuruduğunda işlemi tamamlayın.200 µL filtrelenmiş distile su ekleyin ve pelet çözünene kadar vorteksleyin. Numuneyi speed vac cihazında kurutun ve tekrar distile su ile resüspande edin. Numuneyi kuruttuktan sonra, peleti bir kez daha %0,1 Trifloroasetik asit veya TFA ile resüspande edin; gerekirse pH şeritlerini kullanarak pH'ın üç civarında olduğunu kontrol edin. %10 TFA ile asitlendirin ve herhangi bir çökeleği peletleyerek uzaklaştırın.Trypsine sindirilmiş numune, şimdi bir Waters set pack VAC 500 miligram C 18 kolonu kullanılarak tuzdan arındırılacaktır. Başlamak için, kolonu beş mililitre %100 asetonitril ile yaklaşık 200 ×g veya kolon boyunca akış için gereken minimum hızda santrifüj ederek hidrate edin. Ardından, kolonu beş mililitre %0,1 TFA ile dengeleyin ve numuneyi yükleyin.Kolonu aşırı yüklememeye dikkat edin ve gerekirse örneği birden fazla kolona bölün. Akışı bir atık kabına toplayın ve gerekirse kolonu tekrar yükleyip beş mililitre %0,1 TFA ile yıkayın. Bu yıkama işlemini tekrarlayın ve iki mililitre %60 Asetonitril %0,1 TFA ile elüe edin; EEU santrifüjleme yoluyla toplanmalıdır.Numuneyi bir speed vac cihazında kurutun ve kurutulmuş numuneyi 200 µL çözücü B içinde yeniden süspande edin. Yeniden süspande edilen numune artık peptit fraksiyonlamaya hazırdır. Peptitleri, koruyucu kolona sahip bir TSK gel AMIDE 80 analitik kolonunda fraksiyonlayın. Bu adımda acele etmeyin.Kolonu iki saat boyunca %90 çözücü A ile çalıştırın ve ardından örneğinizi yüklemeden önce iki boş gradyan çalıştırın. Bu boyuttaki bir kolonla, modern veya modern olmayan sıvı kromatografisi cihazlarında, genellikle çalışma başına beş miligramdan fazla yükleme yapmayız. Cihazlar; otomatik örnek enjeksiyonuna, fraksiyon toplamaya, akış hızı kontrolüne ve gradyan karışımlarına olanak tanır.Bunlar, açıklandığı şekilde çalışmanın başında ayarlanır. 20 dakika boyunca %90A, beş dakika boyunca %90A'dan %85A'ya, 40 dakika boyunca %85A'dan %60A'ya, beş dakika boyunca %60A'dan %0a'ya ve beş dakika boyunca %0A'dan %90a'ya yükleme yapın. Akış hızını dakikada bir mililitre olarak ayarlayın ve iki dakikalık aralıklarla fraksiyonları toplayın.%85A'dan %60A'ya kadar olan gradyanla başlayarak, fraksiyon sayısını 10'a indirmek için fraksiyonları birleştirin; fraksiyon sayısının artırılması muhtemelen fosfoproteomun daha geniş bir kapsamda elde edilmesini sağlayacaktır. Fosfopeptitler, immobilize metal afinite kromatografisi ile zenginleştirilir. IMAC reçinesi olarak phos select demir afinite jelini kullanıyoruz.İlk olarak, pelletleri 500 µL yükleme solüsyonunda süspande edin. Ardından, her fraksiyona 15 µL %50'lik bulamaç ekleyin ve örnekleri 30 dakika boyunca uç uca rotasyonla inkübe edin. Analiz için akışı sürdürün.Numuneyi üç kez yükleme çözeltisiyle ve yıkama işlemlerinden sonra bir kez 500 µL filtrelenmiş distile su ile yıkayın, ardından peptitleri 400 µL 50 mM sodyum fosfat tamponu ile iki ila üç dakika boyunca elüe edin. Elüe edilen peptitleri bir cam şişeye aktarın. pH üç'e asitlendirmek için peptitlere beş µL %100 formik asit ekleyin, fosfopeptitleri 200 µL %0,1 TFA içinde yeniden süspande edin ve daha önce açıklandığı gibi bir C 18 kolonu ile tekrar tuzdan arındırın, elüye edilen numuneleri bir speed vac cihazında kurutun.Son olarak, fosfo peptidleri 20 µL %0,1 formik asit içinde yeniden süspande edin. Örnekler artık kütle spektrometrisi ile kantitatif olarak analiz edilmeye hazırdır. Toplam hücresel peptidlerin H-I-L-I-C kromatografisi kullanılarak fraksiyone edilmesine ait kromatografik iz burada gösterilmektedir.Bu izleme kaydında, fosfopeptitlerin elüsyon profilinin tamamında bulunduğu, ancak fosforile kalıntıların büyük bir kısmının elüsyon profilinin sonuna yakın bir noktaya kadar tutulduğu gözlemlenebilir. Hücrelerin nasıl öğütüleceğini, proteinlerin nasıl sindirileceğini, peptitlerin nasıl fraksiyonlara ayrılacağını ve immobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak fosfopeptitlerin nasıl zenginleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, fosforilasyonun korunması gerektiğini hatırlamak ve tampon çözeltilerin pH değerlerini kontrol etmek önemlidir.Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

quantitative-phosphoproteomics-fatty-acid-stimulated-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Biz maya kullanarak anket-tarama elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI / MS) gibi çok sayıda lipid türlerinin belirlenmesi için yeni bir nicel lipidomics yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, şu anda, lipidler, hassasiyet ve hız çeşitli moleküler formları çözmek için yeteneği lipid tanımlanması ve ölçülmesi için kullanılabilir yöntemleri aşıyor.

Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Tahmin edilen birçok (fosfo)lipaz, substrat özgüllükleri ve fizyolojik fonksiyonları açısından zayıf bir şekilde karakterize edilir. Burada enzim aktivitelerini optimize etmek, doğal substratları aramak ve bu enzimler için fizyolojik işlevler önermek için bir protokol sunuyoruz.

Lipaz ve Fosfolipaz Adayları için substrat özellikleri tanımlama

Bu iletişim kuralı ayıklamak ve prostat kanseri hücre hatlarından veya doku phosphoproteome ile kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizi için phosphopeptides zenginleştirmek için bir yordam açıklanır.

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Burada sunulan fosfoproteomik bir yaklaşımdır, yani arabidopsis fosfoproteomun yüksek verimli ve derin kapsamasını sağlayan dur ve git ekstraksiyon ucu bazlı fosfoproteomik. Bu yaklaşım Arabidopsis'te ozmotik stres sinyaline genel bakışı tanımlamaktedir.

Arabidopsis'te Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Burada, nötr lipitlerin ayrılması için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilen 14C-asetik asit ile mayanın metabolik etiketlemesi için bir protokol sunulmaktadır.

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Burada, enzimatik modifikasyon deneyleri için maya yüzeyinde görüntülenen substratların kullanılması için bir protokol sunuyoruz. Platform, temsili bir enzimatik modifikasyon deneyi olarak tirozin fosfataz SHP-2'nin substratlarından birine karşı defosforilasyon aktivitesinin analizi kullanılarak gösterildi.

Maya Yüzeyinde Görüntülenen Proteinlerin Enzimatik Modifikasyonu ve Akış Sitometrisi Değerlendirmesi

Keşfedin, Saccharomyces cerevisiae'de kantitatif fosforilasyon analizi için kriyoliz, üre çözünürlüğü, HILIC fraksiyonasyonu ve IMAC zenginleştirme yöntemlerini kullanarak hücre sinyalleşme mekanizmalarını kitlesel spektrometri ile inceleyin.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae

Daha fazla video keşfet