Kompleman tükenmesi Özel Hücre Populasyonlarının tükenmesi

Kompleman tüketimi, immün hücre popülasyonlarını saflaştırmak için hızlı, etkili ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Kompleman tüketimi, spesifik bir hücre tipini hedefleyen monoklonal IGM veya IgG antikorlarının bir hücre popülasyonuna eklenmesiyle başlar. Bu örnekte, tüketim için T-hücrelerini hedefleyeceğiz.

Ardından, proteolitik bir kaskadı başlatarak T-hücresi ölümüne yol açan kompleman sistemi eklenir. Hücre popülasyonu daha sonra ölü hücreleri ve kalıntıları temizlemek için santrifüjle yıkanır ve filtrelenir. Bu komplemanla tüketme yöntemi tipik olarak hedeflenen hücre popülasyonunun %95 ile 100'ünün elimine edilmesiyle sonuçlanır.

Merhaba, ben Bonnie Dittle. Milwaukee'de bulunan Wisconsin Kan Merkezi'nin Kan Araştırma Enstitüsü'nde araştırmacıyım. Bugün size, spesifik hücre popülasyonlarının uzaklaştırılması için hızlı ve ekonomik bir yöntem olan kompleman boşaltma tekniğini göstereceğim.

Laboratuvarımızda bu tekniği, hücre aktivasyonu ve protein ekspresyon analizi dahil olmak üzere birçok biyolojik analizde kullanmak üzere immün hücre popülasyonlarını yüksek derecede zenginleştirmek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Deneye başlamadan önce, tavşan komplemaninden 0,5 veya bir mililitrelik alikotlar hazırlayın ve bunları -20 veya -80 derecelik dondurucuda saklayın.

Komplemanın 1/10 ile 1/20 arasındaki optimal bir dilüsyona titre edildiğinden emin olun. Bu prosedür için rutin olarak kullandığımız mükemmel bir ticari kompleman kaynağı Pereze Biologicals'dir; fare ve tavşan monoklonal antikorları genellikle kompleman aktivasyonunda etkilidir, ancak tüm antikorlar uygun olmayacaktır. Kompleman kaynaklı hücre lizizi için genellikle IgM antikorları en yüksek verimliliğe sahiptir.

IgG antikorları ikinci en etkili olanlardır ve çoğu monoklonal antikor IgG olduğu için tipik olarak bunlar kullanılır; her antikor, ampirik olarak belirlenen mililitrede 10⁷ hücrelik bir hücre yoğunluğunda optimal kullanım için titre edilir. Çoğu antikor 0,1 ile 10 µg/mL aralığında kullanılır. Splenik T-hücrelerinin deplesyonu için TH1'e özgü bir monoklonal antikor kullanıyoruz.

Kompleman tüketimine başlamak için, başlangıç hücre popülasyonu mililitre başına 2x10⁷ hücre olacak şekilde hücreleri %5 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu içeren hücre kültürü besiyerinde seyreltin. Örneğin, 5x10⁷ hücre 2,5 mililitre besiyerinde seyreltilmelidir. Bu hücre hacmi, nihai hacmin yarısıdır ve dolayısıyla tüketim sırasında kullanılan mililitre başına 1x10⁷ hücrelik hücre konsantrasyonunun iki katıdır.

Bu aşamada, deney sonunda tüketimin miktarlaştırılabilmesi için 10⁶ hücreye kadar saklayın. Ayrıca, gerekli miktardaki komplemeni oda sıcaklığında çözdürün. Pereze Biologicals tavşan komplemeni kullanarak 5×10⁷ hücre için 1/15'lik bir dilüsyonun uygun olduğunu belirledik; 1,5 mL dondurulmuş Eloqua yeterlidir.

Şimdi hücre süspansiyonuna uygun miktarda antikor ekleyin ve karıştırın. Komplemanı sterilize etmek için düşük protein bağlayan bir şırınga ucu filtresi kullanın. Şırıngayı bir ila iki mililitre besiyeri ile doldurun.

5x10⁷ hücreye kompleman eklemeden önce, 1/15 seyreltme için 340 mL komplemana ihtiyaç duyacağız. Ardından komplemanı, hücre ve antikor içeren tüpe doğrudan filtreleyin. Şimdi, tüpteki hücrelerin konsantrasyonu 1x10⁷ hücre/mL olacak şekilde nihai hacmi ayarlayın.

Ardından, hücreleri bir benmari içinde 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Hücreleri her 15 dakikada bir hafifçe ters çevirerek karıştırmayı unutmayın. İnkübasyonun ardından, hücreleri canlılığı etkilemeyecek bir hızda santrifüjleyin.

Ardından tekrar steril kabine dönüp süpernatantı atın. Sonrasında, hücreleri 10 mililitre besiyeri ile iki kez yıkayın. Hücre döküntülerinin toplandığını ve bir kısmının polistiren tüplerin kenarlarına yapıştığını gözlemleyin.

Son yıkamadan sonra, hücreleri 70 mikronluk steril bir naylon hücre süzgecinden geçirin. Son olarak, tükenme akışından önceki ve sonraki ilgili hücre popülasyonlarını karşılaştırarak hücre saflığını kontrol edin.

Sitozometri ve immünohistokimya, deneyler öncesinde hücre saflığını belirlemek için tercih edilen yöntemlerdir. Komplemanı aktive etmede yüksek verimliliğe sahip bir monoklonal antikor kullanıldığında, ilk kompleman tüketim aşaması hücreleri %95'ten fazla oranında tüketir. Bir örnek olarak, bir fare pleosit hücresi preparasyonundaki alfa beta T hücrelerinin yüzdesini ölçmek için akış sitometrisi kullandığımızda, tüm T hücreleri tarafından eksprese edilen ancak diğer lökositler tarafından eksprese edilmeyen anti five one ile kompleman tüketimi sonrası hücrelerin %32,2 oranında alfa beta T hücresi içerdiğini tespit ettik. TCR beta popülasyonu, %1,56'lık bir final konsantrasyona düşerek %95 oranında azalmıştır.

Kompleman tüketimi yoluyla, antijene özgü antikorlar kullanarak belirli hücre popülasyonlarını azaltmanın hızlı ve etkili bir yöntemini göstermiş oldum. Bu prosedürü uygularken, başlamadan önce her bir antikorun etkinliğini test etmeyi ve pilot bir deneyde kompleman miktarınızı titre etmeyi unutmayın. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.