Fare Periton Boşluk Hücreleri İzolasyon
28 Ocak 2010
Periton boşluğuna memelilerde doğuştan gelen bağışıklık yanıtları için çok önemli olan farklı bağışıklık hücre popülasyonlarının içerir. Verimli bir izolasyon yöntemi, bu hücrelerin biyokimyasal ve fonksiyonel analizler için gereklidir. Burada fare periton boşluğuna hücrelerin izolasyonu için kapsamlı bir yöntem sağlar.
Periton boşluğu hücrelerinin izolasyonu, ötanize edilmiş bir farenin sırt üstü sabitlenmesiyle başlar. Peritonun dış derisi kesilir ve iç deriye ulaşmak için nazikçe geri çekilir; periton boşluğuna %3 FBS içeren PBS enjekte edilir ve periton nazikçe masaj yapılarak uyarılır. Periton hücrelerini içeren sıvı toplanır ve buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüpe aktarılır.
Hücreler bir kez yıkanır ve bir hemositometre ile sayılır. Merhaba, ben Wisconsin Kan Merkezi Kan Araştırma Enstitüsü'ndeki Dr. Bon'un laboratuvarından Oji. Bugün size bir farenin periton boşluğundan hücrelerin izole edilmesi prosedürünü göstereceğiz.
Laboratuvarımızda çeşitli fenotipik, biyokimyasal ve immünolojik analizler için hücre elde etmek amacıyla bu prosedürü kullanıyoruz. Öncelikli olarak periton B hücresi popülasyonları ile ilgileniyoruz. Öyleyse başlayalım.
Periton boşluğundan immün hücreleri izole etmeye başlamadan önce, gerekli tüm malzemeleri hazırlayın. Bir buz kovası, 27 gauge iğneye sahip beş mililitrelik bir şırınga, 25 gauge iğneye sahip beş mililitrelik bir şırınga, strafor blok ve fareyi sabitlemek için raptiyeler toplayarak başlayın. Diseksiyon öncesinde, sabitleme bloğunu tutacak bir tepsi, makas ve pens ile toplama tüplerini hazırlayın.
%3 fetal dana serumu içeren PBS'yi önceden soğutun. Bunları ve toplama tüplerini deney boyunca buz üzerinde tutun; anestezik uygulama ve uygun ötanazi işlemlerinin ardından, fareye %70 etanol püskürtün ve fareyi sırtüstü olarak strafor blok veya diseksiyon pedinin üzerine yerleştirin. Pens ve makas kullanarak peritonun dış derisini kesin.
Periton boşluğunu döşeyen iç deriyi açığa çıkarmak için deriyi nazikçe geriye doğru çekin. Herhangi bir organı delmemeye dikkat ederek, 27 gauge bir iğneyi yavaşça peritona itin. Periton boşluğuna beş mililitre buz gibi soğuk PBS enjekte edin.
Şimdi, hücrelerin periton duvarından ayrılıp PBS çözeltisine düşmesini sağlamak için peritonu nazikçe masajlayın. Ardından, beş mililitrelik bir şırıngaya 25 gauge iğneyi eğik tarafı yukarı gelecek şekilde takın ve iğneyi peritona yerleştirin. Hücre veriminizi artırmak için mümkün olduğunca fazla sıvı toplayın.
Bu işlemi gerçekleştirirken, yağ dokusunun veya diğer organların iğneyi tıkamasını önlemek için ucu nazikçe hareket ettirin. İğneyi çıkarın ve hücre süspansiyonunu polipropilen toplama tüplerine boşaltın. Peritonun iç derisinde bir insizyon yaparak boşlukta kalan sıvıyı toplayın.
Plastik bir posterior pipetle kalan sıvıyı toplarken, cildi açık tutmak için pens kullanın. Son olarak, hücre süspansiyonunu 1500 RPM'de sekiz dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı atın ve hücreleri beş mililitre PBS içinde yeniden süspande edin. Hücrelerin hemositometre ile sayılması.
Tripan mavisi dışlama yöntemi kullanılarak hücre sayısının belirlenmesi sağlanacaktır. Genellikle, herhangi bir işlem uygulanmamış bir fareden 5 ila 10 milyon periton boşluğu hücresi izole edilebilir. Toplam hücre popülasyonunun %50 ila %60'ı B hücrelerinden oluşacaktır.
Yaklaşık %40'ı makrofajlar ve granülositler, %5 ila %10'u ise T hücreleri olacaktır. Size bir fareden periton boşluğu hücrelerinin nasıl izole edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, fareleri dikkatli bir şekilde ötanize ederek ve periton boşluğundaki herhangi bir organı delmeyerek, periton boşluğu hücre popülasyonundaki kan miktarını sınırlamak önemlidir.
Kanla kontamine olan tüm örneklerin atıldığından emin olun. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.
Genel Bakış
Bu makale, immün yanıtların incelenmesi için temel teşkil eden, farelerden periton boşluğu hücrelerinin izole edilmesine yönelik ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır. Prosedür, hücre popülasyonlarının bütünlüğünü sonraki analizler için korumak üzere tasarlanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
- Biyokimya
Arka Plan
- Periton boşluğu çeşitli immün hücre tiplerine ev sahipliği yapar.
- Bu hücreler, doğal bağışıklık yanıtlarında hayati bir rol oynarlar.
- İzolasyon yöntemleri, fonksiyonel ve biyokimyasal çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
- Bu hücrelerin anlaşılması, immünolojik araştırmalara yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Periton boşluğu hücrelerini izole etmek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Farelerdeki bağışıklık hücresi popülasyonlarının incelenmesini kolaylaştırmak.
- Ardışık immünolojik analizlerin doğruluğunu artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Farenin ötanazisinin yapılması ve diseksiyona hazırlanması.
- Periton boşluğuna %3 FBS içeren PBS enjeksiyonu.
- Periton hücrelerini içeren sıvının toplanması.
- İzole edilen hücrelerin santrifüjlenmesi ve sayılması.
Temel Sonuçlar
- Periton boşluğundan 5 ila 10 milyon hücre başarıyla izole edildi.
- Hücrelerin %50-60'ının B hücreleri olduğu tespit edildi.
- Yaklaşık %40'ı makrofajlar ve granülositlerdir.
- Hücrelerin %5 ila %10'u T hücreleridir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, periton boşluğundan immün hücrelerin izole edilmesi için etkilidir.
- Kan kontaminasyonunu önlemek için dikkatli bir ötanazi ve diseksiyon kritik öneme sahiptir.
- Bu prosedür, çeşitli immünolojik çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Alaka
Periton boşluğu immün hücrelerinin izolasyonu, fenotipik olarak tanımlanmış B hücresi ve makrofaj alt kümelerine erişim sağlayarak erken evre hedef doğrulamasını mümkün kılar. Bu işlem, fonksiyonel assayler için tekrarlanabilir primer hücre girdileri sunarak keşif süreçlerindeki mekanistik risklerin azaltılmasını destekler. Söz konusu yöntem, immünomodülatör ilaç taramalarıyla ilgili immün popülasyonların standardize geri kazanımı yoluyla, öncü bileşiklerin belirlenmesindeki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Otoimmünite ve enfeksiyon modellerinde terapötik hipotezlerin test edilmesi için B1a ve B1b hücre alt kümelerinin incelenmesine olanak tanır.
- Bilimsel Değer: Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı çalışmalarında yolakların açıklığa kavuşturulması için naif doku yerleşik makrofajlar sağlar.
- Operasyonel Değer: Hedef etkileşim taraması için bağışıklık hücresi popülasyonlarının tutarlı izolasyonu yoluyla biyolojik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Akış sitometrisi ve biyokimyasal analizler yoluyla fenotipik analiz için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kontrollü hücre verimi (fare başına 5–10 milyon hücre) aracılığıyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Operasyonel Değer: B hücrelerinin (%50–60), makrofajların (%40) ve T hücrelerinin (%5–10) kantitatif geri kazanımı sayesinde güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Otoreaktif B1 hücrelerinin ve düzenleyici IL-10 üreten alt grupların izole edilmesiyle hastalıkla ilgili sistem modellemesini destekler.
- Operasyonel Değer: Doğal IgM salgılayan B1 hücrelerinin izolasyonu yoluyla translasyonel biyobelirteç uyumunu kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Hastalık modellerinde mekanistik takip için primer immün hücreler sağlayarak preklinik sürekliliğe olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; hedef doğrulama, assay geliştirme ve preklinik mekanistik çalışmalar için primer immün hücreler sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Belirli B hücresi ve makrofaj alt kümelerinin izolasyonu yoluyla hipotez testlerini ve yolakların aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış hücre izolasyonu ve canlı immün popülasyonların geri kazanımı yoluyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analitik: Hemositometre sayımı ve canlılık dışlama yöntemlerini kullanarak hücre alt kümelerinin nicel karşılaştırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Doğal bağışıklık ve regülasyonla ilişkili B1 hücrelerinin izolasyonu yoluyla keşif aşamasını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İmmünoloji ve onkoloji keşif programları genelinde immün hücre temini için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fenotipik olarak karakterize edilmiş immün alt kümelere erişim yoluyla hedef doğrulamasında öngörücü güven.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış hücre verimi ve alt küme dağılımı aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: İmmünomodülatör taramasındaki mekanistik belirsizliğin azaltılmasıyla iyileştirilmiş devam/durdurma kararları.
- Portföy Etkisi: Fonksiyonel analiz panelleri için güvenilir primer hücre girdileri yoluyla riskle uyumlu önceliklendirme.
Uygulama Hususları
- Organ delinmesini ve kan kontaminasyonunu önlemek için fare diseksiyonu ve aseptik teknik konusunda uzmanlık gerektirir.
- Hücre işleme ve sayımı için şırıngalar, iğneler, santrifüj ve hemositometre dahil olmak üzere enstrümantasyona bağımlıdır.
- Tutarlılığı sağlamak için PBS/FBS hazırlama ve soğuk zincir yönetimi konusunda ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Peritonal boşluk hücreselliğini değiştiren hastalık modellerine uygulandığında adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Örnek bütünlüğünü bozan kan kontaminasyonundan kaçınmak için dikkatli ötanazi ve diseksiyon gerekliliği ile sınırlıdır.
