Lentivirüs Üretim
2 Ekim 2009
Lentiviruses yapmak için, DNA vektörleri insan 293 hücrelerine transfekte. Hasattan sonra ve supernatant yoğunlaşarak, virüs titresi bir akış sitometresi ile floresan ifade tarafından belirlenir.
Bu prosedür, 2 9 3 T hücrelerinin lentivirüs, plazmid ve viral paketleme vektörleri ile kesilmesi ile başlar, viral süpernatan en az 48 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra hasat edilir. Snat, ultrasantrifüjlemeden sonra bir ultrasantrifüj ile konsantre edilmek üzere filtrelenir. Viral pelet, virüs titresi elde etmek için PBS ile yeniden süspanse edilir, önce konsantre virüsü tam ortamda seyreltir, daha sonra hücreleri lentivirüs ile enfekte etmek için seri seyreltme gerçekleştirir.
Merhaba, ben California San Francisco Üniversitesi'ndeki Diyabet Merkezi'ndeki Michael McManus'un laboratuvarından Shein Wong. Adım Michael McManus. Bugün size lentivirüs üretimi için bir prosedür göstereceğiz.
Bu prosedürü laboratuvarda RNA etkileşimi için lentivirüsler yapmak için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokole başlamak için, 2 9 3 T hücrelerini transfekte etmek için DNA'yı hazırlayın.
İlk olarak, FU gen altı transfeksiyon reaktifini 1.5 mililitrelik bir tüpte 30 mikrolitre Fuji altıyı 600 mikrolitre serumsuz ortamla karıştırarak seyreltin. Tüpü beş dakika boyunca orta inkübe oda Sıcaklığına verirken Fuji'nin yan tarafına temas etmesine izin vermemeye dikkat edin. Daha sonra, tüpün kapağında, dört mikrogram lentiviral plazmidi 1.33 mikrogram ile karıştırın.
Her üçüncü nesil viral ambalaj vektörleri. Lentiviral plazmit DNA'yı içerir. Virüs, enfekte olan her hücrenin genomuna girerken, ambalaj vektörleri bir mercimek virüsünün kapağı kapatması ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırması için gereken diğer tüm proteinler için genleri içerir.
DNA ve transfeksiyon reaktifini oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe edin. Şimdi sıra hazırladığınız DNA ile 2 9 3 hücreyi transfekte etmeye geldi, 24 saat önceden kapladığınız ve doku kültürü başlığında %50 ila 70 co akıcılığına ulaşmış hücreleri kullanın, hazırlanan DNA'nın tamamını plakayı ileri geri eğerek nazikçe karıştırılan 2 9 3 plakasına pipetleyin, Hücreleri inkübatöre geri koyun ve viral üretimin hasattan önce 48 ila 96 saat devam etmesine izin verin. Kuluçka sırasında, 2 9 3 hücreleri, genomları ilgilendiğiniz DNA'nın bir RNA kopyasını içeren lentivirüsler üretir.
Şimdi virüsü toplama zamanı. Hücrelerinizi inkübatörden çıkarın. Doku kültürü davlumbazında, 0,4 veya beş mikronluk bir şırınga filtresi, tek kullanımlık 10 mililitrelik bir şırınga ve bir UltraClear Beckman santrifüj tüpü bulundurun.
Şimdi virüsü içeren süpernatanı çıkarmak için tek kullanımlık şırıngayı kullanın. Uca 0,45 mikronluk bir şırınga filtresi takın ve virüsü bir UltraClear Beckman santrifüj tüpüne filtreleyin. Filtre, hücrelerin atılmadan önce sadece virüslerin geçmesine izin vermez, virüs üreten tüm hücreleri inkübe eder.
Kültür plakaları, şırıngalar ve filtreler 45 dakika boyunca% 10 ağartıcıda pişirilir. Artık virüsü toplayıp filtrelediğinize göre, önce virüsü ultrasantrifüjleme ile konsantre etmenin zamanı geldi. Virüs içeren tüm tüpleri birbirinden 0.2 gram içinde dengelemek için serumsuz DMEM kullanın.
Ardından, dengeli santrifüj tüplerini SW 41 TI veya SW 28 rotor kovalarına yükleyin. Rotor kovalarını kapatın ve rotora asın. Ardından rotoru ultrasantrifüjün içine yerleştirin.
Virüsü bir SW 41 TI rotorunda 25.000 RPM'de veya bir SW 28 rotorunda 24.000 RPM'de dört santigrat derecede yaklaşık 90 dakika döndürün. Santrifüjlemeden sonra, doku kültürü başlığına geri dönün ve SNAT'ı %10 ağartıcı içeren bir kaba dökmek için tüpü ters çevirin. Peletin etrafındaki fazla sıvıyı emmek için bir Kim mendili kullanın ve peleti yeniden süspanse etmeye hazır olana kadar tüpü uygun bir rafta en fazla beş dakika boyunca ters çevirin.
Viral peleti yeniden süspanse etmek için, tüpünüze 100 mikrolitre steril önceden filtrelenmiş PBS eklemek için bir filtre ucu kullanın. Ardından yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Yeniden süspansiyonu tamamlamak için virüsü gece boyunca dört derecede bırakın.
Viral preparatları yaklaşık bir hafta boyunca dört derecede ve eksi 80 derecede bir yıla kadar saklayabilirsiniz. Atmadan önce tüm boş tüplere %10 çamaşır suyu uygulamayı unutmayın. Viral hazırlığı bir haftadan daha uzun süre kullanmayı düşünüyorsanız, buzdolabında saklanacaktır.
Gelecekteki deneyler için minimum beş ila 20 mikrolitrelik alikotlar ve titrasyon dondurma için üç ila beş mikrolitrelik bir alikot yapın ve alikotları yaklaşık eksi 80'de saklayın. Bir sonraki adım viral titreyi belirlemektir. Lentiviral plazmidinize bir floresan raportör gen eklediyseniz, enfekte olmuş hücreler floresan olur ve akış sitometrisi kullanarak viral titreyi belirleyebilirsiniz.
Başlamak için, üç mikrolitre konsantre virüsü, bir ila altı kuyucukta 1.5 mililitre tam ortama seyreltin. 96 oyuklu bir plakanın tek bir sırasında. İlk kuyucuğa virüs içermeyen 100 mikrolitre ortam eklemek DM.To altı kuyucuğun tümüne aşağıdaki seri seyreltmeleri gerçekleştirin.
Bu sizin lekesiz kontrolünüzdür. İkincisine, üçüncüye 100 mikrolitre seyreltilmiş virüs ekleyin. İkinci kuyudan dördüncüye kadar 100 mikrolitre karışım ekleyin.
Üçüncü kuyudan beşinciye 100 mikrolitre ekleyin. Dördüncü kuyudan ve altıncıya 100 mikrolitre ekleyin. Beşinciden 100 mikrolitre ekleyin.
Son olarak, altıncı kuyudan 100 mikrolitre alın ve atın ve ağartın, tüm kuyulardaki toplam hacmi DMEM ile 200 mikrolitreye getirin. Her seyreltme ile viral konsantrasyon yarı yarıya azalır. Bunların yalnızca önerilen seyreltmeler olduğunu ve çoğu konsantre virüsü titre etmek için iyi çalışması gerektiğini unutmayın.
Virüsünüzün titresi düşükse veya konsantre değilse, seyreltmelerinizi ayarlamanız gerekebilir. Kullanılmayan seyreltilmiş virüsleri, biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabına atmadan önce 45 dakika boyunca %10 çamaşır suyu ile muamele edin. Altı kuyucuğun her birine yaklaşık 15.000 sağlıklı aktif olarak 2 9 3 T hücresi ekleyin.
16 viral preparatı titrelemek için tek bir 96 kuyucuklu plaka kullanabilir, kuyucukları 200 mikrolitreye kadar doldurabilir, hücreleri inkübatöre geri döndürebilir ve enfeksiyonun en az 48 saat ilerlemesine izin verebilirsiniz. İnkübasyondan sonra, bir akış sitometresi kullanarak hücre floresansını analiz edin. Eklenen virüsün mililitresi başına titreyi veya bulaşıcı viral partiküllerin sayısını belirlemek için kuyu başına floresan hücrelerin yüzdesini kullanabilirsiniz.
Akışı yorumlarken aşağıdaki formülle mililitre başına bulaşıcı birim sayısını hesaplayın. Sitometre sonuçları. Doğru titre hesaplamalarının ancak enfekte olmuş hücreler hücre başına birden fazla viral entegrasyon almadığında elde edilebileceğini unutmayın.
Durumun böyle olduğundan emin olmak için, hesaplamalar için %15'ten daha az enfeksiyon oranına sahip hücreler kullanın. Daha yüksek enfeksiyon oranlarına sahip hücreler muhtemelen hücre başına birden fazla viral entegrasyon almış olacaktır. İkinci adımda önerilen seyreltme, bu enfeksiyon aralığında birkaç numune vermelidir.
İdeal olarak, son titreyi hesaplayabileceğiniz bir titrasyon grafiği oluşturmak için birkaç numune kullanın. Takılan doğrusal çizgiden hesaplanan formül, viral titreyi hesaplamak için kullanılabilir, ancak gerekirse tek bir numune kullanarak titreyi hesaplayabilirsiniz. Konsantre olmayan virüs için mililitre başına bir kez 10 ila yedinci dönüştürücü birim ve konsantre virüs için mililitre başına bir kez 10 ila sekizinci dönüştürücü birim titresi beklenebilir.
Bu prosedürü yaparken size lentivirüslerin nasıl üretileceğini gösterdik. Tüm biyogüvenlik düzenlemelerine uymak ve atıkları uygun şekilde bertaraf etmek önemlidir. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, insan 293 hücreleri kullanılarak lentivirüs üretimi prosedürünü detaylandırmaktadır. Süreç, hücrelerin DNA vektörleri ile transfeksiyonunu, viral süpernatanı hasat etmeyi ve floresan ekspresyonu aracılığıyla virüs titresinin belirlenmesini içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Viroloji
- Gen Terapisi
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Lentivirüsler, gen tesliminde değerli araçlardır.
- İnsan 293 hücreleri, viral üretim için yaygın olarak kullanılır.
- Virüs titresinin anlaşılması, etkili uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- Floresan ekspresyon, viral parçacıkların kantitasyonunu sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Lentivirüs üretimi için güvenilir bir yöntemi göstermek.
- Transfeksiyon ve hasat süreçlerine dair bilgiler sağlamak.
- Lentivirüslerin araştırma ve terapötik uygulamalarda kullanımını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- 293T hücrelerinin lentivirüs ve paketleme vektörleri ile transfeksiyonu.
- Virüs üretimine izin vermek için en az 48 saat inkübasyon.
- Viral süpernatanı hasat etmek ve filtrelemek.
- Virüsü konsantre etmek için ultrasantrifüjleme.
Ana Sonuçlar
- 293T hücrelerinden lentivirüsün başarılı üretimi.
- Ultrasantrifüjleme kullanarak viral parçacıkların etkili konsantrasyonu.
- Seri seyreltme yöntemiyle virüs titresinin doğru belirlenmesi.
- Prosedürün gelecekteki uygulamalar için güvenilirliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Özgün metot, lentivirüs üretimi için etkilidir.
- Floresan temelli titre belirleme yöntemi etkilidir.
- Bu protokol, çeşitli araştırma ihtiyaçlarına uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Lentivirus production enables robust gene silencing and functional genomics studies across diverse cell types, supporting early discovery and target validation in biopharma R&D. Quantitative titering via flow cytometry ensures reproducibility and scalability for downstream screening and mechanistic studies. This capability underpins predictive confidence and risk-adjusted decision-making at key portfolio inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables stable gene knockdown for interrogation of gene function in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise modulation of target expression.
- Facilitates functional target validation through reproducible delivery of shRNA constructs.
Screening & Assay Development
- Provides standardized lentiviral stocks for consistent assay development and compound screening.
- Delivers quantitative viral titers to ensure reproducible infection rates across experiments.
- Enables scalable production for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical model validation when gene silencing is required.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling pathway interrogation in relevant cell systems.
- Reduces biological ambiguity in preclinical studies through controlled gene modulation.
Pipeline & Workflow Integration
Lentivirus production integrates into the discovery-to-preclinical continuum, providing a reusable platform for gene modulation and functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification via targeted gene knockdown.
- Screening: Supplies reproducible, titered viral stocks for assay readiness and quantitative outputs.
- Analytics: Enables precise measurement of infection efficiency and gene silencing via flow cytometry.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models through consistent gene modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable across multiple targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible lentiviral preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust functional studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and biosafety procedures.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for concentration and titering.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible viral production and quantification.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for specific systems.
- Strict biosafety and waste disposal protocols must be followed throughout the workflow.
