Lentivirüs Üretim

Bu prosedür, 293T hücrelerinin lentivirüs, plazmid ve viral paketleme vektörleri ile transfekte edilmesiyle başlar; viral süpernatan en az 48 saatlik bir inkübasyon süresinin ardından toplanır. Süpernatan, ultrasantrifüj ile konsantre edilmek üzere filtrelenir. Viral pelet, virüs titresi elde etmek için PBS ile yeniden süspanse edilir; önce konsantre virüs komple medyumda seyreltilir, ardından hücreleri lentivirüs ile enfekte etmek için seri dilüsyon gerçekleştirilir.

Merhaba, ben Kaliforniya Üniversitesi San Francisco'daki Diyabet Merkezi'nde bulunan Michael McManus laboratuvarından Shein Wong. Ben de Michael McManus. Bugün size lentivirüslerin üretimi için uygulanan bir prosedürü göstereceğiz.

RNA interferansı için lentivirüsler üretmek amacıyla laboratuvarda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokole başlamak için, 2 9 3 T hücrelerini transfekte etmek için kullanılacak DNA'yı hazırlayın.

İlk olarak, 30 µL Fuji six'ı 600 µL serumsuz besiyeri ile karıştırarak 1,5 ml'lik bir tüpte FU gene six transfeksiyon reaktifini seyreltin. Fuji'yi besiyerine eklerken tüpün kenarlarına değmemesine dikkat edin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, tüpün kapağında, 4 µg lentiviral plazmidi 1,33 µg ile karıştırın.

Her biri üçüncü nesil viral paketleme vektörleridir. Lentiviral plazmit DNA'yı içerir. Virüs, enfekte ettiği her hücrenin genomuna entegre olur; paketleme vektörleri ise bir lentivirüs oluşturmak için gerekli olan diğer tüm proteinlere ait genleri içerir. Kapağı kapatın ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.

DNA'yı ve transfeksiyon reaktifini oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe edin. Şimdi, hazırladığınız DNA ile 293 hücrelerini transfekte etme zamanıdır; doku kültürü kabininde, 24 saat önce ekilmiş ve %50 ila %70 konfluens düzeyine ulaşmış hücreleri kullanın. Hazırlanan tüm DNA'yı pipetle 293 plakasına aktarın. Plakayı hafifçe öne ve arkaya eğerek nazikçe karıştırın, hücreleri inkübatöre geri yerleştirin ve hasat öncesinde viral üretimin 48 ila 96 saat boyunca devam etmesini sağlayın. İnkübasyon sırasında, 293 hücreleri, genomları ilgilenilen DNA'nızın bir RNA kopyasını içeren lentivirüsler üretir.

Şimdi virüsü toplama zamanı. Hücrelerinizi inkübatörden çıkarın. Doku kültürü kabininde 0,4 veya 5 mikronluk bir şırınga filtresi, tek kullanımlık 10 mililitrelik bir şırınga ve bir UltraClear Beckman santrifüj tüpü hazır bulundurun.

Artık virüs içeren süpernatanı uzaklaştırmak için tek kullanımlık şırıngayı kullanın. Ucuna 0,45 mikronluk bir şırınga filtresi takın ve virüsü bir UltraClear Beckman santrifüj tüpüne filtreleyin. Filtre, atılmadan önce sadece virüslerin geçmesine izin verir, hücrelerin geçişini engeller; virüs üreten tüm hücreleri inkübe edin.

Kültür plaklarını, şırıngaları ve filtreleri 45 dakika boyunca %10'luk çamaşır suyunda bekletin. Virüsü toplayıp filtrelediğinize göre, şimdi öncelikle ultrasantrifüj ile virüsü konsantre etme zamanıdır. Virüs içeren tüm tüpleri birbirine 0,2 gram mesafe kalacak şekilde dengelemek için serumsuz DMEM kullanın.

Ardından, dengelenmiş santrifüj tüplerini SW 41 TI veya SW 28 rotor kovalarına yerleştirin. Rotor kovalarını sızdırmaz şekilde kapatın ve rotora sabitleyin. Daha sonra rotoru ultrasantrifüjün içine yerleştirin.

Virüsü, SW 41 TI rotorda 25.000 RPM'de veya SW 28 rotorda 24.000 RPM'de, dört santigrat derecede yaklaşık 90 dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra doku kültürü kabinine geri dönün ve tüpü ters çevirerek SNAT'ı %10'luk çamaşır suyu içeren bir kaba boşaltın. Pelet etrafındaki fazla sıvıyı emmek için bir Kim wipe kullanın ve peleti yeniden süspanse etmeye hazır olana kadar tüpü uygun bir rafa, beş dakikayı geçmeyecek şekilde ters çevirerek yerleştirin.

Viral peleti yeniden süspand etmek için, tüpünüze filtreli uç kullanarak 100 µL steril ön filtrelenmiş PBS ekleyin. Ardından, yaklaşık 20 kez pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın. Süspansiyonun tamamlanması için virüsü gece boyunca 4 °C'de bekletin.

Viral preparatları dört derecede yaklaşık bir hafta, eksi 80 derecede ise bir yıla kadar saklayabilirsiniz. Atmadan önce tüm boş tüplerin %10'luk çamaşır suyu ile işlemden geçirildiğinden emin olun. Viral preparatı bir haftadan daha uzun süre kullanmayı planlıyorsanız, buzdolabında muhafaza edebilirsiniz.

Gelecekteki deneyler için beş ila 20 µL'lik minimum alikotlar ve titrasyon dondurması için üç ila beş µL'lik bir alikot hazırlayın; alikotları yaklaşık -80 °C'de saklayın. Bir sonraki adım viral titrenin belirlenmesidir. Lentiviral plazmidinize floresan bir raporlayıcı gen eklediyseniz, enfekte hücreler floresans gösterecektir ve viral titre akış sitometrisi kullanılarak belirlenebilir.

Başlamak için, 96 kuyucuklu bir plakanın tek bir sırasındaki bir ila altı numaralı kuyucuklara, üç mikrolitre konsantre virüsü 1,5 mililitre komple besi yerinde seyreltin. Altı kuyucuğun tamamına, 100 mikrolitre komple DM ile aşağıdaki seri seyreltmeleri uygulayın. İlk kuyucuğa virüs içermeyen 100 mikrolitre besi yerini ekleyin.

Bu, boyanmamış kontrolünüzdür. İkinci kuyucuğa 100 µL seyreltilmiş virüs ekleyin. Üçüncü kuyucuğa da 100 µL ekleyin. İkinci kuyucuktaki karışımdan 100 µL'yi dördüncü kuyucuğa ekleyin.

Üçüncü kuyucuktan beşinciye 100 µL ekleyeceğiz. Dördüncü kuyucuktan altıncıya 100 µL ekleyeceğiz. Beşinci kuyucuktan 100 µL ekleyeceğiz.

Son olarak, altıncı kuyucuktan 100 µL alıp atın ve çamaşır suyuyla sterilize edin; tüm kuyucuklardaki toplam hacmi DMEM ile 200 µL'ye tamamlayın. Her seyreltmede, viral konsantrasyon yarıya iner. Bunların yalnızca önerilen seyreltmeler olduğunu ve çoğu konsantre virüsün titrasyonu için uygun sonuçlar vereceğini unutmayın.

Virüs titreniz düşükse veya konsantre edilmemişse, dilüsyonlarınızı ayarlamanız gerekebilir. Kullanılmayan tüm dilüe virüsü, biyotehlike atık konteynerine atmadan önce 45 dakika boyunca %10'luk çamaşır suyu ile işleme tabi tutun. Altı kuyucuğun her birine yaklaşık 15.000 sağlıklı, aktif olarak bölünen 2 9 3 T hücresi ekleyin.

16 viral preparatın titresini belirlemek için tek bir 96 kuyucuklu plaka kullanabilir, kuyucukları 200 microliters'e tamamlayabilir, hücreleri inkübatöre geri yerleştirebilir ve enfeksiyonun en az 48 saat boyunca ilerlemesine izin verebilirsiniz. İnkübasyonun ardından, hücre floresansını bir akış sitometresi kullanarak analiz edin. Eklenen virüsün mililitresi başına düşen enfeksiyöz viral partikül sayısını veya titreyi belirlemek için kuyucuk başına floresan hücre yüzdesini kullanabilirsiniz.

Akış sitometre sonuçlarını yorumlarken mililitre başına düşen enfeksiyöz birim sayısını aşağıdaki formül ile hesaplayın. Doğru titrasyon hesaplamalarının yalnızca, enfekte hücrelerin hücre başına en fazla bir viral entegrasyon aldığı durumlarda yapılabileceğini unutmayın.

Bunun sağlandığından emin olmak için, hesaplamalarda %15'ten düşük enfeksiyon oranına sahip hücreleri kullanın. Daha yüksek enfeksiyon oranına sahip hücrelerin, hücre başına birden fazla viral entegrasyon almış olması muhtemeldir. İkinci adımda önerilen dilüsyon, bu enfeksiyon aralığında birkaç örnek sağlamalıdır.

İdeal olarak, nihai titreyi hesaplayabileceğiniz bir titrasyon grafiği oluşturmak için birkaç örnek kullanın. Viral titre, uydurulmuş doğrusal çizgiden elde edilen formülle hesaplanabilir; ancak gerekirse titre tek bir örnek kullanılarak da hesaplanabilir. Konsantre edilmemiş virüs için mililitrede 1×10⁷ transduksiyon birimi, konsantre virüs için ise mililitrede 1×10⁸ transduksiyon birimi titre beklenir.

Bu prosedür uygulanırken lentivirüslerin nasıl üretileceğini size göstermiş olduk. Tüm biyogüvenlik düzenlemelerine uymak ve atıkları uygun şekilde bertaraf etmek önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.