Name: Lentivirüs Üretim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Öğrenin, 293T hücrelerinde lentivirüs üretimi için transfeksiyon, süpernatant toplama ve ultrasantrifüj konsantrasyonu yöntemlerini. Bu protokol gen terapisi ve RNA interferans araştırmalarında güvenilir viral partikül elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sandler Astım Temel Araştırma Merkezi (SABRE) Sandler Vakfı

Bölüm 1: Lentiviruses üretmek için HEK 293 Hücre Transfeksiyon * 24 saat önce% 50-70 ertesi gün confluency için bir 10cm çanak transfeksiyon, plaka 2,5 X 10 6 hücreleri. <ol><li> Bu protokol virüs yapmak için bir sonraki hücreleri transfect hangi DNA hazırlayarak başlayın. İlk olarak, FuGENE 6 Transfeksiyon Reaktif Roche, hücrelerin DNA sürebilir yapmak bir lipid reaktif seyreltin. 1.5 ml tüp, pipet 30μl FuGENE 6 600ul serum serbest ortama (SFDMEM). Ortama teslim olarak FuGENE tüp tarafında dokunmatik izin vermeyin dikkatli olun. Bu FuGENE ve SFDMEM karıştırın ve oda sıcaklığında inkübe, 5 dakika izin verin. </li><li> Tüpün kapağı, 4 mg her 3 üncü nesil viral ambalaj vektörler (pMDL, pRSV ve pVSV-G) ile plazmid lentiviral 4 mikrogram karıştırın. Lentiviral plazmid DNA içeren ambalaj vektörleri bir lentivirüs yapmak için gerekli tüm diğer proteinlerin genleri içeren virüs, bulaştığı her hücre genomu içine gireceğiz. </li><li> Tersine tüp birkaç kez karıştırın ve kapağını kapatın. </li><li> 15-20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Pipet 293 plaka içine tüpün tüm içeriği. Ileri ve geri devirme plaka yavaşça karıştırın. </li><li> Inkübatör hücreleri dönün ve viral üretim, hasat önce 48-96 saat süreyle devam etmesine izin. </li><li> İnkübasyon sırasında, 293 hücreler lentiviral yapının bir RNA kopyasını oluşturma, lentiviral plazmid DNA ilgi yazıya. Onlar da yazıya ve virüs proteinleri içine ambalaj vektörü genler çevirmek. Bu proteinler, virüs yazıya ters ve bozar tüm hücreleri genomların takın lentiviral inşa RNA sürümü, içeren virüsler yapmaya devam edin. </li></ol> Bölüm 2: lentiviral Hasat <ol><li> Kuluçka döneminden sonra, kuluçka hücreleri almak ve virüs içeren süpernatant kaldırmak için tek kullanımlık, 10 ml şırınga kullanabilirsiniz. Süpernatant 10ml hakkında olacaktır. </li><li> 0.45μM şırınga ucu filtre takın ve Beckman ultrasantrifüjdeki tüp içine virüs filtre. Bu filtre, sadece virüslerden sağlar ve hücrelerin geçmesi için değil. </li><li> Atmadan önce, tüm virüs üreten hücreler inkübe, kültür plakaları, şırınga ve 45 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu filtreleri. </li></ol> Bölüm 3: Ultrasantrifügasyon üzerinden lentiviral Konsantrasyon <ol><li> GB-41Ti veya SW-28 rotor kova içine santrifüj tüplerine yükleyin. </li><li> Tüm virüs içeren dengelemek için 0.2g içinde tüpler serum ücretsiz DMEM kullanın. </li><li> Rotor kova ultrasantrifüjdeki içinde rotor yerleştirmeden önce kapatın ve rotor üzerine onları kanca Mühür </li><li> Spin virüs bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika 4 ° C SW-41Ti rotor 25.000 rpm veya SW-28 rotor 24.000 rpm. </li><li> Bir doku kültürü kaputu,% 10 çamaşır suyu içeren bir kap içine süpernatant dökmek için tüpler ters ters. </li><li> Pelet çevresinde aşırı sıvı emer ve beş dakika daha fazla için uygun bir rafa tüp ters bir Kimwipe kullanın. </li><li> Viral pelet yeniden askıya için 100 mcL steril PBS tüp eklemek için bir filtre ucu kullanın, ardından 20 kez aşağı yukarı pipet ve. </li><li> 4 virüs bırakın ° C yeniden süspansiyon tamamlamak için bir gecede. Bir virüs preparatlarıyla yaklaşık 1 hafta süreyle ve en fazla bir yıl için -80 derece 4 derece kaydedebilirsiniz. Atılmadan önce% 10 çamaşır suyu ile tüm boş tüpler tedavi etmeyi unutmayın. </li><li> Viral hazırlık 1 haftadan daha uzun süre kullanmak niyetinde ise, titrasyon için 5μl gelecek 3 deney ve 1 kısım için asgari 5-20μl alikotları olun. Dondurma ve eksi 80 alikotları saklamak. </li></ol> Bölüm 4: Akım Sitometri lentiviral Titrasyon <ol><li> Bir sonraki adım, flow sitometri viral titresi tespit etmektir. Bu yöntem, yalnızca lentiviral plazmid floresan muhabiri geni içeren durumlarda çalışır. Fikir virüs, bir hücreye bozar, o hücre genomu içine lentiviral plazmid DNA tanıtır. Enfekte hücrenin sonra uyarlamak ve tercüme lentiviral plazmid yer alan genlerin, bir floresan raportör gen dahil, enfekte olan hücreleri floresan. Floresan seviyesi virüsün potens yada titre temsil eder. </li><li> Titre her viral stoğu olması için, 1.5 ml (DMEM kalem strep, glutamin, FBS) eksiksiz bir medya içine konsantre virüs 3 ul sulandırmak. </li><li> 96 plaka tek bir satır kuyuları 1-6, aşağıdaki seri dilüsyonları gerçekleştirin: 100 ul tam DMEM medya eklemek Tüm 6 kuyu. Iyi iyi 100 ul eklemek iyi ikinci, (bu lekesiz kontrolü) hiçbir virüs medya 100μl eklemek üçüncü, seyreltilmiş virüsün 100 ul (eşdeğer 1&#39;e ml sulandırılmamış virüs) ilkkarışımı iyi ikinci, dördüncü, beşinci, iyi 3. 100 ml 4. sıra ve altıncı 100μl eklemek iyi 5. 100 ul eklemek. Son olarak 6. sıra 100ul almak ve çamaşır atın. Her bir kuyunun önce bir virüs yarım hacmi bir seri dilüsyon yapıldı. </li><li> 200μl tüm kuyuların toplam hacmi getirin. Bunların en yoğun virüsler titering için çalışması gerektiğini, sadece önerilen dilüsyonları unutmayın. Virüs titresi düşük veya Konsantre bir dilüsyonları ayarlamanız gerekebilir. </li><li> Kullanılmayan bir biyolojik tehlikeli atık kabı içine atılmadan önce 45 dakika süreyle% 10 oranında çamaşır suyu ile seyreltilmiş virüs davranın. </li><li> ~ 15.000 sağlıklı, aktif 293 hücrelerin bölünerek, her biri için 6 kuyu ekleyin. Bir tek 96-plaka 16 viral preparatlarıyla titresi kullanılabilir. </li><li> % 5 CO ile 37 derece inkübatör hücreleri dönün 2 ve enfeksiyon en az 48 saat süreyle devam etmek için izin. </li><li> Inkübasyondan sonra, hücrelerin bir akış sitometresi ile muhabir ifade (bizim durumumuzda floresan) analiz edilir. Viral parçacıkların de ortalama floresan hücrelerinin yüzde quantitated. </li></ol> Aşağıdaki formül ile ml&#39;de bulaşıcı birimlerinin sayısını hesaplayın: <div style="text-align:center;"> (# Enfeksiyonu X muhabiri pozitif hücrelerin gün başına hücre sayısı) X 1000 ______________________________________________________ vektör ml </div> Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları: 48 saatlik bir kuluçka dönemi sonrası transfeksiyon sonra, 293 hücrelerinin plaka floresan az% 90 civarında olmalıdır. Floresan hücrelerinin yüksek oranda virüs üreten hücreler yüksek bir yüzdesinin bir göstergesidir. Resuspending santrifüj sonra, viral pelet zorlukla görülebilir. Pelet açık ve çok küçük olduğu gibi bu durum normaldir. hücreleri, hücre başına en fazla bir viral entegrasyon almış (floresan) enfekte tek doğru titresi hesaplara ulaşmak akış sitometresinin sonuçları yorumlama, not. Bu durumda olduğundan emin olmak için, hesaplamalar için &lt;% 15 enfeksiyon oranı ile hücre kullanın. Hücreler daha yüksek enfeksiyon oranları muhtemelen, hücre başına birden fazla virüs integrants aldık. 2. adımda önerdi dilüsyonları enfeksiyon bu aralığın içinde birkaç örnek verim. İdeal olarak, nihai titresi hesaplayabilirsiniz titrasyon arsa (doğrusal çizgi) oluşturmak için birkaç örnek kullanabilirsiniz, ancak gerekirse, tek bir örnek kullanarak titresi hesaplayabilirsiniz. Tahmin titresi 1.0 x 10 7 TU / un konsantre virüs ml ve 1.0 x 10 8 TU / ml konsantre virüs için.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM HEK 293T hücreleri Penisilin-streptomisin Glutamin Fosfat tamponlu salin FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 transfeksiyon reaktifi pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır suyu</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-cm hücre kültürü kapları 96 kuyucuklu hücre kültürü plakaları</td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtreli pipet uçları</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5ml Eppendorf tüpleri Şırınga Şırınga filtresi (0.45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%5 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; doku kültürü inkübatörü</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41T.I rotoru</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lentivirüs Üretim

Lentivirus Production

RNA enterferans (RNAi) canlı hücrelerin gen susturma bir sistemdir. RNAi, genler homolog kısa müdahale RNA&#39;lar sırayla (siRNA) post-transkripsiyonel devlet susturulmaktadır. Kısa saç tokası RNA&#39;lar, siRNA habercisi, çeşitli hücre tipleri RNAi için izin lentivirüs kullanarak ifade edilebilir. Human Immunodeficiency Virus Lentiviruses, hücrelerin bölünmesi ve non-bölünmesi bulaşmasını yeteneğine sahiptir. Biz paketi lentiviruses bir prosedür anlatacağız. Ambalaj yetkili virüs DNA vektörleri hazırlanması anlamına gelmektedir. Lentiviral vektör üretim sistemleri doğal viral genomun bireysel yardımcı plazmid yapıları bölünmüş olan bir &#39;bölünme&#39; sistemi dayanmaktadır. Bu dört ayrı vektörleri farklı viral elemanlarının bölme lentiviral genomunun adventif rekombinasyon çoğaltma yeteneğine sahip bir virüs yaratma riski azalır. Burada ilgi ve üç ambalaj vektörler shRNA (p-VSVG, pRSV, pMDL) içeren bir vektör geçici insan 293 hücrelerine transfekte. En azından 48 saatlik bir kuluçka döneminden sonra, virüsü içeren süpernatant hasat ve yoğunlaşmıştır. Son olarak, virüs titresi muhabiri (floresan) bir akış sitometresinde ifade tarafından belirlenir.

Lentiviruses yapmak için, DNA vektörleri insan 293 hücrelerine transfekte. Hasattan sonra ve supernatant yoğunlaşarak, virüs titresi bir akış sitometresi ile floresan ifade tarafından belirlenir.

Lentivirüs Üretim

RNA interferansı (RNAi), canlı hücrelerdeki bir gen susturma sistemidir. RNAi'de, kısa müdahale eden RNA'lar (siRNA) ile dizi bakımından homolog olan genler...

Bu prosedür, 293T hücrelerinin lentivirüs, plazmid ve viral paketleme vektörleri ile transfekte edilmesiyle başlar; viral süpernatan en az 48 saatlik bir inkübasyon süresinin ardından toplanır. Süpernatan, ultrasantrifüj ile konsantre edilmek üzere filtrelenir. Viral pelet, virüs titresi elde etmek için PBS ile yeniden süspanse edilir; önce konsantre virüs komple medyumda seyreltilir, ardından hücreleri lentivirüs ile enfekte etmek için seri dilüsyon gerçekleştirilir.Merhaba, ben Kaliforniya Üniversitesi San Francisco'daki Diyabet Merkezi'nde bulunan Michael McManus laboratuvarından Shein Wong. Ben de Michael McManus. Bugün size lentivirüslerin üretimi için uygulanan bir prosedürü göstereceğiz.RNA interferansı için lentivirüsler üretmek amacıyla laboratuvarda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokole başlamak için, 2 9 3 T hücrelerini transfekte etmek için kullanılacak DNA'yı hazırlayın.İlk olarak, 30 µL Fuji six'ı 600 µL serumsuz besiyeri ile karıştırarak 1,5 ml'lik bir tüpte FU gene six transfeksiyon reaktifini seyreltin. Fuji'yi besiyerine eklerken tüpün kenarlarına değmemesine dikkat edin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, tüpün kapağında, 4 µg lentiviral plazmidi 1,33 µg ile karıştırın.Her biri üçüncü nesil viral paketleme vektörleridir. Lentiviral plazmit DNA'yı içerir. Virüs, enfekte ettiği her hücrenin genomuna entegre olur; paketleme vektörleri ise bir lentivirüs oluşturmak için gerekli olan diğer tüm proteinlere ait genleri içerir. Kapağı kapatın ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.DNA'yı ve transfeksiyon reaktifini oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe edin. Şimdi, hazırladığınız DNA ile 293 hücrelerini transfekte etme zamanıdır; doku kültürü kabininde, 24 saat önce ekilmiş ve %50 ila %70 konfluens düzeyine ulaşmış hücreleri kullanın. Hazırlanan tüm DNA'yı pipetle 293 plakasına aktarın. Plakayı hafifçe öne ve arkaya eğerek nazikçe karıştırın, hücreleri inkübatöre geri yerleştirin ve hasat öncesinde viral üretimin 48 ila 96 saat boyunca devam etmesini sağlayın. İnkübasyon sırasında, 293 hücreleri, genomları ilgilenilen DNA'nızın bir RNA kopyasını içeren lentivirüsler üretir.Şimdi virüsü toplama zamanı. Hücrelerinizi inkübatörden çıkarın. Doku kültürü kabininde 0,4 veya 5 mikronluk bir şırınga filtresi, tek kullanımlık 10 mililitrelik bir şırınga ve bir UltraClear Beckman santrifüj tüpü hazır bulundurun.Artık virüs içeren süpernatanı uzaklaştırmak için tek kullanımlık şırıngayı kullanın. Ucuna 0,45 mikronluk bir şırınga filtresi takın ve virüsü bir UltraClear Beckman santrifüj tüpüne filtreleyin. Filtre, atılmadan önce sadece virüslerin geçmesine izin verir, hücrelerin geçişini engeller; virüs üreten tüm hücreleri inkübe edin.Kültür plaklarını, şırıngaları ve filtreleri 45 dakika boyunca %10'luk çamaşır suyunda bekletin. Virüsü toplayıp filtrelediğinize göre, şimdi öncelikle ultrasantrifüj ile virüsü konsantre etme zamanıdır. Virüs içeren tüm tüpleri birbirine 0,2 gram mesafe kalacak şekilde dengelemek için serumsuz DMEM kullanın.Ardından, dengelenmiş santrifüj tüplerini SW 41 TI veya SW 28 rotor kovalarına yerleştirin. Rotor kovalarını sızdırmaz şekilde kapatın ve rotora sabitleyin. Daha sonra rotoru ultrasantrifüjün içine yerleştirin.Virüsü, SW 41 TI rotorda 25.000 RPM'de veya SW 28 rotorda 24.000 RPM'de, dört santigrat derecede yaklaşık 90 dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra doku kültürü kabinine geri dönün ve tüpü ters çevirerek SNAT'ı %10'luk çamaşır suyu içeren bir kaba boşaltın. Pelet etrafındaki fazla sıvıyı emmek için bir Kim wipe kullanın ve peleti yeniden süspanse etmeye hazır olana kadar tüpü uygun bir rafa, beş dakikayı geçmeyecek şekilde ters çevirerek yerleştirin.Viral peleti yeniden süspand etmek için, tüpünüze filtreli uç kullanarak 100 µL steril ön filtrelenmiş PBS ekleyin. Ardından, yaklaşık 20 kez pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın. Süspansiyonun tamamlanması için virüsü gece boyunca 4 °C'de bekletin.Viral preparatları dört derecede yaklaşık bir hafta, eksi 80 derecede ise bir yıla kadar saklayabilirsiniz. Atmadan önce tüm boş tüplerin %10'luk çamaşır suyu ile işlemden geçirildiğinden emin olun. Viral preparatı bir haftadan daha uzun süre kullanmayı planlıyorsanız, buzdolabında muhafaza edebilirsiniz.Gelecekteki deneyler için beş ila 20 µL'lik minimum alikotlar ve titrasyon dondurması için üç ila beş µL'lik bir alikot hazırlayın; alikotları yaklaşık -80 °C'de saklayın. Bir sonraki adım viral titrenin belirlenmesidir. Lentiviral plazmidinize floresan bir raporlayıcı gen eklediyseniz, enfekte hücreler floresans gösterecektir ve viral titre akış sitometrisi kullanılarak belirlenebilir.Başlamak için, 96 kuyucuklu bir plakanın tek bir sırasındaki bir ila altı numaralı kuyucuklara, üç mikrolitre konsantre virüsü 1,5 mililitre komple besi yerinde seyreltin. Altı kuyucuğun tamamına, 100 mikrolitre komple DM ile aşağıdaki seri seyreltmeleri uygulayın. İlk kuyucuğa virüs içermeyen 100 mikrolitre besi yerini ekleyin.Bu, boyanmamış kontrolünüzdür. İkinci kuyucuğa 100 µL seyreltilmiş virüs ekleyin. Üçüncü kuyucuğa da 100 µL ekleyin. İkinci kuyucuktaki karışımdan 100 µL'yi dördüncü kuyucuğa ekleyin.Üçüncü kuyucuktan beşinciye 100 µL ekleyeceğiz. Dördüncü kuyucuktan altıncıya 100 µL ekleyeceğiz. Beşinci kuyucuktan 100 µL ekleyeceğiz.Son olarak, altıncı kuyucuktan 100 µL alıp atın ve çamaşır suyuyla sterilize edin; tüm kuyucuklardaki toplam hacmi DMEM ile 200 µL'ye tamamlayın. Her seyreltmede, viral konsantrasyon yarıya iner. Bunların yalnızca önerilen seyreltmeler olduğunu ve çoğu konsantre virüsün titrasyonu için uygun sonuçlar vereceğini unutmayın.Virüs titreniz düşükse veya konsantre edilmemişse, dilüsyonlarınızı ayarlamanız gerekebilir. Kullanılmayan tüm dilüe virüsü, biyotehlike atık konteynerine atmadan önce 45 dakika boyunca %10'luk çamaşır suyu ile işleme tabi tutun. Altı kuyucuğun her birine yaklaşık 15.000 sağlıklı, aktif olarak bölünen 2 9 3 T hücresi ekleyin.16 viral preparatın titresini belirlemek için tek bir 96 kuyucuklu plaka kullanabilir, kuyucukları 200 microliters'e tamamlayabilir, hücreleri inkübatöre geri yerleştirebilir ve enfeksiyonun en az 48 saat boyunca ilerlemesine izin verebilirsiniz. İnkübasyonun ardından, hücre floresansını bir akış sitometresi kullanarak analiz edin. Eklenen virüsün mililitresi başına düşen enfeksiyöz viral partikül sayısını veya titreyi belirlemek için kuyucuk başına floresan hücre yüzdesini kullanabilirsiniz.Akış sitometre sonuçlarını yorumlarken mililitre başına düşen enfeksiyöz birim sayısını aşağıdaki formül ile hesaplayın. Doğru titrasyon hesaplamalarının yalnızca, enfekte hücrelerin hücre başına en fazla bir viral entegrasyon aldığı durumlarda yapılabileceğini unutmayın.Bunun sağlandığından emin olmak için, hesaplamalarda %15'ten düşük enfeksiyon oranına sahip hücreleri kullanın. Daha yüksek enfeksiyon oranına sahip hücrelerin, hücre başına birden fazla viral entegrasyon almış olması muhtemeldir. İkinci adımda önerilen dilüsyon, bu enfeksiyon aralığında birkaç örnek sağlamalıdır.İdeal olarak, nihai titreyi hesaplayabileceğiniz bir titrasyon grafiği oluşturmak için birkaç örnek kullanın. Viral titre, uydurulmuş doğrusal çizgiden elde edilen formülle hesaplanabilir; ancak gerekirse titre tek bir örnek kullanılarak da hesaplanabilir. Konsantre edilmemiş virüs için mililitrede 1×10⁷ transduksiyon birimi, konsantre virüs için ise mililitrede 1×10⁸ transduksiyon birimi titre beklenir.Bu prosedür uygulanırken lentivirüslerin nasıl üretileceğini size göstermiş olduk. Tüm biyogüvenlik düzenlemelerine uymak ve atıkları uygun şekilde bertaraf etmek önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lentiviral ifade vektörlerinin stably memeli hücreleri ve tüm organizma bölünmesi ve non-bölünmesi farklı efektör moleküller ya da reporter yapıları ifade etmek için en etkili araçlardır. Burada pseudoviral parçacıklar lentivector ifade yapıları paketlemek için ve pseudoviral parçacıkları kullanarak hedef hücreleri transdüksiyonu için nasıl bir protokol sağlar.

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

Bu protokolü biz üretim, saflaştırma ve lentiviral vektörlerin titrasyonu açıklar. Biz primer kültürlerinde nöronlar ve astrositlerde lentiviral vektör aracılıklı gen aktarımının bir örnek oluşturmaktadır. Bizim yöntemleri diğer hücre türleri için de geçerli...

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Burada, oligodendrosit öncü hücrelerini, merkezi sinir sistemi miyelinasyonunun in vitro modeli aracılığıyla oligodendrositlerdeki rollerini spesifik olarak sorgulamak amacıyla, ilgilenilen proteinleri aşırı eksprese etmek üzere viral olarak manipüle etmek için esnek ve stratejik bir temel sunan protokoller sunuyoruz.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için İn Vitro Myelinasyon Tahliller

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

İntegrase-eksik lentiviral vektörler (IDLVs) üretim stratejisinin CRISPR/Cas9 hücrelere teslim etmek için Araçlar açıklanmaktadır. Hücrelerde hızlı ve sağlam gen düzenleme arabuluculuk için bir yetenek ile IDLVs bir daha güvenli sunmak ve eşit derecede etkili vektör platformu'gen dır integrase yetkili vektörlerinin karşılaştırıldığında.

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Burada, lentiviral bir vektör perivitelline alanda bir döllenmiş yumurta, basit bir iğne ile transgene entegrasyon ve kurucusu transgenik fareler ile yüksek etkinlik üretimini teşvik için bir protokol mevcut.

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Periton dokusunda yerleşik makrofajlarda gen fonksiyonunun araştırılması için in vivo, lentiviral vektörler kullanılarak adım adım bir protokol gösteriyoruz.

Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Poliglutamin spinoserebellar ataksiler, CAG genişlemelerinin agregasyona yatkın proteinler üretmesiyle oluşur. Bu protokol, vektör üretimi, stereotaksik teslimat ve inklüzyonlar ile nöronal belirteç kaybının analizini tanımlar; böylece nörodejeneratif hastalıklar için mekanizmaları araştırmak ve hedefe yönelik tedavileri değerlendirmek için kontrollü bir platform sağlar.

Poliglutamin spinoserebellar ataksiyaların preklinik modeli olarak lentiviral indüksiyonlu striatal patoloji

Burada, sabit memeli hücrelerinde hücre tabanlı görselleştirme, hücre altı lokalizasyonu ve poli(ADP-riboz) (PAR) zenginleştirilmiş odakların nicel analizini tanımlıyoruz. Bu test, genotoksine maruz kalan hücrelerin çekirdeklerinde, baz eksizyon onarımı veya tek zincirli kırılma onarımı ile ilişkili DNA hasarı kaynaklı PARP aktivasyonunun noktalarının nicelendirilmesini sağlar.

Floresan Füzyon Protein Tabanlı Raporlayıcı Kullanılarak Genotoksin Kaynaklı PARP1/PARP2 Aktivasyonunun Hücrelerde Görselleştirmesi ve Nicel Analizi

Öğrenin, 293T hücrelerinde lentivirüs üretimi için transfeksiyon, süpernatant toplama ve ultrasantrifüj konsantrasyonu yöntemlerini. Bu protokol gen terapisi ve RNA interferans araştırmalarında güvenilir viral partikül elde edilmesini sağlar.

Lentivirüs Üretim

Daha fazla video keşfet